曹路路，吳書勝，閆 瀅，柯麗紅，羅會芹，陳文菊，胡小秀，李慧敏，牛佳郁，李夢鴿，徐惠君，何義富

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)報道，2020年全世界結(jié)直腸癌(CRC)新發(fā)病例約193萬例，死亡約93.5萬例[1]。盡管CRC的治療方法在不斷改善，但CRC患者的5年生存率仍然很低[2-4]。CRC預(yù)后不佳的最關(guān)鍵原因之一是缺乏有效的早期診斷方法[5-6]。大多數(shù)患者確診時已屬晚期，無法進(jìn)行根治性手術(shù)。有明確的證據(jù)表明，篩查可將CRC發(fā)病率和病死率降低30%～60%[7]。此外，盡管手術(shù)技術(shù)不斷進(jìn)步成熟，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍然是臨床的難點，因此,尋找能提高診斷率、指導(dǎo)預(yù)后的分子靶標(biāo)是研究熱點。

多形性腺瘤基因1(PLAG1)位于人類染色體8q12，屬于多形性腺瘤(PLA)基因家族成員之一，大小為7313 bp，包含5個外顯子，4個內(nèi)顯子，編碼序列為481～1983 nt。PLAG1編碼一種具有2個假定的核定位信號的鋅指蛋白，由501個氨基酸組成[8]。PLAG1相關(guān)基因本體注釋包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和轉(zhuǎn)錄激活因子活性。既往研究表明，PLAG1過表達(dá)在軟組織腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用[9-10]。近年來，越來越多的研究表明PLAG1是一種促癌因子，如PLAG1為肝細(xì)胞肝癌的獨立預(yù)后因素[11]、PLAG1的敲低能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及增加卵巢癌細(xì)胞化療敏感性[12]。然而，在不同腫瘤中PLAG1的作用也不完全相同[13]。PLAG1被認(rèn)為與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲密切相關(guān)。然而，PLAG1在CRC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中的作用仍然不明確。鑒于該領(lǐng)域缺乏足夠的研究，我們的研究通過免疫組織化學(xué)檢測80例CRC患者癌組織和相應(yīng)癌旁組織中PLAG1的表達(dá)情況，并分析了PLAG1的表達(dá)與CRC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1臨床資料和組織標(biāo)本 收集2014年1月—2017年3月中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū) 安徽省腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)切除的CRC患者石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，癌組織和配對癌旁組織(距癌組織≥5 cm)各80例。納入標(biāo)準(zhǔn):均接受根治性手術(shù)治療，術(shù)前無抗腫瘤治療史，且組織病理學(xué)檢查證實為結(jié)直腸腺癌;年齡≥18歲;病例資料完整：包括完整的臨床病理數(shù)據(jù)，如年齡、性別、腫瘤分期和分化程度。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重的心肝腎功能異常;合并其他部位腫瘤;家族性腺瘤性息肉病或Lynch綜合征。根據(jù)AJCC第八版進(jìn)行術(shù)后病理分期。根據(jù)NCCN指南行術(shù)后輔助治療。采用電話或門診復(fù)查隨訪獲得生存資料，隨訪截止時間為2022年1月1日，最終獲得60例的隨訪資料。此外，總生存期(OS)定義為手術(shù)日期至死亡的時間。無病生存時間(DFS)定義為手術(shù)日期至首次明確診斷腫瘤復(fù)發(fā)或死亡之間的時間。本研究獲得了中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū) 安徽省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)同意。

1.2免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋的標(biāo)本切成4 μm厚的切片，將病理切片置于60 ℃的組織干燥箱中60 min。然后切片用二甲苯脫蠟并依次通過梯度乙醇水化，將載玻片在0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中于100 ℃蒸煮20 min，然后從熱源中取出并在緩沖溶液中于室溫冷卻以進(jìn)行抗原修復(fù)。切片與0.3%過氧化氫一起孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將組織載玻片與兔抗人PLAG1多克隆抗體以1∶200的稀釋度在4 ℃下孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。并與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(中杉金橋生物技術(shù)，北京，中國)孵育30 min。使用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，在梯度乙醇中脫水并用中性膠密封。PLAG1表達(dá)的免疫反應(yīng)強度由2名病理科醫(yī)師獨立評估。我們使用既往文獻(xiàn)發(fā)表的方法來評估PLAG1的半定量表達(dá)，公式如下：免疫反應(yīng)性評分=染色強度評分×陽性細(xì)胞評分的比例。染色強度評分定義為0分(陰性)、1分(弱強度)、2分(中等強度)和3分(強強度)。陽性細(xì)胞評分比例定義為0分(無染色)、1分(<25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)和4分(≥75%)。切片免疫反應(yīng)評分≥6分定義為高表達(dá)，否則定義為低表達(dá)。

1.3生存預(yù)后分析 使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(www.gepia2.cancer-pku.cn)分析PLAG1表達(dá)與CRC患者OS和DFS間的相關(guān)性。操作步驟:輸入基因名稱PLAG1，點擊生存分析頁面，選擇OS/DFS;選擇腫瘤類型CRC(同時選取COAD和READ);點擊plot可視化分析。GEPIA2使用Log-rank法進(jìn)行假設(shè)檢驗。上述線上數(shù)據(jù)庫檢索分析時間截至2022年4月27日。將最終獲得隨訪資料的60例CRC根據(jù)免疫組織化學(xué)PLAG1表達(dá)水平評分高低分為2組，使用SPSS 22.0作生存分析并繪制Kaplan-Meier生存曲線。并且將60例CRC的生存信息通過單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析CRC預(yù)后相關(guān)的危險因素。

1.4基因集富集分析 使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/admin.php)LinkInterpreter模塊進(jìn)行PLAG1 KEGG聚類分析。具體操作步驟，腫瘤類型:選擇CRC;數(shù)據(jù)類型:選擇RNAseq;數(shù)據(jù)屬性:選擇PLAG1;靶數(shù)據(jù)類型:選擇RNAseq;統(tǒng)計學(xué)方法:選擇Spearman相關(guān)性分析;導(dǎo)出數(shù)據(jù):導(dǎo)出CRC中與PLAG1表達(dá)顯著相關(guān)的前1000位基因;分析:使用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行KEGG聚類分析。

1.5觀察指標(biāo) ①PLAG1在癌組織和配對癌旁組織中的表達(dá)情況；②PLAG1表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系；③PLAG1表達(dá)與CRC患者預(yù)后；④PLAG1在CRC發(fā)生發(fā)展中可能涉及的分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1PLAG1在CRC組織中表達(dá)上調(diào) 本組80例癌組織和對應(yīng)癌旁組織免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PLAG1的陽性表達(dá)主要見于CRC組織細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。CRC組織中PLAG1陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

圖1 PLAG1在癌旁組織陰性表達(dá)及CRC組織陽性表達(dá)情況(HE)

表1 PLAG1蛋白在CRC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況[例(%)]

2.2CRC組織中PLAG1的表達(dá)與T分期和N分期、臨床病理分期的關(guān)系 PLAG1在CRC組織中的表達(dá)與T分期和N分期、臨床病理分期密切相關(guān)(P<0.05)。但PLAG1水平與年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤分化程度間無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 PLAG1表達(dá)與CRC臨床病理特征關(guān)系[例(%)]

2.3PLAG1高表達(dá)與CRC患者預(yù)后關(guān)系及預(yù)后影響因素 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，PLAG1高表達(dá)組CRC患者的OS短于PLAG1低表達(dá)組[P=0.0052；HR=1.9，P(HR)=0.0059]。見圖2a。PLAG1高表達(dá)組的DFS短于PLAG1低表達(dá)組[P=0.0070；HR=1.8，P(HR)=0.0078]。見圖2b。為了對生存分析數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，我們進(jìn)一步通過最終獲得隨訪資料的60例患者的預(yù)后數(shù)據(jù)分析了PLAG1的表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)系。采用Log-rank法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示PLAG1高表達(dá)的患者OS和DFS短于PLAG1低表達(dá)患者(P<0.05)。見圖2c、2d。單因素分析表明，PLAG1表達(dá)、N分期和臨床病理分期與CRC患者的OS和DFS相關(guān)(P<0.05)。見表3。多因素分析顯示，PLAG1表達(dá)、N分期和臨床病理分期是CRC患者術(shù)后OS和DFS的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01)。見表4。

圖2 PLAG1與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

表3 CRC術(shù)后OS和DFS影響因素的單因素分析

表4 CRC術(shù)后OS和DFS影響因素的Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

2.4PLAG1在CRC發(fā)生發(fā)展中可能涉及的分子機(jī)制 使用Linkedomics數(shù)據(jù)庫LinkInterpreter模塊導(dǎo)出PLAG1在CRC中的KEGG通路富集結(jié)果，分析PLAG1在CRC發(fā)生發(fā)展中的分子功能以及相關(guān)分子機(jī)制。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，PLAG1基因可能參與調(diào)節(jié)WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多種信號通路。見圖3。

圖3 PLAG1在CRC中的功能基因集KEGG通路富集分析PLAG1為多形性腺瘤基因1，CRC為結(jié)直腸癌

3 討論

PLAG1屬鋅指蛋白家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤如腮腺多形性腺瘤、脂母細(xì)胞瘤、間質(zhì)細(xì)胞瘤等中異常表達(dá)[14-15]。體外實驗證實，PLAG1具有促進(jìn)NIH-3T3細(xì)胞增殖、非錨定依賴性生長和使裸鼠成瘤的活性[16]。然而，PLAG1在CRC中的表達(dá)和臨床意義仍不確定。

本研究通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，PLAG1在CRC中的表達(dá)水平高于相應(yīng)的癌旁組織。CRC患者中PLAG1的高表達(dá)與不良臨床特征顯著相關(guān)，包括T分期、N分期和臨床病理分期。我們的研究結(jié)果表明，PLAG1在CRC組織中的表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)可能與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，PLAG可能參與CRC的發(fā)生與進(jìn)展。遺憾的是，我們未能在本研究中詳細(xì)闡述PLAG1在CRC發(fā)生和發(fā)展中的分子機(jī)制。我們通過生物信息學(xué)分析推測PLAG1可能參與調(diào)節(jié)WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多種信號通路，亦有研究報道,PLAG1在卵巢癌中參與IGF信號通路調(diào)控[12]，在肺癌中參與CamKK2-AMPK信號通路調(diào)控[17]，在CRC中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

既往研究已經(jīng)證實，PLAG1在多種惡性腫瘤中如肝母細(xì)胞瘤和肌上皮癌中具有評估預(yù)后價值[18-20]。PLAG1在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。在肝細(xì)胞肝癌中，抑制PLAG1可顯著降低肝癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力，對于預(yù)測肝癌患者肝切除術(shù)后的預(yù)后具有重要意義[11]；在腎臟透明細(xì)胞癌中敲低PLAG1表達(dá)在體外能夠抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并在體內(nèi)能夠抑制腫瘤生長[21]；在卵巢癌中，PLAG1與卵巢癌化療敏感性有關(guān)[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PLAG1能夠促進(jìn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定型CRC的發(fā)展和對5-氟尿嘧啶的耐藥性[22]，然而在CRC中PLAG1的預(yù)后意義尚不十分明確。在本研究中，高表達(dá)PLAG1者的OS和DFS短于低表達(dá)PLAG1者。此外，我們通過使用Cox比例風(fēng)險回歸模型得出結(jié)論，PLAG1表達(dá)是CRC患者預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，PLAG1在CRC中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與CRC患者的不良臨床特征和較差的預(yù)后相關(guān)。本研究為PLAG1在CRC中的臨床研究提供了理論基礎(chǔ)，提出了PLAG1可能作為調(diào)控CRC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的一個重要靶點，從而為CRC的診斷、臨床治療和預(yù)測預(yù)后提供新思路。