李培鑫 饒志堅 黃 虎

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心綜合外科，北京 100050；2.上海師范大學體育學院人體科學教研室，上海 200234； 3.東卡羅來納大學運動人體科學系、生理系、人體機能研究所 東卡羅來納糖尿病與肥胖研究所，美國北卡來納州 27834)

過去的十幾年里，全球已有超6.5億成人患有肥胖癥，而肥胖是2型糖尿病的重要危險因素，也是心血管疾病的決定因素，目前急需一種行之有效的治療方案[1-3]。袖狀胃切除術(sleeve gastrectomy，SG)操作簡便、減重效果明顯，并可緩解2型糖尿病，尤其腹腔鏡下SG，目前已成為應用最廣泛的代謝手術之一[1, 4]。但SG對于機體代謝改變的機制仍未明確。目前普遍認為SG通過降低ghrelin使機體代謝改變[4-6]。Ghrelin(胃促生長素，俗稱饑餓素)主要由胃底分泌，與下丘腦生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)結合，促進神經肽Y/刺鼠相關蛋白(neuropeptide Y/agouti-related protein，NPY/AgRP)神經元分泌NPY/AgRP，從而促進生長激素釋放、促進進食行為并導致肥胖[1, 7]。然而由于ghrelin作用的神經元位于下丘腦，無法直接進行人體實驗，動物實驗需通過電生理學進行[8]，又很難達到普及。細胞實驗相對容易操作，但目前缺乏適合操作的永生細胞系。本文旨在介紹一種可對ghrelin刺激產生反應的細胞系，并揭示ghrelin對AgRPmRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經元細胞系GT1-7細胞系，以及人肝癌細胞HepG2細胞系，均由美國東卡羅來納大學、東卡羅來納糖尿病與肥胖研究所惠贈。本研究利用的研究信息不含有使受試者的身份被直接識別或通過與其相關的識別物識別的信息，免除倫理審查。

1.2 主要試劑

試劑：達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸[trypsin-EDTA，0.05%(質量分數)]，購于美國Thermo Fisher Scientific公司。Ghrelin ，購于美國Cayman Chemical 公司。

普通細胞培養(yǎng)液按DMEM 445 mL、FBS 50 mL、P/S 5 mL進行混合[10%(體積分數)FBS、 1%(質量分數) P/S]配制；無血清細胞培養(yǎng)液(無FBS)按DMEM 495 mL、P/S 5 mL進行混合[1%(質量分數)P/S]配制。

細胞裂解液[cell lysis buffer(10×)]、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，購于美國Cell Signaling Technology 公司。BCA蛋白定量分析試劑盒、硝酸纖維膜(NC膜)(0.45 Micron，30 cm × 3.5 m/卷)，購于美國Thermo Fisher Scientific公司。蛋白質電泳膠板(4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel，18孔，30 μL/孔)，美國Bio-Rad Laboratories公司。一抗GHSR[GHS-R1 (E-7)， sc-374515]、二抗牛單克隆抗小鼠二抗耦聯(lián)辣根過氧化物酶(bovine anti-mouse IgG-HRP，sc-2371)，購于美國Santa Cruz公司。

總RNA抽提試劑(trizol)，購于美國Invitrogen公司；實時熒光定量 PCR 預混液(power SYBR green PCR master mix)，購于美國Applied Biosystems公司；反轉錄反應試劑[prime script RT master mix(RR036A)]，購于日本TAKARA公司。基因引物序列參考已發(fā)表文獻[1, 9-10]，詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequence

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將凍存的細胞在37 ℃水浴槽內復蘇，加入 DMEM(10% FBS、 1% P/S)，1 000 r/min離心5 min，超凈臺內棄除上清液，細胞沉淀加入新鮮普通細胞培養(yǎng)液，吹打致懸，轉移至100 mm無菌細胞培養(yǎng)皿內，放入37 ℃，5%(體積分數)二氧化碳培養(yǎng)箱。待細胞匯合度達80%～90%左右，進行傳代。棄除舊液，加入2 mL 0.05% trypsin-EDTA，待細胞消化適度，加入8 mL DMEM終止消化， 1 000 r/min離心5 min，棄除上清液，按1∶3傳代。傳代至第三代時進行相應實驗。

1.3.2 GT1-7細胞GHSR表達的檢測

從同期3個GT1-7細胞培養(yǎng)皿以及3個HepG2細胞培養(yǎng)皿內分別提取細胞蛋白，進行Western blotting。HepG2細胞為對照組。

1.3.3 血清饑餓對GT1-7細胞的影響

將細胞轉移至6孔無菌細胞培養(yǎng)板，傳代方式同上，每100 mm培養(yǎng)皿加入12 mL DMEM制造細胞懸液，每孔2 mL細胞懸液。待細胞匯合度達70%～80%左右，棄除舊的DMEM。其中3孔加入含FBS培養(yǎng)液，為含FBS組；另外3孔加入無FBS培養(yǎng)液(僅1% P/S)，為不含FBS組。放入培養(yǎng)箱12 h后，提取cDNA，進行RT-qPCR，檢驗兩組間mRNA表達量差異。

1.3.4 不同時間ghrelin刺激對含FBS培養(yǎng)液的GT1-7細胞的影響

將細胞轉移至6孔無菌細胞培養(yǎng)板，共2板，傳代方式同上。待細胞匯合度達70%～80%左右，棄除舊的DMEM。3孔加入含FBS培養(yǎng)液，為空白對照組；另取一板，3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培養(yǎng)液，為3 h組，放入培養(yǎng)箱內； 2 h后將上述培養(yǎng)板的另外3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培養(yǎng)液，為1 h組，放入培養(yǎng)箱內； 1 h后提取cDNA，進行RT-qPCR，檢驗3組間mRNA表達量差異。

1.3.5 不同濃度ghrelin刺激對含FBS培養(yǎng)液的GT1-7細胞的影響

將細胞轉移至6孔無菌細胞培養(yǎng)板，共2板，傳代方式同上。待細胞匯合度達70%～80%左右，棄除舊的DMEM。3孔加入普通培養(yǎng)液，為空白對照組；3孔加入含100 nmol/L ghrelin的含FBS培養(yǎng)液，為100 nmol/L組；3孔加入含50 nmol/L ghrelin的含FBS培養(yǎng)液，為50 nmol/L組；3孔加入含10 nmol/L ghrelin的含FBS培養(yǎng)液，為10 nmol/L組。放入培養(yǎng)箱3 h后，提取cDNA，進行RT-qPCR，檢驗4組間mRNA表達量差異。

1.3.6 Western blotting操作步驟[1, 8]

棄除DMEM，細胞裂解液加入PMSF置入培養(yǎng)皿后刮取細胞，按標準步驟提取蛋白后，應用BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，隨后應用4%～20% CriterionTMTris-HCl Protein Gel進行電泳，后電轉至NC膜，三羥甲基氨基甲烷聚山梨醇酯20緩沖液(tris-buffered saline with Tween-20，TBS-T)配制的5%(質量分數)脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(無抗體，或GHS-R1(E-7)1∶1 000，或GHS-R1(E-7) 1∶500)4 ℃過夜，二抗(bovine anti-mouse IgG-HRP，1∶2 000)室溫孵育2 h。以上各步之間應用TBS-T洗膜。應用電化學發(fā)光法顯影，Bio-Rad ChemiDoc Touch影像系統(tǒng)曝光、顯影、攝像。

1.3.7 RT-qPCR操作步驟[1, 8]

棄除DMEM，加入TRIzol后刮取細胞，提取總RNA后，應用全功能酶標儀Synergy H1測量RNA純度(260/280比值在1.8～2.0之間者采用)及濃度。應用Prime Script RT Master Mix(RR036A)合成cDNA。應用Power SYBR Green PCR Master Mix配制反應液(3倍復孔)，應用Applied Biosystems ViiA 7 system進行RT-qPCR，并測量mRNA相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 GT1-7細胞可以表達GHSR

經Western blotting檢測，GT1-7細胞可表達GHSR，而HepG2細胞不表達GHSR，詳見圖1。

圖1 GT1-7細胞表達GHSRFig.1 GT1-7 cells express GHSRGHSR: growth hormone secretagogue receptor.

2.2 血清饑餓對GT1-7細胞表達AgRP mRNA的影響

經RT-qPCR多次檢測，GT1-7細胞無NPY mRNA的表達，但可表達AgRPmRNA。血清饑餓可以影響AgRPmRNA的表達量，含FBS組：1.00±0.14，不含FBS組：3.45±0.16，兩組間AgRPmRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(t=- 11.649，P=0.000)，詳見圖2。血清饑餓使GT1-7細胞顯著增加了AgRPmRNA的表達。

圖2 血清饑餓對AgRP mRNA表達的影響Fig.2 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells by serum starvation

2.3 不同時間ghrelin刺激對含FBS培養(yǎng)液的GT1-7細胞表達AgRP mRNA的影響

在含FBS(飽食)狀態(tài)下，不同時間ghrelin刺激對AgRPmRNA的表達量不同，空白對照組：1.00±0.08， 1 h組：1.18±0.43，3 h組：1.75±0.16。3 h組分別與空白對照組及1 h組AgRPmRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(與空白對照組比較：LSD-t=5.03，P=0.002，與1 h組比較：LSD-t=3.86，P=0.008)，而1 h組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(LSD-t=1.18，P=0.284)，詳見圖3。即使在含FBS(飽食)狀態(tài)下，ghrelin刺激3 h后可使GT1-7細胞顯著增加AgRPmRNA的表達。

2.4 不同濃度ghrelin刺激對含FBS培養(yǎng)液的GT1-7細胞表達AgRP mRNA的影響

在含FBS(飽食)狀態(tài)下， ghrelin刺激3 h后，不同濃度對AgRPmRNA的表達量影響不同，空白對照組：1.00±0.07，10 nmol/L組：1.32±0.11，50 nmol/L組：1.30±0.09，100 nmol/L組：1.66±0.04。應用不同濃度ghrelin處理的各組與空白對照組中AgRPmRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(與10 nmol/L組比較：LSD-t=2.71，P=0.027；與50 nmol/L組比較：LSD-t=2.54，P=0.035；與100 nmol/L組比較：LSD-t=5.57，P=0.001)，高濃度ghrelin組(100 nmol/L)與低濃度ghrelin組(10 nmol/L組及50 nmol/L組)AgRPmRNA相對表達量差異均存在統(tǒng)計學意義(與10 nmol/L組比較：LSD-t=2.86，P=0.021；與50 nmol/L組比較：LSD-t=3.03，P=0.016)，10 nmol/L組及50 nmol/L組之間AgRPmRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(LSD-t=0.17，P=0.868)，詳見圖4。即使在含FBS(飽食)狀態(tài)下，ghrelin刺激3 h后，AgRPmRNA的表達量仍顯著增加，但是低濃度ghrelin顯著低于高濃度ghrelin增加的AgRPmRNA表達量。

圖3 不同時間100 nmol/L ghrelin刺激對AgRP mRNA 表達的影響Fig.3 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin (100 nmol/L) stimulation at different time duration

圖4 不同濃度ghrelin刺激3 h對AgRP mRNA表達的影響Fig.4 Influence of AgRP mRNA expression on GT1-7 cells in non-serum-starvation medium by ghrelin stimulation at different concentration

3 討論

Ghrelin是由28個氨基酸組成的肽類激素，主要由胃底分泌[11]，又稱胃促生長素，可以與GHSR結合，控制生長激素的釋放，促進食欲并維持能量守恒。在人類的進化過程中，其最重要的生理功能是保護機體避免因饑餓導致低血糖[7, 11-12]。在饑餓和能量不足時，下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)的神經元在ghrelin等激素的刺激下，通過AgRP/NPY、γ-氨基丁酸等作用于室旁核從而促進攝食[13]。GHSR主要分布于ARC內的促進食欲的表達AgRP/NPY的神經元內，AgRP/NPY主要產生促進進食、減少能量消耗的作用，而且AgRP/NPY負責了ghrelin絕大部分在攝食和代謝方面的作用[14]。肥胖、糖尿病、高血壓、不孕癥等均與表達AgRP/NPY的神經元的過度活躍有關[3, 15]。除了機械性限制食物攝入之外，目前比較公認的SG改善代謝的機制就是通過切除胃底，減少ghrelin分泌，進而限制ARC分泌AgRP/NPY，從而減少食欲、增加能量消耗。為了全面了解肥胖癥等代謝疾病以及代謝手術的作用機制，充分研究下丘腦神經元的細胞及分子機制是非常有必要的[16]。但是挑選合適的研究對象則是一個困難的選擇。

Ghrelin作用的靶點神經元位于下丘腦，臨床研究很難取得人體下丘腦標本，故無法進行相關實驗。動物實驗雖有進行，但要么為間接實驗，要么需相關專業(yè)設備或操作極其困難。Kawasaki等[17]對大鼠行SG，應用RT-qPCR測量下丘腦中NPYmRNA表達量，間接說明下丘腦神經元變化；Li等[1]對NPY-綠色熒光蛋白(neuropeptide Y-green fluorescent protein，NPY-GFP)小鼠行SG，應用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)直接觀察下丘腦神經元變化。以上兩項研究通過測量循環(huán)ghrelin，與其他結果一起分析，證實SG術后ghrelin減少，并影響下丘腦神經元活動，但均為間接實驗。Laing等[8]處死小鼠后，立即切取下丘腦冰凍切片，應用LSCM直接觀察下丘腦神經元，給予包括ghrelin在內的各種刺激，進行電生理學實驗。該實驗為直接實驗，但要求小鼠年齡為6周內，故無法研究SG機制，僅可用來研究ghrelin對下丘腦神經元的影響；而Perez-Tilve等[18]通過側腦室注射ghrelin，直接觀察ghrelin對下丘腦神經元的影響。以上兩項研究，對研究者的技術要求極高，很難達到普及。

而細胞實驗相對容易操作，近年來各種基因組編輯工具，如常間回文重復序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術，使細胞實驗可以進行更多的研究。有關ghrelin與神經元細胞之間的機制研究就可應用細胞實驗完成。雖然通過神經元原代培養(yǎng)可以進行研究，但由于下丘腦神經元眾多，難以實際操作。本文采用的下丘腦永生細胞系GT1-7細胞，培養(yǎng)簡單，是由小鼠下丘腦分離獲得的，具有高度分化的神經內分泌細胞典型特征，目前廣泛應用于生殖調控的研究中[19-20]。筆者首先通過Western blotting證明GT1-7細胞具有GHSR ，可對ghrelin產生反應。進而通過RT-qPCR證實該細胞可以表達AgRPmRNA，故GT1-7細胞可應用于ghrelin對下丘腦NPY/AgRP神經元影響的相關研究。

筆者發(fā)現，如果去除培養(yǎng)液中的血清，也就是模擬饑餓狀態(tài)下，細胞就會增加AgRPmRNA的表達量，這與其他動物實驗或人體實驗結果相符[17]，提示機體在饑餓狀態(tài)下增加AgRP而避免低血糖。另外，筆者發(fā)現，即使在含FBS培養(yǎng)液中，也就是模擬飽食的狀態(tài)下，ghrelin依然可以刺激AgRPmRNA的表達，但是ghrelin在飽食狀態(tài)下需要3 h的刺激才可以引起AgRPmRNA的表達升高，為時間依賴。同時，筆者發(fā)現隨著ghrelin濃度的升高，AgRPmRNA的表達量亦隨之升高，也就是說AgRPmRNA的表達是受ghrelin濃度影響的，ghrelin濃度越高，AgRPmRNA的表達量越高，反之，如果減少ghrelin的分泌，AgRPmRNA的表達量也會減少，進而AgRP的促進進食、減少能量消耗的作用就會減少，以至于出現食欲下降，能量消耗增加。許多研究觀察到SG術后患者的血清ghrelin水平下降[4-5, 21]，結合筆者的細胞實驗結果發(fā)現，SG切除了患者包括胃底在內的80%的胃組織，從而減少了ghrelin的分泌，隨著血清ghrelin濃度的降低，下丘腦表達AgRP/NPY的神經元的活性隨之減弱，分泌的AgRP/NPY減少，最終導致患者食欲下降、能量消耗增加。而食欲下降、能量消耗增加，則可以導致包括體質量下降、血糖穩(wěn)定等在內的代謝改善。

ARC內控制進食、調節(jié)平衡代謝的神經元還有很多，如表達阿片-促黑素細胞皮質素原(proopiomelanocortin，POMC)的神經元以及表達酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的多巴胺能神經元。Li等[1]發(fā)現，SG術后可導致下丘腦弓狀核區(qū)表達TH的神經元數量減少、表達POMC的神經元數量增加，所以未來可應用GT1-7細胞進行關于TH及POMC相關的研究。Ge等[7]發(fā)現由小腸或肝臟分泌的肝表達抑菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2，LEAP2)可以非競爭性拮抗GHSR與ghrelin結合，從而使機體減少進食。除此之外， LEAP2還具有抑制ghrelin分泌的功能，從而進一步減少機體的食物攝取。正常情況下，LEAP2幾乎不在正常的胃組織內分泌，但是SG術后殘胃中的LEAP2的分泌量卻顯著增加。Li等[1]發(fā)現SG術后，小鼠肝臟中LEAP2 mRNA的表達量升高。綜上所述，LEAP2的分泌增加，也有可能是SG產生其相應的代謝效應的原因之一。在將來的研究中，可以利用GT1-7細胞進一步研究LEAP2，ghrelin與下丘腦調節(jié)代謝平衡的神經元之間的關系。

Klotho蛋白因其抗衰老的作用最早被學者認識。Klotho與成纖維生長因子(fibroblast growth factor，FGF)23共同作用，并與FGF受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)形成受體復合物產生抗衰老作用。隨著對其研究深入，尤其是α-Klotho亞型，具有抗炎、抗氧化應激和調控離子通道等多種生物學功能，目前在腎損害[22]、腎移植[23]、心臟損害[24]、阿爾茨海默病[25]等方面廣泛研究，而筆者所在團隊則將Klotho引入肥胖及2型糖尿病等代謝疾病的研究。通過側腦室注射α-Klotho發(fā)現α-Klotho通過FGFR增加了POMC神經元活性、抑制 NPY/AgRP神經元活性，并減少了AgRPmRNA表達。但側腦室導管的置入手術、側腦室注射、甚至小鼠在置入側腦室導管后的活動均可能造成部分小鼠的死亡，最終導致將α-Klotho的長期效果研究改為短期效果研究[26]。而筆者的另一項研究[27]則通過應用GT1-7細胞系發(fā)現α-Klotho通過磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-related kinases，ERK)下調了AgRPmRNA的表達，而FGFR1的抑制劑則可抑制該過程。所以，未來可應用GT1-7細胞系進行更多的下丘腦相關神經元通過α-Klotho調節(jié)代謝的研究，尤其是信號通路研究。

基于以上研究，本團隊發(fā)現血清饑餓使GT1-7細胞增加AgRPmRNA表達，ghrelin即使在飽食狀態(tài)下也可以刺激GT1-7細胞增加AgRPmRNA表達，并且為時間及濃度依賴。因此，GT1-7細胞可作為研究下丘腦神經元對AgRP調控，以及下丘腦神經元對其他代謝功能的調節(jié)，尤其是其背后分子機制研究的體外模型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李培鑫：提出研究思路，設計研究方案，操作實驗，統(tǒng)計數據，撰寫論文；饒志堅：把關實驗操作的準確性，復審統(tǒng)計結果；黃虎：總體把關，確保研究方案可行性，審定論文。