肖盼盼，張豪，古敏晴，李飛飛，王新文，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫(yī)藥技術(shù)研究院（深圳 518000）；2.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球共有約1.86億人患不孕不育癥。造成不孕不育的其中一個(gè)原因是男性性功能障礙[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1995年全球男性性功能障礙患病人數(shù)為1.52億，預(yù)計(jì)2025年患病人數(shù)將達(dá)到3.22億[2]。我國(guó)一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)40～49，50～59和60～69歲的男性，患病率分別達(dá)55.3%，88.2%和91.8%[3]。然現(xiàn)有治療藥物，常伴有副反應(yīng)[4]。

疲勞是亞健康的主要癥狀之一[5]，影響著全球超過(guò)30%的人口[6-7]。疲勞常通過(guò)藥物及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充來(lái)緩解[8]，但服用藥物，可能會(huì)引發(fā)一些不良反應(yīng)[9]。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充產(chǎn)品可能含有興奮劑，不適用于所有群體[10]。因此，開發(fā)一款安全有效的食源性功能產(chǎn)品，對(duì)患者進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，有助于改善男性性功能障礙及疲勞狀態(tài)。

海洋是開發(fā)功能性食品的重要資源[11]。牡蠣，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，具有增強(qiáng)男性性功能、抗疲勞的功效[12-14]。海參是世界八大珍品之一，具有抗疲勞、提高免疫力、抗癌等生物活性[15]。我國(guó)鰻魚的養(yǎng)殖規(guī)模和加工產(chǎn)量占全球60%以上[16]，《日華子本草》記載：鰻魚可起陽(yáng)、治勞，補(bǔ)不足[17]。

以海洋源牡蠣肽、海參肽、鰻魚肽為原料，利用動(dòng)物試驗(yàn)，研究三者不同配比對(duì)提高男性性功能及疲勞的調(diào)節(jié)作用，從而明確海洋源復(fù)合多肽固體飲料中主要功能成分及最佳配比。在此基礎(chǔ)上，以VC、糖醇、速溶咖啡粉為輔料，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定產(chǎn)品最佳配方，旨在得到一款具有增強(qiáng)男性性功能及抗疲勞活性，兼具獨(dú)特風(fēng)味及口感的新型固體飲料，以期為男性性功能障礙患者及疲勞人群提供一種安全無(wú)后顧之憂的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽、海參肽（山西原生肽科技有限公司）；鰻魚肽（德州藍(lán)力生物技術(shù)有限公司）；糖醇（山東福田藥業(yè)有限公司）；速溶咖啡粉（德宏后谷咖啡有限公司）；競(jìng)品1和2（購(gòu)自網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物平臺(tái)）；苯甲酸雌二醇、黃體酮[上海全宇生物科技（駐馬店）動(dòng)物藥業(yè)有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

HC200C槽型混合機(jī)（寶雞建華制藥機(jī)械有限公司）；國(guó)家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)篩（上虞市道墟五四儀器廠）；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AUW120D型電子天平[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]；Varioskan LUX全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技）；XR-XM101游泳箱（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠195只，雌性小鼠325只（18～22 g），由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度25±2 ℃，濕度40%～70%，明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

原料篩選→粉碎過(guò)篩→稱料→混合調(diào)配→填充→包裝→熱收縮→金屬探測(cè)→成品

1.4.2 主原料及原料配比篩選

1.4.2.1 抗氧化活性檢測(cè)

參考張瑞剛等[18]、曹明原等[19]的方法檢測(cè)牡蠣肽、海參肽及鰻魚肽的抗氧化活性。

1.4.2.2 性功能活性檢測(cè)

雄鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組（表1），每組10只，受試樣品經(jīng)口灌胃，給予4周。雌鼠于試驗(yàn)結(jié)束前2周進(jìn)入動(dòng)物房，隨機(jī)分組，每組20只，于試驗(yàn)結(jié)束前2 d連續(xù)腹腔注射苯甲酸雌二醇（每只20 μg），觀察前4 h腹腔注射黃體酮（每只500 μg），使之進(jìn)入動(dòng)情期。末次給藥后，于當(dāng)晚20：00～23：00，在安靜、弱光的室內(nèi)將雄鼠分別單獨(dú)放入籠中，適應(yīng)環(huán)境10 min，每只雄鼠投入2只雌鼠，攝錄20 min內(nèi)小鼠的交配行為[20]。統(tǒng)計(jì)各組小鼠的性行為指標(biāo)，包括捕捉潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次捕捉雌鼠的時(shí)間間隔）、捕捉次數(shù)（雄鼠捕捉雌鼠的次數(shù)）、射精潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次射精的時(shí)間間隔）、射精次數(shù)（雄鼠射精的次數(shù)）[21]。

1.4.2.3 抗疲勞活性檢測(cè)

試驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組（表1），每組10只，受試樣品經(jīng)口灌胃，給予6周。末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于20 cm，水溫22±2 ℃，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間[22]。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)方案

1.4.3 優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.3.1 單因素試驗(yàn)

在主成分及配比確定的前提下，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別探究VC添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）、糖醇添加量（50%，55%，60%，65%和70%）及速溶咖啡粉添加量（2.5%，5.0%，7.5%，10.0%和12.5%）對(duì)固體飲料品質(zhì)的影響?？疾靻我蛩貢r(shí)，其他指標(biāo)以中間值為固定的參數(shù)條件。

1.4.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以VC、糖醇及速溶咖啡粉的添加量為自變量，以感官評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。通過(guò)正交試驗(yàn)及方差分析優(yōu)化固體飲料配方，正交組合設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表 單位：%

1.4.4 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

參考唐森等[23]、王帥等[24]的方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，感官品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

1.4.5 產(chǎn)品活性檢測(cè)

待產(chǎn)品配方確定后，對(duì)其進(jìn)行性功能及抗疲勞活性檢測(cè)。

1.4.6 營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)

按照GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》、GB/T 29602—2013《固體飲料》及GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的要求，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用雙尾t-檢驗(yàn)，其中P＜0.05代表有顯著性差異，P＜0.01代表有極顯著性差異。選用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 主原料及原料配比篩選

2.1.1 主原料抗氧化活性檢測(cè)

據(jù)報(bào)道，抗氧化物質(zhì)可消除過(guò)度生成的自由基，改善精子活力和活性[25]，可與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機(jī)體氧化損傷，減少疲勞產(chǎn)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)（表4），鰻魚肽、牡蠣肽及海參肽均具有抗氧化活性，相較，牡蠣肽活性最強(qiáng)。因此，篩選牡蠣肽為必備功效成分，復(fù)配鰻魚肽和（或）海參肽，進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，以確定產(chǎn)品功效成分及最佳配比。

表4 抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1.2 主原料性功能活性檢測(cè)

性功能檢測(cè)指標(biāo)中，捕捉潛伏期及射精潛伏期越短，捕捉次數(shù)及射精次數(shù)越多則其活性越好[21]。分析發(fā)現(xiàn)（圖1）：與CT組相比，P2、P4、P5、P7、P8和P9組的捕捉潛伏期顯著縮短，捕捉次數(shù)顯著增加；P4組射精潛伏期顯著縮短，射精次數(shù)顯著增加；P5、P6、P7和P8組的射精次數(shù)顯著增加。綜合發(fā)現(xiàn)，P4組各指標(biāo)均顯著改善，具有最強(qiáng)的性功能增強(qiáng)活性。

圖1 性功能活性檢測(cè)結(jié)果圖

2.1.3 主原料抗疲勞活性檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞最有力的表現(xiàn)，負(fù)重游泳時(shí)間越長(zhǎng)則抗疲勞活性越強(qiáng)[22]。由圖2可知，與CT組相比，P1、P3、P4、P5和P6組負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），具有抗疲勞活性，其中P4組負(fù)重游泳時(shí)間由528.5 s提高至786.4 s，延長(zhǎng)48.8%。

圖2 抗疲勞活性檢測(cè)結(jié)果

2.2 配方優(yōu)化——單因素試驗(yàn)

結(jié)合性功能及抗疲勞活性檢測(cè)結(jié)果，確定產(chǎn)品功效成分為牡蠣肽及海參肽，添加比例為10∶1（g/g）。在此基礎(chǔ)上，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)確定（VC）、糖醇及速溶咖啡粉的添加量。

2.2.1 VC添加量的確定

VC是多細(xì)胞生物必不可少的營(yíng)養(yǎng)素[26]，其對(duì)固體飲料感官品質(zhì)的影響如圖3所示。隨著VC添加量的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，其最適添加量為0.20%。

圖3 VC添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.2.2 糖醇添加量的確定

與蔗糖相比，糖醇具有低熱量、耐受量高、不致齲齒等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為代糖用于食品中[27]。分析圖4發(fā)現(xiàn)，糖醇對(duì)產(chǎn)品的甜度有很大影響，其最適添加量為65%。

圖4 糖醇添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.2.3 速溶咖啡粉添加量的確定

咖啡是世界“三大飲料”之一，風(fēng)味獨(dú)特，深受現(xiàn)代人喜愛[28]。分析圖5發(fā)現(xiàn)，速溶咖啡粉最適添加量為7.5%。

圖5 速溶咖啡粉添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響

2.3 配方優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

采用正交試驗(yàn)及方差分析對(duì)固體飲料配方進(jìn)行優(yōu)化。分析表5可知，各因素對(duì)固體飲料感官評(píng)分的影響主次順序?yàn)镃＞A＞B，即速溶咖啡粉添加量＞VC添加量＞糖醇添加量。由表6方差分析可知，VC添加量、速溶咖啡粉添加量對(duì)固體飲料感官評(píng)分有極顯著的影響。通過(guò)極差分析法分析得到最優(yōu)組合A1B2C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表6 正交試驗(yàn)方差分析

2.3.2 單因素效應(yīng)分析

為比較各因素對(duì)固體飲料風(fēng)味的影響，對(duì)各因素進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表7～表9。分析發(fā)現(xiàn)，VC添加量及速溶咖啡粉添加量的各水平間均具有顯著性差異，糖醇添加量的水平2和3間具有顯著性差異，且各輔料最適添加量分別為A1、B2和C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%，與極差分析結(jié)果相一致。

表7 VC添加量單因素效應(yīng)分析

表9 速溶咖啡粉添加量單因素效應(yīng)分析

表8 糖醇添加量單因素效應(yīng)分析

2.4 產(chǎn)品感官結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)試驗(yàn)確定牡蠣肽與海參肽添加比例10∶1（g/g），VC 0.20%、糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。在此條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，感官評(píng)定平均綜合評(píng)分為93.2分。

2.5 產(chǎn)品活性檢測(cè)

2.5.1 產(chǎn)品性功能活性檢測(cè)

對(duì)產(chǎn)品（P）進(jìn)行性功能活性檢測(cè)，并與市場(chǎng)流通較好的2個(gè)競(jìng)品（J1、J2）進(jìn)行比較。分析圖6發(fā)現(xiàn)，與CT相比，P組的各項(xiàng)性行為指標(biāo)均顯著改善，表明P組具有顯著的性功能增強(qiáng)活性。與J1組相比，P組各項(xiàng)性行為指標(biāo)均強(qiáng)于J1組，其中捕捉潛伏期、射精潛伏期及射精次數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＜0.05）。與J2組相比，其射精潛伏期顯著縮短，射精次數(shù)顯著增加（P＜0.05），表明產(chǎn)品的性功能增強(qiáng)活性強(qiáng)于2個(gè)競(jìng)品。

圖6 產(chǎn)品性功能活性檢測(cè)

2.5.2 產(chǎn)品抗疲勞活性檢測(cè)

對(duì)產(chǎn)品（P）進(jìn)行抗疲勞活性檢測(cè)，并與市場(chǎng)流通較好的2個(gè)競(jìng)品（J1、J2）進(jìn)行比較。分析圖7發(fā)現(xiàn)，與CT、J1、J2組相比，P組的游泳時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，表明P組具有顯著的抗疲勞活性且活性強(qiáng)于2個(gè)競(jìng)品。

圖7 產(chǎn)品抗疲勞活性檢測(cè)

2.6 產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)研發(fā)的海洋特色復(fù)合多肽固體飲料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示（表10），研發(fā)的產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量豐富（24.8 g/100 g），脂肪含量低（2.5 g/100 g），含有鋅元素（8.47 mg/100 g），且微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款高蛋白低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富的安全產(chǎn)品。

表10 產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以海洋源多肽為主要原料，研制一款固體飲料，通過(guò)體內(nèi)外及單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定最佳配方：牡蠣肽與海參肽添加比例為10∶1（g/g），VC 0.20%，糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。按此配方研制的海洋特色復(fù)合多肽固體飲料是一款色澤均一，酸甜適宜，無(wú)腥味、無(wú)蔗糖、無(wú)香精色素，具有獨(dú)特咖啡風(fēng)味且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的天然功能食品。此外，活性試驗(yàn)表明，該固體飲料具有增強(qiáng)小鼠性功能及抗疲勞的作用，且活性強(qiáng)于市場(chǎng)流通較好的2個(gè)競(jìng)品產(chǎn)品，具有開發(fā)應(yīng)用潛力，有望成為男性性功能障礙患者及疲勞人群的一種安全無(wú)后顧之憂的新選擇。