袁軼峰，蔡虎志，王敏，李琰，歐陽過，陳新宇

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是各種原因引起慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙的臨床綜合征，日益成為世界范圍內(nèi)公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題。慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是CKD進(jìn)展至后期的共同結(jié)局，具有高患病率、高致殘率特點[1]。目前尚缺乏有效延緩CRF進(jìn)展的措施，導(dǎo)致CRF患者預(yù)后不良。腎臟纖維化是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能受損的重要途徑[2-4]，抑制腎臟纖維化是延緩CRF進(jìn)展的有效措施[5-6]。NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在多種疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。溫陽振衰顆粒由陳新宇教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗擬定，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫陽振衰顆?？筛纳坡阅I功能衰竭患者腎纖維化[9]。本實驗基于NLRP3/Caspase-1通路觀察溫陽振衰顆粒對腎間質(zhì)纖維化大鼠細(xì)胞焦亡及腎臟纖維化的影響，進(jìn)一步明確其治療腎臟纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（220±20）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物房，溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，光暗周期12 h。自由攝食飲水。

1.2 藥物

溫陽振衰顆粒（制附片、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草以10∶10∶15∶6∶15∶10∶10比例配伍），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，8 g/袋，以生理鹽水溶解，配制成濃度為0.072 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

PBS（上海Wellbio，貨號WB00001），NLRP3抑制劑MCC950（美國AbMole，貨號M04359），蘇木素（上海Wellbio，貨號WB03008B），伊紅（上海Wellbio，貨號WB03008A），DAB試劑盒（北京中杉金橋，貨號ZLI-9018），二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號PV-9000），肌酐試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號C011-2-1），尿素氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號C013-2-1），Tris（德國Sigma，貨號V900483），RIPA 裂解液（上海碧云天，貨號P0013B），蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)，貨號583794），磷酸酶抑制劑（北京普利萊，貨號P1260），顯影液（上海佳信，貨號BW-61），定影液（上海佳信，貨號BW-62），Super ECL Plus超敏發(fā)光液（美國Advansta，貨號K-12045-D50），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)，貨號CW2569），Trizol（美國Thermo，貨號15596026），Ultra SYBR Mixture（北京康為世紀(jì)，貨號CW2601），F(xiàn)AM-YVAD-FMK（英國Abcam，貨號ab219935），Caspase-1、白細(xì)胞介素（IL）-18、β-actin、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）抗體（美國Proteintech，貨號分別為22915-1-AP、10663-1-AP、60008-1-Ig、21898-1-AP、55135-1-AP、66761-1-Ig），IL-1β 抗 體 （ 美 國 Invitrogen， 貨 號 PA5-88078），NLRP3抗體（英國Abcam，貨號ab214185），HRP-標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（美國Proteintech，貨號SA00001-1），HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Proteintech，貨號SA00001-2）。YD-315切片機(jī)，浙江金華益迪試驗器材；BMJ-A包埋機(jī)，常州中威電子儀器；BA210T顯微鏡，廈門Motic；H1650R臺式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀；DYY-6C電泳儀，北京六一；DYCZ-40D轉(zhuǎn)膜儀，北京六一；BioPrep-24 生物樣品均質(zhì)儀，杭州奧盛；Chemiscope6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，廣州勤翔；Quant Studio1熒光定量RCP儀，美國Thermo。

1.4 分組、造模及給藥

50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量分層，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、抑制劑組和溫陽振衰顆粒組，每組10只。參考文獻(xiàn)[10]建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，左中腹部切約1 cm縱向切口，鈍性分離皮下組織及肌層，暴露左側(cè)腎臟，游離左側(cè)輸尿管，穿線結(jié)扎并剪斷左側(cè)輸尿管，逐層縫合切口?？瞻捉M不予處理，假手術(shù)組只暴露腎臟，游離左側(cè)輸尿管，不做結(jié)扎，其余操作相同。

各組分別于造模后次日給藥，給藥劑量參考人與大鼠體表面積折算，抑制劑組予1 mg/mL MCC950生理鹽水溶液[20 mg/（kg·d）]腹腔注射，溫陽振衰顆粒組予溫陽振衰顆粒溶液1.44 g/（kg·d）灌胃，每日2次，模型組、假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)14 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 血肌酐、血尿素氮含量

末次給藥后禁食8 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血3 mL，3 000 r/min離心15 min，收集血清，試劑盒檢測血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）含量。

1.5.2 腎組織病理觀察

取血后摘取左腎，取部分腎組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE和Masson染色觀察組織病理變化及膠原纖維分布情況。

1.5.3 免疫組化檢測

腎組織石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)后，滴加TGF-β1一抗（1∶200）、α-SMA一抗（1∶400）、Col-Ⅰ一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。光鏡下觀察，陽性染色為黃色至棕褐色，每張切片選取3個陽性表達(dá)區(qū)域拍照，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性表達(dá)的平均光密度。

1.5.4 Western blot檢測

取適量腎組織，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉-PBST溶液，室溫封閉60 min，4 ℃過夜。加入NLRP3一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶1 000）、IL-18一抗（1∶2 000）、IL-1β 一抗（1∶2 000）、β-actin 一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶6 000）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶6 000），室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀測定蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達(dá)量。

1.5.5 RT-PCR檢測

取少量腎組織，加入Trizol 充分研磨，提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR法進(jìn)行RT-qPCR實驗。使用Primer Express 5.0 軟件設(shè)計引物（見表1），以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.6 細(xì)胞焦亡檢測

腎組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后，滴加FAMYVAD-FMK（1∶50）熒光染料（綠色）、碘化丙啶（紅色），37 ℃恒溫箱孵育1 h，洗滌液沖洗3 min×3次；加入DAPI（藍(lán)色），37 ℃染核10 min，PBS沖洗5 min×3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡情況，藍(lán)色為活細(xì)胞，焦亡細(xì)胞可見綠色+紅色熒光，計算細(xì)胞焦亡率。細(xì)胞焦亡率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0和DPS14.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用表示，多組間比較用方差分析，Levene檢驗方差齊性，方差齊用LSD 法，方差不齊用Tamhane"s T2法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況

空白組及假手術(shù)組大鼠腎臟無腫脹，腎臟顏色有光澤，輸尿管無擴(kuò)張；模型組大鼠左側(cè)腎臟腫大、顏色偏淺，左側(cè)輸尿管結(jié)扎處至腎臟擴(kuò)張明顯，左腎明顯大于右腎，腎實質(zhì)變薄；抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠左側(cè)腎臟腫脹程度較模型組減輕，左側(cè)輸尿管結(jié)扎處以上擴(kuò)張。

2.2 溫陽振衰顆粒對模型大鼠血肌酐、血尿素氮含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠SCr、BUN含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠SCr、BUN 含量顯著減少（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠SCr、BUN含量比較（）

表2 各組大鼠SCr、BUN含量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

BUN/（mmol/L）8.85±2.70 8.70±2.24 18.46±2.69△△14.82±1.79**14.28±2.23**組別空白組假手術(shù)組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組只數(shù)10 10 10 10 10 SCr/（μmol/L）31.88±4.91 29.48±5.10 61.57±6.38△△46.22±7.33**45.44±8.45**

2.3 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織病理變化的影響

HE及Masson染色顯示，空白組和假手術(shù)組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理改變；模型組大鼠可見腎小管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化明顯，腎小球形態(tài)破壞，結(jié)構(gòu)不完整，大量炎性細(xì)胞浸潤；抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎小管、腎小球損傷程度較模型組減輕，腎間質(zhì)纖維化減少。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE染色，×400）

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×400）

2.4 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生子因子-β1、α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

陽性染色主要表達(dá)于遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見圖3～圖5、表3。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)比較（，平均光密度，×10-3）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)比較（，平均光密度，×10-3）

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組Col-Ⅰ2.1±0.5 1.5±0.6 34.0±9.0△△18.6±5.0**15.6±7.1**只數(shù)10 10 10 10 10 TGF-β1 0.6±0.4 0.9±1.2 14.6±5.9△△5.6±3.1**4.3±1.7**α-SMA 0.4±0.2 0.6±0.4 14.1±4.3△△5.9±2.7**4.3±1.1**

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠腎組織Col-Ⅰ陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.5 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織NOD樣受體蛋白3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-18、白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表 達(dá)顯著升高 （P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見圖6、表4。

表4 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)比較（，相對表達(dá)量）

表4 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)比較（，相對表達(dá)量）

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組IL-1β 0.27±0.06 0.29±0.07 0.76±0.13△△0.50±0.12**0.54±0.11**只數(shù)10 10 10 10 10 NLRP3 0.26±0.07 0.26±0.07 0.69±0.13△△0.51±0.10**0.44±0.09**Caspase-1 0.28±0.07 0.30±0.06 0.79±0.12△△0.53±0.08**0.55±0.06**IL-18 0.27±0.07 0.27±0.09 0.76±0.13△△0.52±0.12**0.48±0.15**

圖6 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白免疫印跡

2.6 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織NOD樣受體蛋白3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-18、白細(xì)胞介素-1β mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達(dá)比較（）

表5 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組IL-1β 0.88±0.27 0.90±0.40 3.71±1.37△△2.07±0.80**2.31±0.91**只數(shù)10 10 10 10 10 NLRP3 1.08±0.18 1.05±0.32 3.55±0.36△△2.27±0.32**2.03±0.50**Caspase-1 0.83±0.16 1.03±0.27 3.74±0.87△△1.80±0.54**1.71±0.34**IL-18 0.95±0.28 0.98±0.21 4.19±0.62△△2.18±0.16**2.37±0.36**

2.7 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織細(xì)胞焦亡的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織細(xì)胞焦亡率顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織細(xì)胞焦亡率顯著減少（P<0.01）。見表6、圖7。

表6 各組大鼠腎組織細(xì)胞焦亡率比較（，%）

表6 各組大鼠腎組織細(xì)胞焦亡率比較（，%）

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

細(xì)胞焦亡率組別 只數(shù)0.90±0.49 0.76±0.40 12.54±3.81△△2.82±0.71**2.78±0.99**空白組假手術(shù)組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組10 10 10 10 10

圖7 各組大鼠腎組織細(xì)胞焦亡陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

3 討論

CKD屬中醫(yī)學(xué)“水腫”“癃閉”“關(guān)格”等范疇，其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實，以腎元虛衰為本，兼具水濕、痰濁、瘀血等標(biāo)實之證?！端貑?陰陽應(yīng)象大論篇》有“陽化氣，陰成形”，腎元虧虛則水液不運(yùn)，飲溢于肌表則發(fā)為“水腫”，濕邪濁毒壅滯于下焦則發(fā)為“癃閉”，水谷不下則變?yōu)椤瓣P(guān)格”，皆由陽氣虧虛所致。腎為先天之本，為“五臟陰陽之本”，故腎陽為一身陽氣之根本。CRF病位在腎，涉及肺、脾、肝等臟腑，陽氣虧虛在疾病的發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用。溫陽振衰顆粒由制附片、紅參、干姜、茯苓、五味子、麥冬、甘草組成。制附片溫通陽、暖命門、溫坎水、破陰凝，紅參大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫，二者合而為君；干姜大熱無毒，守而不走，茯苓健脾滲濕，可補(bǔ)后天脾土，二者相伍則土得火生而中氣可復(fù)，火得土覆而火可久存，為臣藥；另以麥冬養(yǎng)陰生津，五味子五味皆備而酸獨(dú)勝，以五味子之酸斂固澀固護(hù)陽氣、斂火歸元，使陽氣不外泄，為佐藥；甘草味甘性平，一可減附子之毒，二則調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏溫陽益氣、固陽化陰之功。

腎臟纖維化是各種CKD的共同病理結(jié)局，其中炎性細(xì)胞浸潤引發(fā)的免疫反應(yīng)在腎纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。近年研究表明，多種腎臟炎癥反應(yīng)可激活NLRP3炎性小體[12-13]，通過IL-1等促炎性細(xì)胞因子觸發(fā)先天性免疫防御，以響應(yīng)如感染、代謝失調(diào)等危險信號。同時，NLRP3/Caspase-1炎癥通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在腎臟疾病中也發(fā)揮著重要作用[14-15]。細(xì)胞焦亡不同于細(xì)胞凋亡、壞死、脹亡和自噬，表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂并釋放促炎性細(xì)胞內(nèi)容物，是對刺激因素的一種過度應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源性或外源性信號刺激時，模式識別受體通過識別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式導(dǎo)致炎性小體多蛋白復(fù)合物組裝及Caspase-1前體活化，活化的Caspase-1一方面誘導(dǎo)焦亡發(fā)生，另一方面剪切細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18 使其成熟和分泌IL-1β和IL-18，IL-1β和IL-18釋放到胞外以介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[16-17]。

在腎臟非免疫性實質(zhì)細(xì)胞中，小管上皮細(xì)胞可通過激活NLRP3炎性小體表達(dá)和釋放IL-18，由此觸發(fā)小管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和焦亡[17]。本研究結(jié)果也表明，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1表達(dá)升高，炎癥因子IL-18、IL-1β表達(dá)升高，細(xì)胞焦亡率增加，纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)升高，腎間質(zhì)纖維化明顯。使用NLRP3 抑制劑MCC950 干預(yù)后，大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1表達(dá)降低，炎癥因子及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)降低，細(xì)胞焦亡率減少，腎間質(zhì)纖維化有所改善，與溫陽振衰顆粒組結(jié)果一致。表明NLRP3/Caspase-1炎癥通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在腎間質(zhì)纖維化過程中起重要作用，溫陽振衰顆?？赡芡ㄟ^干預(yù)NLRP3/Caspase-1通路介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而抑制腎臟纖維化，改善腎功能。