徐軻鵬 ，趙靜，唐月梅，王立博，鄒強(qiáng)，文永平*

1.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（成都 610016）；2.四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司（成都 610000）

木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，對蛋白質(zhì)底物具有較強(qiáng)的水解能力[1]，因?yàn)槠浒踩愿?、易獲取、熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在外源蛋白水解酶類市場中占據(jù)十分重要的地位[2]。木瓜蛋白酶用途廣泛，可作肉類嫩化劑、啤酒品質(zhì)改良劑、營養(yǎng)保健食品等[3]，根據(jù)2017年酶類市場的研究報(bào)道，其在食品加工方面的應(yīng)用顯著領(lǐng)先其他植物來源的外源蛋白水解酶，并且其應(yīng)用范圍有進(jìn)一步擴(kuò)展的趨勢[4]。李志遠(yuǎn)等[5]通過對解凍過程中凍肉顯微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，解凍溫度15 ℃左右時(shí)凍肉解組織恢復(fù)較好，食用品質(zhì)高，但木瓜蛋白酶適宜反應(yīng)溫度較高，常溫（20 ℃）條件下催化活力不足最適溫度的10%，在一定程度上限制了木瓜蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用[6]。Fruton等[7]利用合成肽為底物，證明游離半胱氨酸可以顯著提高木瓜蛋白酶活力。Homaei等[8]通過酶動(dòng)力學(xué)研究再次驗(yàn)證，由一定量的半胱氨酸與木瓜蛋白酶形成的共固定化酶，相比單獨(dú)固定化木瓜蛋白酶，在低溫下具有較高的活性和穩(wěn)定性。超聲波作為一種新興物理手段，在食品工業(yè)應(yīng)用廣泛[9]。黃六容等[10]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用超聲波處理木瓜蛋白酶，其活力比對照組高9%，但隨超聲波處理時(shí)間的增加，其活力反而降低14.5%。

超聲波技術(shù)和游離半胱氨酸單獨(dú)對木瓜蛋白酶活力的影響被廣泛研究，兩者在較低溫度下對木瓜蛋白酶的活力都有一定增強(qiáng)效果。但超聲波協(xié)同半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響鮮有報(bào)道。鑒于此，試驗(yàn)固定初始處理溫度20 ℃，以木瓜蛋白酶活力為評價(jià)指標(biāo)，探討半胱氨酸及超聲波對其影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法分析超聲波時(shí)間、超聲波功率與游離半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響，探究最佳工藝參數(shù)，為木瓜蛋白酶在肉制品中的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162D恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；UV1810S分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；Centrifuge 5804冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HMS-901D磁力攪拌器（博大精科儀器廠）；HH-6恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)前處理

將0.1%的木瓜蛋白酶溶液置于超聲波清洗機(jī)內(nèi)，一起放置于恒溫培養(yǎng)箱中，確保試驗(yàn)在（20±0.1）℃的條件下進(jìn)行。

1.3.2 測定木瓜蛋白酶活力

根據(jù)張新燦等[11]的方法，略作修改。準(zhǔn)確移取0.2 mL木瓜蛋白酶液及2.2 mL 1 g/100 mL酪蛋白，在0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液（pH 8.5）中均勻混合，40 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，立即加入3.6 mL 10%的三氯乙酸溶液。以在木瓜蛋白酶液與酪蛋白底物混合之前加入三氯乙酸作為空白。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液于6 570×g離心力下離心20 min，取上清液，測定其280 nm處的吸光度。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的吸光度，計(jì)算反應(yīng)液中酪氨酸含量。木瓜蛋白酶活力可用1 mL木瓜蛋白酶液在1 min內(nèi)分解酪蛋白后的酪氨酸含量表示，單位為U/mL。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

固定條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、反應(yīng)初始溫度20 ℃。設(shè)定超聲波功率、超聲波時(shí)間、游離半光氨酸添加量3個(gè)因素，單因素試驗(yàn)條件：（1）超聲波時(shí)間30 min，游離半胱氨酸添加量10 mmol/L，超聲波功率為50，100，150，200和250 W；（2）超聲波功率100 W，游離半胱氨酸添加量10 mmol/L，超聲波時(shí)間為10，20，30，40和50 min；（3）超聲波功率100 W，超聲波時(shí)間30 min，游離半胱氨酸添加量為5，10，15，20和25 mmol/L。

隨后，徐渭又指出，雖然南戲無宮調(diào)系統(tǒng)，但其曲牌在宋元時(shí)期已經(jīng)形成了固定套路的銜接順序：“南曲固無宮調(diào)，然曲之次第，須用聲相鄰以為一套，其間亦自有類輩，不可亂也。如【黃鶯兒】則繼之以【簇御林】，【畫眉序】則繼之以【滴溜子】之類，自有一定之序，作者觀于舊曲而遵之可也?！盵14](P241)可見，徐渭倡導(dǎo)從古戲文本中找尋直接線索，以宋元南戲舊篇中的實(shí)例來排列、歸納“曲之次第，須用聲相鄰以為一套”[14](P241)的具體順序，完全是重視實(shí)證的理性研究路線。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對影響木瓜蛋白酶活力的超聲波功率（A）、超聲波時(shí)間（B）和游離半胱氨酸添加量（C）3個(gè)因素，使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化，對擬合方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，各試驗(yàn)組編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.00軟件分別對以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差和顯著性分析，Turkey法進(jìn)行多重比較，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析，Origin 8.0作圖，在無特殊說明的情況下，所有測試結(jié)果一式三份。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲波功率對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波時(shí)間和游離半胱氨酸添加量分別為30 min和10 mmol/L時(shí)，超聲波功率在50～250 W范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖1所示。隨著超聲波功率的增加，木瓜蛋白酶活力逐漸增強(qiáng)，在100 W時(shí)達(dá)到最大值。木瓜蛋白酶活力的提高可能是因?yàn)槌暡üβ实脑龃蠹铀俜磻?yīng)溶液的振蕩，使木瓜蛋白酶與底物的接觸更徹底，其相互作用加強(qiáng)[12]。超聲波功率大于100 W之后，酶活力慢慢降低，但總體趨勢較為平緩，沒有表現(xiàn)出顯著性差異。

圖1 超聲波功率對木瓜蛋白酶活力的影響

2.1.2 超聲波時(shí)間對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波功率和游離半胱氨酸添加量分別為100 W和10 mmol/L時(shí)，超聲波時(shí)間在10～50 min范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖2所示。隨著超聲波時(shí)間的延長，木瓜蛋白酶活力變化趨勢總體上呈先增大后減小，超聲波時(shí)間對木瓜蛋白酶活力有極顯著影響（P＜0.01）。木瓜蛋白酶活力在30 min時(shí)達(dá)到最大值，引起該結(jié)果的原因可能在于超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生各種綜合作用，如瞬間高壓、微觀射流和剪切應(yīng)力等使木瓜蛋白的酶催化活性中心暴露，與作用底物充分結(jié)合，導(dǎo)致酶催化活力顯著增強(qiáng)[13]。隨著超聲波時(shí)間繼續(xù)延長，水分子裂解，反應(yīng)溶液中出現(xiàn)大量·OH和·OOH等自由基，酶分子與這些自由基相互作用，導(dǎo)致木瓜蛋白酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活力大幅下降甚至可能失活[14]。

圖2 超聲波時(shí)間對木瓜蛋白酶活力的影響

2.1.3 游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的影響

超聲波功率和超聲波時(shí)間分別為100 W和30 min時(shí)，游離半胱氨酸添加量在5～25 mmol/L范圍內(nèi)的木瓜蛋白酶活力變化如圖3所示。隨著游離半胱氨酸添加量的增加，木瓜蛋白酶活力變化趨勢總體上呈先增大后減小，游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力有極顯著影響（P＜0.01）。游離半胱氨酸添加量10 mmol/L時(shí)，木瓜蛋白酶活力達(dá)到峰值。半胱氨酸是木瓜蛋白酶的激活劑，在多項(xiàng)研究中被證明[15]。游離半胱氨酸激活木瓜蛋白酶的能力與其濃度有直接關(guān)系，此現(xiàn)象在早期研究中已表明[16]。10～25 mmol/L時(shí)木瓜蛋白酶活力明顯下降的原因可能是過高濃度的游離半胱氨酸會(huì)阻礙酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致酶活力降低，催化反應(yīng)速率減慢。

圖3 游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗(yàn)分析，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的超聲波功率（A）、超聲波時(shí)間（B）和游離半胱氨酸添加量（C）條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合，得到方程：Y=34.20+0.090A+0.21B+0.75C+0.027AB-0.083AC-0.16BC-1.23A2-1.38B2-0.73C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表3可知：回歸模型P＜0.01，擬合檢驗(yàn)顯著；失擬項(xiàng)P=0.576 9＞0.05，失擬檢驗(yàn)不顯著，因此，該模型可以很好描述各因素對木瓜蛋白酶活力的相互影響，可以使用該模型對試驗(yàn)進(jìn)行模擬。決定系數(shù)R2=0.995 7，說明此模型極顯著；校正決定系數(shù)Radj2=0.990 2，表示試驗(yàn)純誤差不顯著，可以用該模型進(jìn)行試驗(yàn)。分析模型中的各項(xiàng)系數(shù)可知：因素B、因素C表現(xiàn)極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)BC表現(xiàn)顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2表現(xiàn)均極顯著（P＜0.01）。試驗(yàn)中，因素A、B、C的F值分別為4.51，23.42和313.53，表明對木瓜蛋白酶活力的影響順序?yàn)橛坞x半胱氨酸添加量（C）＞超聲波時(shí)間（B）＞超聲波功率（A）。

表3 回歸模型及方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖4是響應(yīng)值對各因素兩兩交互作用構(gòu)成的三維曲面圖，對響應(yīng)面曲面圖和等高線進(jìn)行對比分析可知，超聲波時(shí)間與游離半胱氨酸添加量交互作用的響應(yīng)面凸起程度大于其他因素的交互作用，表示超聲波時(shí)間與游離半胱氨酸添加量對木瓜蛋白酶活力的交互影響最大。這與表3中的方差分析結(jié)果一致（P＜0.05）。

圖4 各因素的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.4 最佳參數(shù)值的確定及驗(yàn)證

經(jīng)回歸模型分析，得到超聲波協(xié)同半胱氨酸提高木瓜蛋白酶活力的最佳條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、初始處理溫度20 ℃、超聲波功率100.97 W、超聲波時(shí)間30.45 min、游離半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此條件下木瓜蛋白酶活力為34.40 U/mL。從試驗(yàn)的操作性考慮，將各參數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，最終確定條件：木瓜蛋白酶用量0.1%、起始處理溫度20 ℃、超聲波功率100 W、超聲波時(shí)間30 min、游離半胱氨酸添加量12 mmol/L，用此條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終結(jié)果為34.32 U/mL，此結(jié)果與模型預(yù)估值接近，表明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化所得結(jié)果合理可靠。

3 結(jié)論

試驗(yàn)探討超聲波及半胱氨酸對木瓜蛋白酶活力的影響，通過響應(yīng)面法得到提高木瓜蛋白酶活力的最佳工藝條件并進(jìn)行驗(yàn)證。在3個(gè)因素中，影響木瓜蛋白酶活力的強(qiáng)弱順序?yàn)橛坞x半胱氨酸添加量＞超聲波時(shí)間＞超聲波功率。提高木瓜蛋白酶活力的最優(yōu)條件為木瓜蛋白酶用量0.1%，初始處理溫度20 ℃，超聲波功率100.97 W，超聲波時(shí)間30.45 min，游離半胱氨酸添加量12.56 mmol/L。此時(shí)，木瓜蛋白酶活力為34.40 U/mL。

綜上所述，利用超聲波輔助半胱氨酸可以有效提高木瓜蛋白酶活力，改善木瓜蛋白酶在常溫下酶活力不高的問題。試驗(yàn)結(jié)果為木瓜蛋白酶在肉制品加工中的高效利用提供數(shù)據(jù)支撐。