岳薔薇 徐樂 張東升

山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院口腔科，濟南 250021

頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全身最常見的惡性腫瘤之一，死亡率為40%～50%[1]。盡管腫瘤研究飛速進展，但HNSCC 總生存率仍未顯著提高[2]，因此亟需新的預后評估分子標志物。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A） 是真核生物 RNA 中最常見的修飾方式[3-4]，異常表達的m6A 調(diào)節(jié)基因可能與HNSCC 發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長的溫床，其中浸潤性免疫細胞如同雙刃劍影響癌細胞[6]。研究[7-8]證實m6A RNA 甲基化與免疫功能密切相關。然而，在HNSCC 中關于腫瘤m6A RNA 甲基化、免疫功能和腫瘤臨床特征之間的相關性仍不明確。因此，本實驗基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），通過生物信息學分析探索了HNSCC 中m6A 調(diào)節(jié)基因的表達、功能、臨床意義及其與免疫功能之間的關系，為HNSCC預后和治療提供指導。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中下載TCGA-HNSC 隊列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，其中包括502個腫瘤樣本和44個正常對照組織樣本。臨床數(shù)據(jù)主要包括腫瘤患者相應臨床病理特征，包括年齡、性別、病理分級、腫瘤分期和生存數(shù)據(jù)。

1.2 m6A調(diào)節(jié)因子差異表達及相互作用分析

使用limma R包篩選腫瘤和正常樣本之間的差異表達基因，篩選閾值設定為調(diào)整P值（adjustedPvalue，adj.P） <0.05，且差異倍數(shù)|log2FC|≥1。使用R 語言的ggplot2 軟件包繪制差異基因提琴圖及Pearson相關分析圖。

1.3 m6A調(diào)節(jié)因子風險預后模型構(gòu)建及評估

利用單因素COX 分析評估m(xù)6A 調(diào)節(jié)因子預后相關性，然后將P值小于0.05的預后相關基因進行LASSO 回歸分析構(gòu)建風險預后模型。通過將預后模型中每個基因表達量與相應風險系數(shù)的乘積相加，獲得每位患者的風險評分。根據(jù)風險評分，HNSCC 患者被均勻地分為高風險組和低風險組。分別使用單因素和多因素獨立預后分析評估m(xù)6A調(diào)節(jié)因子風險預后模型在HNSCC 患者預后評估中的臨床價值，并使用R 語言的ggplot2 軟件包繪制COX回歸分析樹葉圖。

1.4 m6A風險組免疫微環(huán)境功能狀態(tài)評估

使用xCell工具計算34個主要的免疫炎癥細胞的豐度[9]，并繪制了雷達圖展示了各細胞類型在高、低風險組中的分布差異。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有統(tǒng)計分析均在R 語言（版本4.1.2）中進行，P<0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。t檢驗和方差分析用于比較連續(xù)變量，卡方檢驗用于比較分類臨床病理變量，Pearson 相關性分析用于滿足正態(tài)分布的連續(xù)變量。

2 結(jié)果

2.1 m6A調(diào)節(jié)因子的表達和相互關系

HNSCC 正常組織和腫瘤組織之間存在15個m6A 相關基因的異常表達（圖1A）。除YTHDC2表達下降外，METTL3、METTL14、WTAP、KI‐AA1429、RBM15、FTO、ALKBH5、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 和HNRNPC 基因在腫瘤組織中均表達升高。15個差異表達的m6A 調(diào)節(jié)因子之間相互關聯(lián)，形成了一個復雜的m6A調(diào)控網(wǎng)絡（圖1B）。

圖1 TCGA HNSCC患者m6A調(diào)節(jié)因子差異表達及相互作用分析Fig 1 The expression profile and interrelation of m6A RNA regulators in TCGA HNSCC cohort

2.2 m6A調(diào)節(jié)因子風險預后模型構(gòu)建及評估

通過單因素COX 回歸分析，YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 與 HNSCC 患者預后顯著相關（圖2A）。其中，YTHDC2是HR小于1的保護基因（HR=0.846），而IGF2BP2（HR=1.015）和HNRN‐PC（HR=1.013）是風險基因。通過LASSO回歸分析發(fā)現(xiàn)需要 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 3個基因共同構(gòu)建風險預后模型，并得到風險評分公式如下：風險評分=（?0.169）×YTHDC2+（0.010）×IGF2BP2+（0.012）×HNRNPC。根據(jù)個體風險評分，分別將200 和186 名HNSCC 患者分為高風險組和低風險組。與低風險組相比，高風險組患者的總生存率顯著降低（P=3.528×105，圖2B）。高風險組和低風險組在性別（P<0.05）、病理分級（P<0.005）和臨床分期（P<0.05）方面存在顯著差異（表1）。在高風險組中，男性患者比例更高，且腫瘤分期和病理分級更高。

表1 HNSCC患者m6A風險分組的臨床特征分析Tab 1 Clinical characteristics of HNSCC samples of m6A risk groups

單因素獨立預后分析顯示年齡（P=0.034，HR=1.406）、分期（P<0.001，HR=1.399）和風險評分（P=0.001，HR=1.683）與總生存率顯著相關（圖2C）。進一步的多因素獨立預后分析將年齡（P=0.035，HR=1.418）、分期 （P<0.001，HR=1.430）和風險評分（P=0.003，HR=1.657）確定為獨立的預后因素（圖2D）。

圖2 m6A調(diào)節(jié)因子風險預后模型構(gòu)建及評估Fig 2 Construction and evaluation of the prognostic signature based on m6A regulators in TCGA HNSCC cohort

2.3 m6A風險組免疫微環(huán)境功能狀態(tài)評估

在高、低風險組之間共有156個差異表達基因，其中35個基因表達上調(diào)，121個基因表達下調(diào)（圖3A），其中涉及許多免疫相關基因（圖3B）。為了進一步探索腫瘤免疫/炎癥功能狀態(tài)的差異，比較了高、低風險組中各細胞類型的豐度。如圖3C 所示，其中大多數(shù)免疫細胞類型富集評分在高風險組中顯著降低，例如B 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞、M1 型巨噬細胞等。相反，高風險組的前B 細胞、輔助T 淋巴細胞富集分數(shù)更高。進一步挖掘前面所得到的m6A 風險分組相關的差異基因，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤因子如γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素（interleukin，IL）-12A 和IL-12B 在高風險組中表達下調(diào)，而促腫瘤因子CD155 在高風險組中略有上調(diào)（圖3D）。

圖3 m6A風險分組HNSCC患者腫瘤免疫微環(huán)境功能狀態(tài)分析Fig 3 Analysis of tumor immune microenvironment of different m6A risk groups in HNSCC

3 討論

臨床中常用TNM 分期指導腫瘤的診斷治療，但有報道指出相同臨床分期的HNSCC 患者會對治療產(chǎn)生不同的反應，導致預后無法預測[10]，因此亟需提出新的分子標志物為HNSCC 預后評估和治療選擇提供參考。研究[3]發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化在惡性腫瘤發(fā)生進展中發(fā)揮重要作用，然而在HNSCC 的研究仍不明確。本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫HNSCC 患者轉(zhuǎn)錄組及臨床數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析，闡明m6A 甲基化在HNSCC 預后評估中的重要價值，為HNSCC臨床治療提供了研究方向。

m6A 甲基化是RNA 中最豐富的修飾方式，其調(diào)節(jié)因子通常在惡性腫瘤中異常表達。與既往研究[11]結(jié)果相似。其中，甲基化轉(zhuǎn)移酶包括MET‐TL3、 METTL14、 KIAA1427、 RBM15、 WTAP、ZC3H13，去甲基化酶包括FTO、ALKBH5，而m6A 結(jié)合蛋白通過識別并結(jié)合m6A 位點，發(fā)揮不同的RNA調(diào)節(jié)作用：維持RNA穩(wěn)定性（IGF2BP1/2/3）、促進mRNA 翻譯 （YTHDF1）、調(diào)控RNA 降解（YTHDF2）等。本研究發(fā)現(xiàn)HNSCC 腫瘤組織中m6A 調(diào)節(jié)因子呈現(xiàn)異常表達，17個調(diào)節(jié)因子中有15個表達失調(diào)，這表明m6A 調(diào)節(jié)因子可能與腫瘤發(fā)生和臨床預后相關。而進一步相關性分析中發(fā)現(xiàn)這15個調(diào)節(jié)因子相互之間存在著表達相關性，這提示m6A 調(diào)控是一個復雜的網(wǎng)絡。其中多項研究[12-14]已經(jīng)證實 ALKBH5、METTL3 及 YTHDF1 在HNSCC發(fā)生和化療耐受中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。

然而，大多數(shù)異常表達的m6A 調(diào)節(jié)因子在HNSCC 中尚未有明確報道，這需要未來更深入的研究來揭示其潛在機制。

為了進一步明確m6A 調(diào)節(jié)因子在HNSCC 中的臨床意義，本研究構(gòu)建了由YTHDC2、IGF2BP2和HNRNPC 組成的風險預后模型。根據(jù)m6A 風險模型劃分風險組，發(fā)現(xiàn)與低風險組相比，高風險組患者其腫瘤惡性程度更高，且伴隨著較差的預后結(jié)果。并且與年齡和臨床分期相同，該風險模型已被驗證可以作為獨立因素評價HNSCC 患者的預后。

在該預后模型中，YTHDC2 被預測為HNSCC預后評價的保護因子，表明它可能在HNSCC 中發(fā)揮抑癌基因作用。然而，YTHDC2 在腫瘤發(fā)生中的作用目前仍存爭議。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌及肝癌中YTHDC2發(fā)揮促癌作用，這與本研究中YTH‐DC2 表現(xiàn)出的抑癌作用相矛盾。事實上，m6A 調(diào)節(jié)基因可能在不同類型癌癥中發(fā)揮不同作用。例如，METTL3 在膠質(zhì)母細胞瘤中充當腫瘤抑制基因[17]，而在膀胱癌中卻能促進腫瘤進展[18]。因此，YTHDC2 在HNSCC 中的作用及機制需要進一步研究明確。與YTHDC2 不同，IGF2BP2 和HNRNPC是HNSCC 腫瘤發(fā)生的危險因素。抑制HNRNPC通過抑制下游干擾素反應，來抑制乳腺癌的生長[19]，而過表達HNRNPC 通過改變選擇性切割和多聚腺苷化（alternative cleavage and polyadenyl‐ation，APA） 表達促進結(jié)直腸癌進展[20]；同樣IGF2BP2 可以通過調(diào)控性別決定區(qū)Y 盒狀蛋白2 （sex determining region Y box protein 2，SOX2）表達來促進結(jié)直腸癌進展[21]。

盡管關于腫瘤m6A 修飾的研究日益增多，但其對腫瘤免疫微環(huán)境的影響尚未闡明。為此本研究比較了m6A 風險組之間的基因表達譜和免疫細胞類型富集評分。結(jié)果顯示，高風險組患者免疫評分較低，且伴有大量細胞因子、趨化因子和相關受體表達失調(diào)。這提示m6A 甲基化修飾與腫瘤免疫調(diào)控密切相關。

進一步分析腫瘤微環(huán)境免疫細胞評分，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗腫瘤免疫細胞在m6A 高風險組中浸潤減少，主要包括M1 型巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞，而免疫抑制性Th2淋巴細胞浸潤顯著增多，這表明m6A 異常調(diào)控與HNSCC 微環(huán)境的促腫瘤免疫狀態(tài)相關。盡管 YTHDC2、IGF2BP2 和 HNRNPC 的免疫調(diào)節(jié)機制尚未闡明，考慮到m6A 基因是一個相互關聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡，其他m6A 調(diào)控基因的免疫調(diào)節(jié)作用可以提供參考。研究[22]發(fā)現(xiàn)YTHDF2 可以通過CCR7-lncDpf3 參與調(diào)控樹突狀細胞遷移，并通過m6A 依賴方式促進IFNB 的mRNA 降解，進而抑 制 干 擾 素 反 應[23]。 除 YTHDF2 外 ， 敲 除YTHDF1 可以顯著提高抗原特異性CD8+T 淋巴細胞抗腫瘤反應以及細胞程序性死亡-配體1（pro‐grammed cell death ligand 1，PD-L1）阻斷劑的治療效果[8]。而METTL3 可以通過增加TRIAP、CD40和CD80 的翻譯來促進樹突狀細胞激活[24]。這提示m6A 調(diào)節(jié)基因參與了免疫微環(huán)境調(diào)控。為了探索潛在機制，分析了m6A 風險組之間的免疫調(diào)節(jié)因子表達。結(jié)果表明，在高危組中，免疫刺激因子包括IFN-γ、IL-12A/B 的表達顯著降低，而免疫抑制因子CD155 的表達略有上調(diào)。這與免疫抑制的腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)相一致，再次驗證了m6A 調(diào)節(jié)基因在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，基于m6A調(diào)節(jié)因子YTHDC2、IGF-2BP2 和 HNRNPC 構(gòu)建的 HNSCC 風險預后模型可以作為新的生物標志物，評判HNSCC 患者預后，而異常的m6A 調(diào)節(jié)與腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)密切相關。因此，m6A RNA 甲基化可能成為一個潛在的治療靶點，不僅可以殺死腫瘤細胞，還可以輔助抗腫瘤免疫治療。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。