丁 萌 王紅娟 周 潔 高 強(qiáng)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤[1]，常規(guī)采用顯微手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合術(shù)后放化療等綜合治療，但是治療效果仍不理想。目前，膠質(zhì)瘤的病因、發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain noncoding RNA，lncRNA）在膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視[2，3]。lncRNA ZNF674-AS1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在非小細(xì)胞肺癌[4]、甲狀腺癌[5]和宮頸癌[6]中作為抑癌基因發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZNF674-AS1 在腦膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)，并且與病人預(yù)后有關(guān)[7]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究分析lncRNA ZNF674-AS1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800）和膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U87、U373）購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司；LipofectamineTM 2000試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；ZNF674-AS1 mimics、ZNF674-AS1 inhibitor、SOX9 siRNA 均由上海Gene Pharma 公司合成并提供；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sig?ma 公司；CCK8 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒及Transwell 小室購(gòu)于上海語(yǔ)純生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800）和膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U87、U373）置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次，每三天傳代一次。

1.3 RT-PCR 檢測(cè)lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)水平收集A172、U251、U87、U373、HA1800 細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后用熒光定量試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用2-△△Ct法計(jì)算lncRNA ZNF674-AS1相對(duì)表達(dá)量。引物序列：lncRNA ZNF674-AS1 上游5′-GGCGATCATACTGGGAGATG-3′，下游5′-TGT?GATTCAAGTTGGGGTCA-3′；內(nèi)參U6 上游5′-CAT?GTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游5′-CTCCTTA?ATGTCACGCACGAT-3′。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞接種于6孔板，密度為5×105個(gè)/孔。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，按照LipofectamineTM 2000 試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列和ZNF674-AS1 mimics（濃度為100 nmol/L），設(shè)置為CON組、ZNF674-AS1過(guò)表達(dá)組。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。將轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，每個(gè)培養(yǎng)孔添加10 μl CCK-8 試劑。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.6 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè) 應(yīng)用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移。遷移實(shí)驗(yàn)：在Transwell 遷移板上室加入5×104個(gè)細(xì)胞，下室中加入600 μl完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后，甲醇固定膜底細(xì)胞并進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫染色20 min，光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：使用預(yù)先加入Matrigel 膠的小室，上室中加入5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 lncRNAZNF674-AS1 對(duì)SOX9 調(diào)控作用的驗(yàn)證檢索TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)lncRNA ZNF674-AS1 與性別決定區(qū)Y 框蛋白9（sex-determining region Y boxprotein 9，SOX9）基因有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)確定二者的靶向關(guān)系。構(gòu)建SOX9 基因野生型3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒plncRNAWt、突 變 型 質(zhì) 粒plncRNA-Mut。將plncRNA-Wt、plncRNA-Mut 與ZNF674-AS1 mimics 和對(duì)照質(zhì)粒plncRNA-Reporter 共轉(zhuǎn)染U87 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后加入100 μL PLB 裂解液。參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證ln?cRNA ZNF674-AS1 對(duì)SOX9 基因的調(diào)控作用，將陰性對(duì)照序列（NC 組）、ZNF674-AS1 mimics（ZNF674組）和ZNF674-AS1 inhibitor（ZNF674-AS1 inhibitor組）分別轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，檢測(cè)SOX9 mRNA水平。

1.8 lncRNA ZNF674-AS1 通過(guò)SOX9 基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 為驗(yàn)證lncRNA ZNF674-AS1 通過(guò)SOX9 基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用，對(duì)U87 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（CON 組）、ZNF674-AS1 mimics（ZNF674-AS1 過(guò)表達(dá) 組）、ZNF674-AS1 mimics+SOX9 沉 默 質(zhì) 粒（ZNF674-AS1 過(guò)表達(dá)+SOX9 沉默組）。隨后用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖、Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理；計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞lncRNA ZNF674-AS1 的表達(dá) 與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800）比較，膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U87、U373）lncRNA ZNF674-AS1 的表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05，圖1）；四種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，U87細(xì)胞表達(dá)水平最低。

圖1 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800）和膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U87、U373）lncRNA ZNF674-AS1的表達(dá)水平

2.2 lncRNA ZNF674-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響 上調(diào)U87 細(xì)胞lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)，明顯抑制U87 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移（P<0.05；圖2）。

圖2 lncRNA ZNF674-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響

2.3 lncRNA ZNF674-AS1 對(duì)SOX9 基因的調(diào)控作用Starbase軟件預(yù)測(cè)顯示lncRNA ZNF674-AS1與SOX9基因有結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)，明顯抑制plncRNA-Wt 質(zhì)粒熒光素酶活性（P<0.05；圖3B）；沉默lncRNA ZNF674-AS1表達(dá)，則明顯增強(qiáng)其活性（P<0.05；圖3B）。但是，上調(diào)或沉默lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)并不影響plncRNA-Mut 質(zhì)粒熒光素酶活性（P>0.05；圖3B）。上調(diào)U87 細(xì)胞lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)，明顯降低U87 細(xì)胞SOX9 mRNA表達(dá)水平（P<0.05；圖3C）；沉默U87 細(xì)胞lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)，則明顯升高U87 細(xì)胞SOX9 mRNA表達(dá)水平（P<0.05；圖3C）。

圖3 lncRNA ZNF674-AS1靶基因分析

2.4 lncRNA ZNF674-AS1 靶向調(diào)控SOX9 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響 上調(diào)U87 細(xì)胞ln?cRNA ZNF674-AS1 表達(dá)，明顯抑制U87 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移（P<0.05，圖4）；上調(diào)lncRNA ZNF674-AS1 表達(dá)的同時(shí)沉默SOX9 基因表達(dá)，明顯增強(qiáng)U87細(xì)胞增殖、侵襲和遷移（P<0.05，圖4）。

圖4 lncRNA ZNF674-AS1過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控SOX9對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

3 討論

lncRNA 是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能[8，9]。研究表明，lncRNA可能是膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)標(biāo)志物，在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，并且對(duì)膠質(zhì)瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值[10～12]。lncRNA ZNF674-AS1 位于染色體Xp11.23，在非小細(xì)胞肺癌[4]、甲狀腺癌[5]、宮頸癌[6]和肝細(xì)胞癌[13]中低表達(dá)，可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。Luan等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA ZNF674-AS1在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，但是其生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800）比較，膠質(zhì)瘤細(xì)胞（A172、U251、U87、U373）lncRNA ZNF674-AS1 的表達(dá)水平明顯降低。為了進(jìn)一步分析lncRNA ZNF674-AS1 的生物學(xué)機(jī)制，我們應(yīng)用U87 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒進(jìn)行上調(diào)或沉默lncRNA ZNF674-AS1表達(dá)，結(jié)果顯示，上調(diào)lncRNA ZNF674-AS1，明顯抑制U87 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。說(shuō)明lncRNA ZNF674-AS1在膠質(zhì)瘤中可能作為抑癌基因發(fā)揮生物學(xué)作用。SOX9基因與腫瘤關(guān)系密切，其高表達(dá)可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，下調(diào)該基因表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并抑制S期細(xì)胞生長(zhǎng)[14，15]。我們用Starbase 軟件預(yù)測(cè)顯示lncRNA ZNF674-AS1 與SOX9 基因有結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX9是lncRNA ZNF674-AS1對(duì)SOX9的靶基因。

總之，膠質(zhì)瘤lncRNA ZNF674-AS1 呈低表達(dá)，可能通過(guò)靶向下調(diào)SOX9基因表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。