劉 坤，孫文松，沈?qū)氂?，張?zhí)祆o

（1遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼陽 111000；2遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，遼陽 111000；3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所遼陽研究中心，遼陽 111000）

0 引言

人參(Panax ginsengC.A.Meyer)是五加科人參屬、多年生草本藥用植物，主要藥用部位為干燥根，性甘、微苦，歸脾、肺和心經(jīng)[1]。遼寧林地廣闊，栽培歷史悠久[2]。當(dāng)前生產(chǎn)上，人參病害主要有黑斑病、灰霉病、根腐病、銹腐病和菌核病等[3]，其中根腐病是一種土傳的真菌性病害，根際土壤帶菌量大，隨栽培年份增加，危害逐年加重。人參根腐病主要危害根和根莖部位，造成根部變褐、潮濕腐爛[4-5]，患病植株地上部分明顯矮化、萎蔫，后期枯死。早期的研究表明，吉林[6]、湖北[7]等地人參根腐病的主要病原菌為鐮刀菌(Fusarium sp.)。一直以來，人們也普遍認(rèn)為人參根腐病病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。2013年，關(guān)一鳴等[8-9]從各地人參根腐病株中又分離鑒定到了尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)、銳頂鐮刀菌(Fusarium acuminatum)、克地鐮刀菌(Fusarium cerealis)、半裸鐮刀菌(Fusarium incarnatum)、層出鐮刀菌(Fusarium proratum)和芬芳鐮刀菌(Fusarium redolen)。在實(shí)際生產(chǎn)中，防控人參病害主要是在長期實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用化學(xué)防治，而長期高劑量單一用藥，導(dǎo)致多菌靈等化學(xué)藥劑的土壤殘留量上升、防效下降和病原菌抗藥性上升的惡性循環(huán)，以及土壤微生態(tài)平衡的破壞[10]，嚴(yán)重影響了人參的品質(zhì)、產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。因此，明確人參產(chǎn)區(qū)根腐病病原微生物的種類，能夠?yàn)楹罄m(xù)抗病育種、精準(zhǔn)用藥、生物防治等研究提供理論基礎(chǔ)。本研究采用瓊脂培養(yǎng)法，開展人參根腐病致病性測定，以期為其他植物根部病害研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料：遼寧新賓2～5年生人參根腐病病株、新購2年生人參種苗（用于致病性測定）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、康乃馨葉片培養(yǎng)基(CLA)、6‰瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離與純化 采用組織分離法，將病根表面用70%酒精消毒3次、10～20 s/次，無菌水沖洗干凈，除去表皮，將其剪成3～5 mm2左右小塊組織并用滅菌鑷子夾取放入PDA平板上，輕輕按壓。每皿2～5塊，擺放均勻。將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于恒溫培養(yǎng)箱，25℃恒溫培養(yǎng)3～5天。制板期間，每皿可加入農(nóng)用鏈霉素30～40 mg，以排除細(xì)菌污染[11]。

挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基或PDA平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后用。排除細(xì)菌污染方法同上。

1.2.2 致病性測定 按照柯赫氏法則，采用瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)法[12-14]，對病原菌進(jìn)行致病性測定。即，無菌條件下，將經(jīng)消毒處理的人參幼株置于300 mL三角瓶（內(nèi)含150 mL無菌瓊脂培養(yǎng)基）中，每瓶3株。參苗放置之前，用無菌挑針每株刺傷3～5個(gè)點(diǎn)。本次試驗(yàn)共設(shè)2組處理，分別為對照組(CK)、處理組，每組處理3瓶，每瓶3株2年生參苗。其中，對處理組參苗沿根部注入事先制備好的PDB菌液20 mL/瓶，為對照組參苗注入等量無菌水。20℃、12 h光照和4000 lx條件下培養(yǎng)5天后，開始觀察植株發(fā)病情況，此后逐日觀察。

1.2.3 病原菌鑒定 根據(jù)《真菌鑒定手冊》及文獻(xiàn)報(bào)道，通過特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察所分離病原菌菌絲組織、孢子和產(chǎn)孢器等特異性結(jié)構(gòu)，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和描述[15]；結(jié)合rDNA-ITS和特異性遺傳序列TEF延長因子對比分析[16-17]，從分子生物學(xué)角度輔以形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，進(jìn)一步明確菌株的分類地位。樣品送北京鼎國生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.2.4 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 本研究依據(jù)改良的根部病害標(biāo)準(zhǔn)，將人參根腐病的嚴(yán)重程度分為0～6級(jí)共7個(gè)等級(jí)[18-20]，具體指標(biāo)如表1所示。

表1 人參根腐病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與純化

采用組織分離法，本試驗(yàn)前期共分離純化疑似致病菌株10株，通過比較菌落形態(tài)、顏色等指標(biāo)，并結(jié)合顯微觀察發(fā)現(xiàn)，其中6株與菌株JS64-1表現(xiàn)一致，4株與菌株JS64-3表現(xiàn)一致，選取菌株JS64-1和JS64-3，用于下一步研究。

將2株真菌分別接種于PDA平板上，25℃恒溫暗培養(yǎng)。6天后，菌株JS64-1鋪滿全皿，菌落正面白色、規(guī)則圓形，菌絲絮狀，貼近培養(yǎng)基表面生長、菌絲茂盛，背面淡黃色、有輪紋，后期棕黃色（如圖1A）；在接種10天后菌株JS64-3長滿全皿，菌落正圓形，正面白色至淡粉色、絮狀，菌絲粗壯，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，背面紫色、無輪紋（如圖1B）。

2.2 致病性測定

依據(jù)表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，由圖2和表2參照可知，采用瓊脂培養(yǎng)法接種10天后，空白對照(CK)植株正常發(fā)芽生長，莖葉已經(jīng)伸出瓶口，株高（莖基部以上）達(dá)到(11.5±1.9)cm，葉片即將完全展開（如圖2①）；經(jīng)菌株JS64-1處理的植株新發(fā)莖葉瘦小、萎蔫腐爛，表面著生大量白色菌絲，莖基部及根部見病，內(nèi)部軟化、表皮分離，輕輕擠壓有異味，整體偏矮（如圖2②），平均株高(3.5±1.3)cm，發(fā)病等級(jí)為4級(jí)；經(jīng)菌株JS64-3處理的植株發(fā)病癥狀與JS64-1相似，但整體偏輕，新芽、莖基部和根部見病，根部表皮分離、輕微軟化，表面著生淡粉色菌絲，部分新芽出現(xiàn)萎蔫、腐爛現(xiàn)象（如圖2③），平均株高為(6.2±2.4)cm，發(fā)病等級(jí)為3級(jí)。

圖2 菌株JS64-1和JS64-3室內(nèi)接種發(fā)病情況

表2 接種14天后各處理株高及發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)表

對回接發(fā)病株再次進(jìn)行組織分離，得到菌株與原接種菌株一致（如圖3所示）。

圖3 回接發(fā)病植株上分離的菌株在PDA上的菌落形態(tài)

綜上，按照柯赫氏法則，經(jīng)致病性測定，明確了菌株JS64-1和JS64-3的侵染能夠?qū)е氯藚l(fā)生根腐病，二者確系遼寧人參主產(chǎn)區(qū)人參根腐病的病原真菌[21-22]。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將菌株接種于CLA培養(yǎng)基上，25℃恒溫暗培養(yǎng)5～30天，菌株JS64-1可產(chǎn)生大、小2種分生孢子和厚垣孢子：其中，大型孢子鐮刀狀，3～5個(gè)分隔，18～38 μm×3～5 μm，小型孢子卵圓形或腎形，1～2個(gè)分隔，5～15 μm×3～4.5 μm（如圖4A）；厚垣孢子近球形，菌絲或分生孢子均可形成，淡黃色，間生、頂生或串生（如圖4B箭頭所示）。菌絲有隔（如圖4C）。通過形態(tài)學(xué)特征，將菌株JS64-1鑒定為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。

圖4 CLA上JS64-1分生孢子(A)、厚垣孢子(B)和菌絲(C)的形態(tài)特征

在CLA培養(yǎng)基上25℃恒溫暗培養(yǎng)10～30天，菌株JS64-3可產(chǎn)生大、小2種分生孢子和厚垣孢子，其中：大型孢子無色，鐮刀狀、略彎曲，兩端細(xì)胞尖銳，3～6個(gè)分隔，大小20～50 μm×3～5 μm；小型分生孢子無色，卵圓形或橢圓形、微彎，具1～2個(gè)分隔，大小6～18 μm×3～5 μm（如圖5A）；厚垣孢子橢圓形或近圓形，無色或淡黃色，間生或串生，分生孢子和菌絲均可形成（如圖5B、C箭頭所示）。菌絲有隔（如圖5C）。通過形態(tài)學(xué)特征，將菌株JS64-3鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。

圖5 CLA上JS64-3分生孢子(A)、厚垣孢子(B)和菌絲(C)的形態(tài)特征

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 通過Genbank數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)菌株JS64-1的rDNA-ITS序列與MH477738、MT180477和MH536522等7株相似度達(dá)到99%以上，利用軟件MEGA7.0采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，其與腐皮鐮刀菌MH477738處于同一分支（如圖6A）；翻譯延長因子EF-1α序列對比結(jié)果顯示，其與MT152326、MK560275和JF923745等8個(gè)菌株相似度達(dá)到99%以上，采用上述方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其與腐皮鐮刀菌MT152326處于同一分支（如圖6B）。

圖6 分別基于ITS序列(A)和EF-1α序列(B)構(gòu)建菌株JS64-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

方法同上，JS64-3的rDNA-ITS序列與MT323123、MF356597和KM817208等8株相似度達(dá)到99.6%以上，采用MEGA7.0軟件N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖7A），顯示其與尖孢鐮刀菌KM817208等Fusarium oxysporum菌株處于同一類群；翻譯延長因子EF-1α序列對比結(jié)果顯示，其與MK962137、KF918544和KM065854等8株相似度達(dá)到99%以上，相同方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖7B），顯示其與Fusarium oxysporumMK962137處于同一分支。

圖7 分別基于ITS序列(A)和EF-1α序列(B)構(gòu)建菌株JS64-3的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜上，通過對2個(gè)遺傳序列的對比分析，都將菌株JS64-1和JS64-3與其他鐮刀菌區(qū)分開，并將二者分別與Fusarium solani和Fusarium oxysporum在同一類群。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，最終鑒定菌株JS64-1為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)、JS64-3為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。

3 結(jié)論和討論

本研究通過組織分離法、瓊脂培養(yǎng)法以及形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定等技術(shù)，對遼寧新賓人參產(chǎn)區(qū)人參根腐病的病原菌進(jìn)行了致病性測定和種屬分類地位鑒定，最終明確了遼寧人參主產(chǎn)區(qū)人參根腐病的主要病原菌為鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，為后續(xù)開展抗病育種、綠色防控等研究奠定了一定基礎(chǔ)。

近幾十年來鐮刀菌屬種分類研究發(fā)生了巨大的變化，分子生物學(xué)的應(yīng)用澄清了該屬種間、種內(nèi)關(guān)系，以及主要基因位點(diǎn)分析的引入，為研究該屬內(nèi)種間自然關(guān)系發(fā)揮著越來越重要的作用[23-24]。因此，本研究在對病菌開展分子生物學(xué)鑒定中，除了傳統(tǒng)的ITS序列分析外，結(jié)合了其翻譯延伸因子(translation elongation factor,TEF)基因片段EF-1α序列分析[25]。在通過Genbank進(jìn)行序列比對過程中發(fā)現(xiàn)，干擾菌明顯較少，證明該基因位點(diǎn)的可信度較高，在后續(xù)分類鑒定研究中值得進(jìn)一步應(yīng)用。

此外，在組織分離過程中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)參試病株中可以同時(shí)分離到上述兩種致病菌，說明上述兩種病原菌復(fù)合浸染現(xiàn)象在遼寧地區(qū)的人參根腐病田間發(fā)生較為普遍。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)二者在對人參根部的致病力仍存在一定差異，即，F(xiàn)usarium solani的致病力略強(qiáng)于Fusarium oxysporum。這與張晶晶等[26]在2020年通過人參葉片過敏性反應(yīng)結(jié)果推斷出來的結(jié)論基本一致，但本研究致病性測定所采用的改良瓊脂培養(yǎng)法，通過植株表現(xiàn)、根腐病病級(jí)等指標(biāo)可以直接反映出病原菌的致病性和致病力強(qiáng)弱。相較于針刺接種法[27]、孢子懸液注射法[28]、根部切傷法和菌土法[29]等，該方法操作簡便，耗時(shí)較短，且結(jié)果直觀準(zhǔn)確，可為后續(xù)相關(guān)研究奠定一定基礎(chǔ)。

受試驗(yàn)對象和研究范圍所限，本研究目前僅就上述2種致病菌的接種方法進(jìn)行了初步改良和優(yōu)化，瓊脂培養(yǎng)法在其他作物根部病原菌致病性測定上的具體應(yīng)用，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步完善。