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        固定化脂肪酶的條件優(yōu)化及對豬肉風味的影響

        2022-11-28 03:29:10陳瑞琦韓金承吳慎威趙麗瑩代媛媛孟鑫
        食品工業(yè) 2022年11期
        關鍵詞:核桃殼醛類脂肪酶

        陳瑞琦,韓金承,吳慎威,趙麗瑩,代媛媛,孟鑫

        錦州醫(yī)科大學食品與健康學院(錦州 121000)

        近年來,風味酶被廣泛應用于乳制品、肉制品和葡萄酒中,受到國內外學者的廣泛關注。如林偉鋒等[1]研究發(fā)現脂肪酶抑制乳酸菌增殖和產酸,但明顯促進羧酸類生成,并產生酯類,可明顯改變風味,賦予體系豐富的風味。前期從豬肉中提取內源性脂肪酶,對雞肉、豬肉等肉品風味有明顯的改善作用,并在大腸桿菌、釀酒酵母中分別表達脂肪酶基因,發(fā)現重組酶對典型肉類及奶制品的風味有一定影響[2-5]。

        然而,在生產加工過程中,由于受到環(huán)境條件的制約,脂肪酶容易失活,且難以重復使用,造成資源浪費,限制了大規(guī)模生產應用。為此,選擇適宜的固定化方法對脂肪酶進行改造,生產固定化脂肪酶,是解決該問題的有效途徑。固定化酶多采用吸附法、共價交聯法、包埋法等方法,但固定化材料多為化學試劑,不利于脂肪酶在風味食品、油脂加工生產中應用[6]。核桃殼是環(huán)保型的天然生物材料,來源豐富、無毒無污染,可通過吸附進行酶的固定化,把脂肪酶吸附到活性炭孔隙上,產物的使用安全性比較容易有保證[7]。與游離脂肪酶相比,固定化脂肪酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特異性的同時又克服了游離酶的不足之處,呈現貯存穩(wěn)定性高、分離易回收、可多次重復使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點[8]。

        為此,試驗以改性核桃殼作為固定化豬肉內源性脂肪酶的載體,通過載體表面和酶分子表面間的吸附而達到固定目的,結合單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗優(yōu)化固定化脂肪酶制備工藝,并以豬肉為例,采用 HSSPME-GC-MS考察經豬肉內源性脂肪酶固定化前后豬肉風味的變化,以期為肉制品深加工提供理論基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        豬肉、生核桃殼(購買于錦州大潤發(fā));其他試劑(均為市售分析純)。

        RE-2000A馬弗爐(沈陽市長虹工業(yè)電器廠);固相微萃取(德國達姆施塔特默克集團);GL570氣相色譜-質譜聯用儀(武漢國量儀器有限公司)。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 豬肉內源性脂肪酶的提取

        采用雙水相法從豬肉(肥肉)中提取脂肪酶酶液,參考楊爽等[4]提取方法并做簡單修改。萃取條件:PEG2000濃度32%,(NH4)2SO4濃度32%,pH 6.5。

        1.2.2 改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶

        1.2.2.1 載體工藝制備

        參考韓本勇等[9]的方法稍加修改。將核桃殼經高溫烘干、粉碎,取10 g核桃殼烘干粉末加50 mL磷酸溶液,在60 ℃水浴鍋中進行加熱將其浸漬15 min,過濾將其放置加熱到高溫送入馬弗爐,在300 ℃高溫條件下炭化90 min,在600 ℃高溫條件下活化90 min,活化工作完成后,用0.1%鹽酸清洗并用蒸餾水將其洗滌至中性,放置于高溫烘干箱烘干,保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2.2 載體的表面氧化

        取5 g載體,加入50 mL 20%硝酸溶液,在80 ℃水浴鍋中進行浸泡3 h。過濾后,加入去離子水煮沸,過濾,干燥4次。

        1.2.2.3 載體的表面硅烷化

        取1 g氧化后的載體于100 mL無水乙醇中,超聲分散1 h后,加入一定量的0.01 mol/L鹽酸,調節(jié)至pH 4.0,加入3%的KH-570溶液,于60 ℃水浴反應24 h,過濾,濾餅分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌,除去未反應的KH-570,烘干。

        1.2.2.4 固定化酶的制備

        取1.0 g改性的載體于三角瓶中,加入5 mL瓶中含有50 mg/mL脂肪酶酶液,在搖床上持續(xù)振蕩一定時間,使這些載體能夠迅速吸附固定脂肪酶。經抽濾、去離子水洗滌、冷凍干燥得到固定化脂肪酶。

        1.2.3 固定化脂肪酶酶活性測定方法

        試驗采用一種經過不斷改進的銅皂法對酶進行活性測定,在2支試管中依次繼續(xù)加入2 mL橄欖油乳化液和2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5),在40 ℃水浴中加熱5 min后,加入0.5 mL脂肪酶液,充分均勻振蕩混勻后,水浴中振蕩15 min,立即加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液,6 mL 95%乙醇溶液,混合后繼續(xù)加入3 mL異辛烷,并完全均勻振蕩90 s。于60 ℃靜止放置10 min,待冷卻后,取上層1 mL異辛烷,將其放入1支新試管中,依次分別加入4 mL異辛烷和1 mL銅鹽顯色劑,混勻后濾液進行低溫靜置,取上清液,用紫外可見分光光度計在714 nm波長下進行測定其中的吸光度,根據標準曲線得到脂肪酶酶活力[10]。酶活力單位(U):1 μmol脂肪酸在1 min內由酶轉化而形成的活力的量稱為1個脂肪酶活力單位。

        1.2.4 單因素試驗

        以載體量(0.50,0.75,1.00,1.25和1.50 g)、pH(6.0,7.0和8.0)、固定化溫度(35,40,45,50和55 ℃)和固定化時間(1,2,3,4和5 h)為單因素,相對酶活為考察指標,考察4個因素對固定化酶活性的影響。每個樣品重復試驗3次。

        1.2.5 正交試驗

        在單因素試驗基礎上,選取載體量、pH濃度、固定化溫度和固定化時間作為考察因素,以相對酶活為響應值,采用四因素三水平進行響應面分析優(yōu)化,每個樣品重復試驗3次,具體試驗設計見表1。

        表1 響應面試驗因素水平設計

        1.2.6 風味檢測

        1.2.6.1 原料肉的處理

        在常溫,pH 6.5條件下,稱取10 mL蒸餾水與25 g豬肉樣品充分混勻浸泡30 min(樣品A);分別取10 mL游離酶酶液和固定化酶酶液與25 g豬肉樣品充分混勻浸泡30 min(樣品B和樣品C)。每組分別置于300 mL沸水中單獨煮制2 min備用[11]。

        1.2.6.2 HS-SPME-GC-MS分析

        固相微萃?。?組樣品分別取4 g切碎,煮熟后迅速放入20 mL頂空瓶中,快速加蓋進行GC-MS檢測,每組樣品平行試驗2次。加入4 mL飽和氯化鈉溶液及磁轉子,用聚四氟乙烯隔墊密封,在磁攪拌器中45 ℃加熱10 min。用活化的萃取頭(270 ℃活化60 min)頂空吸附35 min后,然后將萃取頭插入進樣口解吸5 min。每個樣品重復試驗3次[11],樣品分別標記為樣品A,B和C。

        氣相色譜條件:HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度250 ℃,不分流模式進樣;載氣He,流速1.0 mL/min;程序升溫,柱初溫40℃,保持3 min,以3 ℃/min升至100 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃,保持5 min[11]。

        質譜條件:色譜-質譜接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;離子化方式EI;電子能量70 eV;質量掃描范圍m/z30~550[11]。

        1.3 數據處理

        所有結果均為3次重復的平均值,使用Microsoft Office 2013軟件繪制圖。響應面數據采用Design-Expert 8.0.5軟件進行分析。GC-MS數據采用揮發(fā)性成分通過譜庫檢索進行數據分析。

        2 結果與分析

        2.1 單因素試驗結果

        2.1.1 載體量對固定化效果的影響

        在pH 7.0、固定化溫度40 ℃、固定化時間2 h條件下,載體量范圍設置為0.5~1.5 g,考察不同載體量對固定化脂肪酶酶活的影響。結果如圖1(A)所示,隨著載體量增加,固定化酶相對酶活呈現先上升后下降趨勢。研究表明,改性核桃殼粉末通過吸附法能把脂肪酶固定化,載體量過高或過低均會對固定化效果產生影響。載體量0.75 g時酶活最佳。

        圖1 各因素對固定化脂肪酶的影響

        2.1.2 pH對固定化效果的影響

        在載體量0.75 g、固定化溫度40 ℃、固定化時間2 h條件下,pH范圍設置為6.0~8.0,考察不同pH對固定化酶酶活的影響。結果如圖1(B)所示,pH 7.0時,固定化脂肪酶的相對酶活力最高。研究表明,酶促反應對酸堿度很敏感,pH影響酶分子構象穩(wěn)定性,過酸或過堿均可導致酶的變性失活。如pH偏離最適pH,則酶催化能力下降。因此,在設置范圍內使酶活性表現最高的pH 7.0為最適pH。

        2.1.3 溫度對固定化效果的影響

        在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化時間2 h條件下,固定化溫度范圍設置為35~55 ℃,考察不同固定化溫度對固定化酶酶活的影響。結果如圖1(C)所示,在所設置的固定化溫度范圍中,相對酶活大致呈現先升后降趨勢,在45 ℃達到最佳酶活。研究表明在最適溫度下,溫度升高,相對酶活升高。在最適溫度上,隨著溫度升高,酶的變形程度逐步加大,酶的活力逐步降低。因此,45 ℃時酶相對活力最大,為最適溫度。

        2.1.4 時間對固定化效果的影響

        在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化溫度45 ℃條件下,固定化時間范圍設置為1~5 h,考察不同固定化時間對固定化酶酶活的影響。結果圖1(D)所示,在設置的固定化時間范圍內,相對酶活呈現先升高后降低趨勢,在0~3 h,改性核桃殼粉末與脂肪酶在充分振蕩的條件下,能更好地吸附脂肪酶,使固定化的效果增強,固定化時間大于3 h時,過度反應導致改性核桃殼活性炭孔隙過于致密,阻止載體與酶分子的接觸,使得酶活降低。因此最佳固定化時間為3 h。

        2.2 響應面優(yōu)化結果

        2.2.1 回歸模型建立與討論

        根據單因素試驗,以相對酶活為響應值,每個影響因素擇出3個水平,即A載體量(0.50,0.75和1.00 g)、B pH(6,7和8)、C溫度(40,45和50℃)、D時間(2,3和4 h),設計響應面試驗,經Box-Behnken分析得出結果,見表3。

        使用Design-Expert 8.0.5軟件對表2進行二次線性回歸擬合,得到回歸方程Y=-1 387.129 67+660.148 67A+174.729 50B+26.807 80C+15.363 00D+5.320 00AB+0.066 000AC+1.270 00AD+0.166 50BC+0.602 50BD+0.183 50CD-491.001 33A2-13.290 08B2-0.315 05C2-4.663 8D2。

        表2 響應面分析結果

        由表3方差分析的結果可以得知:整體模型F=187.37,P<0.000 1,表明試驗的模型極顯著;失擬項P=0.079 8>0.05,說明模型失擬度不顯著;模型的決定系數R2=0.971 2,試驗值與預測值非常接近,其線性關系和二次關系極顯著(P<0.000 1),說明該模型可很好地解釋響應值。模型的調整決定系數Radj2=0.989 4,說明該模型能解釋響應值的變化,因而擬合程度較好,試驗誤差小,可用此模型優(yōu)化酶活進行分析和預測。一次項A(P<0.01)差異極顯著,一次項B和C(P<0.05)差異顯著,一次項D(P>0.05)差異不顯著;A2、B2、C2、D2(P<0.01)差異極顯著。由F值得出,影響酶活優(yōu)化的4個因素的主次順序為A>B>C>D,即載體量>pH>固定化溫度>固定化時間,可見,載體量影響最大,其次為固定化環(huán)境pH,固定化時間影響最小。

        表3 響應面試驗方差分析

        2.3 HS-SPME-GC-MS分析豬肉風味

        通過HS-SPM-GC-MS方法,測定出A、B、C這3組樣品的揮發(fā)性物質分別為54,44和44種,主要為醛類、醇類和烴類等(圖2),從揮發(fā)性物質含量方面來看,經固定化脂肪酶處理的樣品這類含量更豐富,對樣品進行處理后能賦予豬肉更豐富的香味[12]。

        圖2 豬肉樣品處理前后揮發(fā)性成分相對含量的比較

        2.3.1 醛類物質分析

        豬肉中的揮發(fā)性物質類型十分豐富,醛類便是其中的一種,這類物質通常是脂肪酸氧化降解后形成的。試驗結果表明,在對3組豬肉樣品進行檢測后,均得到9種醛類物質,其含量占比依次是48.89%,51.33%和54.32%。有研究報道生豬肉中醛類化合物含量約50.27%[13]。樣品C中醛類物質含量高于文獻報道,由此可見,在對豬肉樣本進行處理過后,會形成更多醛類物質。而醛類因為覺察閾值較低,所以會對肉品風味產生較大影響,通常當脂肪酸出現氧化降解反應后會生成此類物質。3組樣品中都存在的醛類是5~9個碳原子直鏈醛,為主要的醛類,其中,具備較高百分含量的包括己醛、壬醛等[14]。其中,含量最高的是己醛,其味道和青草香味差不多,對豬肉風味的影響較大,其后是庚醛、辛醛等,有果香味或油脂香,也是豬肉風味的重要影響因素,相似的研究成果也可見報道[15]。

        2.3.2 烴類和酯類物質分析

        烯烴族一般來自于飽和脂肪酸烷氧自由基的均裂,其感覺閾值范圍通常較高,對肉類風味的直觀貢獻并不大,甚至基本不影響香味[16]。A、B、C這3組樣品中烯烴類分別檢出5,3和3種,相對含量分別為2.43%,4.61%和36.83%,能夠發(fā)現它們之間存在較大區(qū)別。酯類物質一般來源于酸與醇間進行的酯化反應。樣品中,在檢驗出酯類化合物的數量、相對含量方面,A組分別為5種(3.20%),B組分別為3種(3.26%),C組分別為3種(5.72%)。經分析可知,酯類化合物能夠為食物提供的氣味主要有3種,首先是蜂蜜香,其次是花香,最后是水果香。在需要對豬肉風味進行豐富之時,它也能起到一定作用[17]。

        2.3.3 醇類物質分析

        在豐富肉類風味方面,醇類雖不如醛類的貢獻更大,但在肉品風味中也起關鍵性作用。在3組樣品里,在檢驗出醇類物質的數量、相對含量方面,A組分別為5種(5.02%),B組分別為7種(18.43%),C組分別為7種(23.99%)。1-辛烯-3-醇能產生蘑菇香味,可以提高肉的鮮味,為最典型的肉香型物質,來源于脂質β-氧化[18],其相對含量依次是1.23%,13.38%和18.52%,其在A組中含量最低。二甲基硅烷二醇、正辛醇、4, 7-二甲基-4-辛醇在B、C組中都比A組多。由不飽和脂肪酸可知,當其出現氧化裂解反應之時,會有醇類、醛類物質形成[19]。此外,常認為肉品風味并不會受到酸類物質的較大影響,試驗中檢測出的酸類化合物含量并不高,相對含量分別為0.51%,0.20%和0.26%。同時在部分揮發(fā)性風味物質中,酸類扮演著中間體的角色,但普遍認為此類物質并不會對豬肉風味產生直接性影響。

        2.3.4 酮類物質分析

        豬肉中的不飽和脂肪酸,發(fā)生氧化降解反應時會生成酮類物質。經分析可知,一部分酮類物質的氣味是花果香,而二酮通常產生奶油香、肉香,在碳鏈數量變多時,花香會更為濃郁[20]。在上述樣品里,在檢驗出酮類物質的數量、相對含量方面,A組分別為3種(11.25%),B組分別為2種(7.99%),C組分別為2種(3.89%)。其中有一類酮類物質是上述樣品都有的,為3-辛酮,其散發(fā)著奶油香,當亞油酸發(fā)生脂氧合酶氧化反應之時,便會生成這類物質[20]。蔡原等[21]發(fā)現在對豬肉風味的貢獻方面,酮類遠不及醛類,然而在肉類整體風味中,酮類所起到的影響卻不可忽略。

        2.3.5 其他物質分析

        當含硫氨基酸發(fā)生降解反應時,易生成含硫物質,檢測的含硫物質有許多,比如N-(二甲基氨基甲基)氮丙啶、二甲基二硫化物等。在這些含硫物質中,帶有濃郁肉香味的二甲基二硫化物雖然并不具備較高的含量,卻能夠對豬肉風味產生極大影響。同時,通常肉類特征香味的來源有許多,雜環(huán)類化合物便是其中的一種[22]。像檢測出的十二甲基環(huán)六硅氧烷等,盡管并不具備較高含量,但其對豬肉風味的影響也不可忽略,有研究發(fā)現,在肉的風味上,這些物質扮演主要中間體的角色,對肉香的形成作出貢獻極大。

        3 結論

        試驗以改性核桃殼為載體,采用吸附法固定化豬肉內源性脂肪酶。通過單因素試驗及響應面優(yōu)化固定化脂肪酶的工藝條件,并研究固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定和重復使用性。在載體量0.75 g、pH 7.0、固定化溫度45 ℃、時間3 h條件下,試驗制備的固定化脂肪酶最高酶活力可達178 U/g。

        采用HS-SPME-GC-MS技術研究豬肉中具體的揮發(fā)性風味物質成分,研究結果表明:經改性核桃殼固定化脂肪酶處理前后的豬肉樣品中有9種醛類物質,其含量分別為48.89%,51.33%和54.32%;其次是醇類中分別檢出5,7和7種,相對含量分別為5.02%,18.43%和23.99%,其中主要的醇類化合物是1-辛烯-3-醇;烯烴類分別檢出5,3和3 種,相對含量分別為2.43%,4.61%和36.83%。添加改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶后肉品風味物質成分發(fā)生改變,豬肉樣品的揮發(fā)性物質分別為54,44和44種,主要為醛類、醇類和烴類,這些揮發(fā)性風味物質的成分變化表明,添加改性核桃殼法固定化的豬肉內源性脂肪酶處理肉品可以有效增加肉品的香氣,提高肉品風味,并為固定化脂肪酶在肉品中的應用提供試驗依據。

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