歐陽(yáng)碧云，王俊程，趙秀蘭

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012）

超重和肥胖是心血管疾病、高血壓和糖尿病等多種慢性疾病的重要誘因，特別是肥胖現(xiàn)已成為廣受關(guān)注的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。超重和肥胖為體內(nèi)異常的脂肪累積，是由能量攝入與消耗失衡導(dǎo)致的。近年來(lái)研究表明，肥胖的發(fā)生亦與環(huán)境污染密切相關(guān)，許多環(huán)境污染物能夠通過(guò)多種途徑導(dǎo)致能量失衡[3]。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）廣泛用于生產(chǎn)食品包裝材料、化妝品、醫(yī)療用品、建筑材料和兒童玩具，是目前使用量最大的增塑劑。人群流行病調(diào)查資料顯示，DEHP暴露與胰島素抵抗和肥胖代謝綜合征相關(guān)[4]。本課題組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，DEHP能夠增加C57小鼠體重，并伴隨C57小鼠皮下脂肪組織分解降低[5-6]。3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（前脂肪細(xì)胞）具有分化為脂肪細(xì)胞的潛能，是目前研究脂肪細(xì)胞分化的常用模型[7]。本研究觀察DEHP對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化和脂肪分解影響，進(jìn)一步探討DEHP對(duì)脂質(zhì)代謝的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DEHP、油紅O、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、3-異丁-1-甲黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松和胰島素，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素，美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶，美國(guó)Hyclone公司；甘油三酯（triglycerides，TG）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，美國(guó)Pierce Biotechnology公司；兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶A（phosphorylated protein kinase A，p-PKA）底物、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）、Ser563位點(diǎn)磷酸化HSL（p-HSL Ser563）和p-HSL Ser660多克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）和脂肪TG脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）單克隆抗體及Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，美國(guó)Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Olympus BX 43正置顯微鏡，日本Olympus有限公司；EVOS FL熒光顯微鏡，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Infinite?M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)和DEHP處理

3T3-L1前脂肪細(xì)胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，采用雞尾酒誘導(dǎo)法誘導(dǎo)成脂分化，即依次給予誘導(dǎo)液A（IBMX 0.5 mol·L-1、地塞米松 2.5 mmol·L-1和胰島素2 mg·L-1）和誘導(dǎo)液B（胰島素2 mg·L-1）分別誘導(dǎo)3和4 d，其后更換含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d（第10天）。誘導(dǎo)液A和誘導(dǎo)液B加入的同時(shí)給予DEHP暴露，DEHP終濃度分別為0（細(xì)胞對(duì)照組），3.125，6.25，12.5，25和50 μmol·L-1。DEHP采用DMSO溶解，細(xì)胞對(duì)照組給予等體積DMSO（終濃度為0.5%），各組設(shè)6復(fù)孔。誘導(dǎo)分化過(guò)程中，每天采用顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴大小和數(shù)量的變化。

1.3 油紅O染色檢測(cè)誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞中脂滴形成

按1.2處理細(xì)胞，于第10天采用油紅O對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂肪進(jìn)行染色。細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定、蒸餾水洗滌和60%異丙醇潤(rùn)洗后，油紅O室溫避光染色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察脂滴的大小和數(shù)量，細(xì)胞內(nèi)油紅O著色部分即為脂滴。

1.4 成脂分化細(xì)胞外TG水平和細(xì)胞內(nèi)脂肪含量檢測(cè)

按1.2處理細(xì)胞，于第10天取細(xì)胞培養(yǎng)液，用TG試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液即細(xì)胞外中TG水平。TG水平（mmol·L-1）=（樣本A546nm-空白A546nm）/（校準(zhǔn)A546nm-空白A546nm）×校準(zhǔn)品濃度（mmol·L-1）。收集細(xì)胞，進(jìn)行油紅O染色。染色后先用PBS洗滌，隨后加異丙醇2 mL洗脫細(xì)胞脂肪染色，于562 nm處檢測(cè)洗脫液吸光度（A562nm）值。A562nm值表示細(xì)胞內(nèi)脂肪含量。

1.5 Western印跡法檢測(cè)成脂分化細(xì)胞中脂肪分解相關(guān)蛋白的表達(dá)

按1.2處理細(xì)胞，于第10天棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌后加入RIPA蛋白裂解液，冰浴中裂解30 min；4℃，12 000×g離心10 min，取上清，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量并定量，隨后加入等體積上樣緩沖液，置金屬浴中變性10 min。取20 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜后，分別加入抗p-PKA底物、HSL、p-HSL Ser563、p-HSL Ser660、UCP1和ATGL單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶5000）室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液后感光X膠片，Image J軟件進(jìn)行積分吸光度分析。GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞中UCP1表達(dá)

按1.2處理細(xì)胞，于第10天經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，加入0.5%Triton X-100通透20 min；PBS洗滌，加山羊血清室溫封閉30 min；加入兔抗小鼠UCP1單克隆抗體（1∶500）4℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶5000），室溫避光孵育1 h；含DAPI防熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞即為UCP1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，采用Image J計(jì)數(shù)該細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS20.0軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用LSD（方差齊）或Dunnett'sT3（方差不齊）分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEHP對(duì)3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞脂滴形成的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)脂肪分化第5天，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)小脂滴，細(xì)胞對(duì)照組無(wú)脂肪滴出現(xiàn)（圖1A）。誘導(dǎo)分化第6天，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量與細(xì)胞對(duì)照組相比明顯增多（圖1B）；第10天，與細(xì)胞對(duì)照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組油紅O著色細(xì)胞增多，其中DEHP 12.5，25和50 μmol·L-1組脂滴數(shù)量增加較為明顯，DEHP 50 μmol·L-1組細(xì)胞中可觀察到含有較大脂滴和“指環(huán)”樣脂肪細(xì)胞（圖1C）。

Fig.1 Effect of diethylhexyl phthalate（DEHP）on formation of lipid drops in induced adipogenic differentiated 3T3-L1 cells（200×）.The adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes were induced by differentiation medium A（3-isobutyl-1-methylxanthine 0.5 mol·L-1，dexamethasone 2.5 mmol·L-1and insulin 2 mg·L-1）for 3 d，and differentiation medium B（insulin 2 mg·L-1）for 4 d followed by continuous culture for 3 d（the 10thday），which was simultaneous combined with DEHP 3.125-50 μmol·L-1treatment.A：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 5thday of induced differentiation；B：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 6thday of induced differentiation；C：morphology of 3T3-L1 differentiated adipocytes on the 10thday by oil red O staining.Arrows show the lipid droplets.

2.2 DEHP對(duì)3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞外TG水平和細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化后細(xì)胞外TG水平和細(xì)胞內(nèi)脂肪含量均明顯增加（P＜0.01），其中DEHP 12.5 μmol·L-1組增加更為明顯（圖2），提示DEHP處理可明顯增加3T3-L1成脂誘導(dǎo)分化。

Fig.2 Effect of DEHP on extracellular triglycerides（TG）level（A）and intracellular fat content（B）in induced adipogenic differentiated 3T3-L1 cells.See Fig.1 for the cell treatment.On the 10thday of induction，the TG level of culture medium was detected by TG assay kit and the cells were stained with oil red O.The stained cells were washed by PBS and eluted with 2 mL isopropanol，then the A562 nmof the elution was detected by spectrophotometry.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 DEHP對(duì)3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞脂肪分解通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比，DEHP 12.5～50 μmol·L-1組細(xì)胞中ATGL蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），DEHP 3.125～50 μmol·L-1組p-PKA底物蛋白水平亦明顯下降（P＜0.01）（圖3）；DEHP 3.125～50 μmol·L-1組p-HSL Ser563和p-HSL Ser660蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），總HSL蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（圖4）。

Fig.3 Effect of DEHP on protein expressions of phosphorylated protein kinase A（p-PKA）substrate and adipose triglyceride lipase（ATGL）in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.4 Effect of DEHP on protein expressions of hormonesensitive triglyceride（HSL），phosphorylated HSL at Ser563（p-HSL Ser563）and p-HSL Ser660 in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 DEHP對(duì)3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞UCP1表達(dá)的影響

Western印跡法結(jié)果（圖5A）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組細(xì)胞中UCP1蛋白表達(dá)水平隨DEHP濃度增加明顯降低（P＜0.01）。免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果（圖5B）與上述結(jié)果變化趨勢(shì)相似，DEHP 3.125～50 μmol·L-1組UCP1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞對(duì)照組相比亦明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of DEHP on protein expression of uncoupling protein 1（UCP1）in 3T3-L1 differentiated adipocytes by Western blotting and immunofluorescence assay.See Fig.1 for the cell treatment.A：the expression of UCP1 protein；B：the number of UCP1 positive cells，the arrows show the UCP1 positive cells（200×）；A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

塑料污染已引起全球關(guān)注。作為使用最為廣泛的塑料添加劑，DEHP的健康效應(yīng)引起廣泛關(guān)注[8]。人群調(diào)查資料和動(dòng)物研究顯示，DEHP與肥胖密切相關(guān)，但確切的作用機(jī)制尚不明確[9-10]。脂肪細(xì)胞分化是肥胖發(fā)生發(fā)展的早期關(guān)鍵事件。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是研究脂肪代謝紊亂最常用的細(xì)胞模型之一，通常采用誘導(dǎo)劑促進(jìn)其分化為成熟脂肪細(xì)胞。Hao等[11]已報(bào)道，對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞采用單純胰島素誘導(dǎo)成脂分化的同時(shí)給予DEHP暴露，未觀察到DEHP對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂肪分化具有明顯促進(jìn)作用。本研究采用經(jīng)典雞尾酒法，即序貫加入IBMX、地塞米松和胰島素組成的A液和含胰島素B液進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，同時(shí)給予DEHP暴露。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，DEHP可使3T3-L1前脂肪細(xì)胞中脂滴出現(xiàn)更早，脂滴體積和數(shù)量也明顯增加。對(duì)細(xì)胞內(nèi)油紅O著色的脂肪滴洗脫液脂肪含量和培養(yǎng)液中TG水平檢測(cè)結(jié)果表明，DEHP可明顯增加3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化后細(xì)胞內(nèi)脂肪含量和細(xì)胞外TG水平。已知DEHP進(jìn)入體內(nèi)后可代謝為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）的激活劑[12]，PPARγ是脂肪分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。本課題組采用PPARγ過(guò)表達(dá)的NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞研究表明，與野生型NIH-3T3細(xì)胞相比，DEHP和MEHP均能明顯促進(jìn)PPARγ過(guò)表達(dá)細(xì)胞中脂滴形成，且MEHP的促進(jìn)作用更強(qiáng)（待發(fā)表）。故推測(cè)DEHP對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的促進(jìn)作用可能部分由于其在細(xì)胞內(nèi)代謝形成MEHP并激活PPARγ所致。

脂肪細(xì)胞以TG的形式儲(chǔ)存剩余能量，TG的分解與合成是生物體脂肪積累的重要調(diào)節(jié)因素。通常TG分解需經(jīng)ATGL、活化的HSL和甘油單酯脂肪酶共同完成。ATGL首先將TG水解為甘油二酯和游離脂肪酸，甘油二酯隨后可活化HSL水解生成甘油單酯和游離脂肪酸，甘油單酯繼續(xù)在甘油單酯脂肪酶的作用下水解為甘油和游離脂肪酸。HSL的激活需在活性PKA作用下將563位點(diǎn)和660位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，組織中PKA活性一般由磷酸化PKA底物的水平表示[14]。通常刺激因素作用于脂肪細(xì)胞表面腎上腺素受體，激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸活化酶，升高環(huán)磷酸腺苷水平，導(dǎo)致PKA活化，磷酸化激活HSL，參與甘油二酯水解[15]。本研究結(jié)果顯示，DEHP降低了ATGL的表達(dá)，同時(shí)觀察到DEHP處理后細(xì)胞中PKA的活性也明顯降低，伴隨HSL660和563位點(diǎn)絲氨酸磷酸化水平的明顯下降，提示DEHP抑制了HSL的激活。Ellero-Simatos等[16]對(duì)人源皮下前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化11 d，在成脂分化率達(dá)70%時(shí)加入 MEHP100 μmol·L-1作用48 h。結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯升高；但作用24 h時(shí)成脂分化和脂肪分解相關(guān)基因ATGL和HSL表達(dá)均上調(diào)。另有研究報(bào)道，3T3-L1首先給予DEHP暴露2 d，其后再常規(guī)誘導(dǎo)成脂分化，至第8天誘導(dǎo)完成時(shí)，細(xì)胞增殖明顯提高，但細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低[17]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果不一致，可能與DEHP作用時(shí)間和作用方式不同所致。

UCP1是棕色脂肪組織線粒體中特異表達(dá)的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)，該蛋白解偶聯(lián)呼吸鏈、進(jìn)而產(chǎn)熱，能減少體內(nèi)脂肪累積。研究顯示，白色脂肪細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化能增加全身能量消耗，并減少體內(nèi)脂肪，該作用與UCP1表達(dá)密切相關(guān)[18]。本研究用Western印跡法和免疫熒光法檢測(cè)3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞中UCP1表達(dá)水平。結(jié)果均顯示，DEHP明顯降低3T3-L1誘導(dǎo)成脂分化細(xì)胞內(nèi)UCP1蛋白的表達(dá)，提示DEHP處理細(xì)胞脂肪含量增加也可能與UCP1表達(dá)降低相關(guān)。本課題組先前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄性C57小鼠經(jīng)灌胃分別給予DEHP 0.05 mg·kg-1（環(huán)境相關(guān)劑量）和500 mg·kg-1（導(dǎo)致明顯生殖功能損傷劑量）連續(xù)13周，小鼠脂肪組織中UCP1、p-PKA底物、HSL及p-HSL Ser563和p-HSL Ser660蛋白表達(dá)水平均明顯降低[6]，與本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

考慮到無(wú)誘導(dǎo)劑時(shí)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂能力低且成脂分化率不穩(wěn)定，本研究未觀察DEHP對(duì)非誘導(dǎo)細(xì)胞的成脂促進(jìn)作用。同時(shí)，在DEHP＞12.5 μmol·L-1時(shí)，也未觀察到細(xì)胞外TG水平和細(xì)胞內(nèi)脂肪含量具有明顯的濃度依賴(lài)性。高濃度DEHP作用下，成脂分化細(xì)胞中脂滴較大但易脫落，推測(cè)該現(xiàn)象可能是高濃度時(shí)細(xì)胞內(nèi)外脂肪含量無(wú)明顯增加的原因之一。

綜上，本研究結(jié)果表明，DEHP促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂分化，并抑制脂肪分化細(xì)胞的脂肪分解，提示DEHP可能是促進(jìn)肥胖發(fā)生的潛在危險(xiǎn)因素，具體分子機(jī)制待深入探討。