郭 濤，宋 寧，孫玉琪，田佳琪，唐 婕，孫榕婍，蔣英英,

1.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；4.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濰坊 261035

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常見的腫瘤，也是主要的致死性腫瘤之一［1］。隨著臨床診療技術(shù)水平的不斷提高，HCC的治療和管理取得了顯著進(jìn)展，但其高復(fù)發(fā)率和低生存率的現(xiàn)狀依然如故，且新增病例仍呈上升趨勢［2］。對于HCC的病因，目前已知其與多種因素有關(guān)，包括乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染、非乙醇性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）、酗酒等引起的肝纖維化以及吸煙、黃曲霉素接觸等飲食環(huán)境因素［3］。

另一方面，隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的深入，HCC進(jìn)展過程中越來越多的分子失調(diào)事件被證實，從蛋白到核酸再到小分子化合物。這些物質(zhì)的失調(diào)往往與HCC的發(fā)生、發(fā)展存在密不可分的關(guān)系，有些甚至直接參與HCC發(fā)生、發(fā)展的始終［4］。近年來，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）與腫瘤的關(guān)系逐漸成為新的研究熱點。LncRNA是指長度大于200個核苷酸的鏈狀RNA分子，其由基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不具備蛋白翻譯潛能［5］。在HCC中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種lncRNA失調(diào)表達(dá)并行使多種分子功能來調(diào)控HCC的發(fā)生、發(fā)展［6］。其作用涉及基因生命周期的各個方面，包括轉(zhuǎn)錄、剪接、RNA衰變和翻譯；同時參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、血管生成和耐藥性調(diào)節(jié)［7］。

有研究報道，作為一種功能性的lncRNA，長基因間非蛋白編碼RNA 671（long intergenic non-protein coding RNA 671，LINC00671）在腫瘤中具有抑癌潛能，但其對HCC的具體影響和作用機(jī)制尚未見報道。本項目擬探討LINC00671對HCC體外腫瘤生物學(xué)行為的影響并初步了解其作用機(jī)制，旨在為HCC患者尋找新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

HCC相關(guān)細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，10%的胎牛血清購自美國Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱和LipofectamineTM2000購自美國ThermoFisher公司，反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、過表達(dá)質(zhì)粒及LINC00671探針均購自廣州市銳博生物科技有限公司，碘化丙啶購自國藥（上海）國際醫(yī)藥衛(wèi)生有限公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜和transwell小室購自美國Millipore公司，ECM550基質(zhì)膠購自美國Chemicon公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo公司。

所有細(xì)胞均采用高糖DMEM加10%的胎牛血清組成的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑采用無血清DMEM混合LipofectamineTM2000進(jìn)行ASO及LINC00671過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

使用TRIzol試劑（美國ThermoFisher公司）進(jìn)行細(xì)胞總RNA分離提取，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］在體外進(jìn)行R N A 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將R N A 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)采用2 μL反應(yīng)模板的20 μL反應(yīng)體系，預(yù)變性參數(shù)：95 ℃、5 min；循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，并進(jìn)行35個循環(huán)。整個反應(yīng)在Bio-rad 3.0 PCR儀上進(jìn)行，引物如下：LINC00671上游引物5'-CCTGGGCTTCCTGCTGAGAC-3'，LINC00671下游引物5'-CGTCCACACCTCTG CTCCTTC -3 '；c-myc上游引物5'-CAAGAGGCGAACACACAACGTCT-3'，c-myc下游引物5'-AACTGTTCTCGTCGTTT CCGCAA-3'；選擇GAPDH為內(nèi)參，其上游引物5'-GGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，下游引物為5'-CCTTGCCCACAGCCTTG-3'；實驗結(jié)果取2-ΔΔCT進(jìn)行比較。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

將提取的細(xì)胞總蛋白加入蛋白緩沖液（美國Sigma-Aldrich公司），95 ℃變性10 min。蛋白樣品用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加入4 ℃一抗（c-myc、GAPDH為1∶2000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）溫育過夜，加入對應(yīng)二抗（1∶2000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。暗室中用ECL發(fā)光液（美國MedChemExpress公司）顯影條帶并壓片曝光。

1.4 RNA熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

細(xì)胞在預(yù)雜交緩沖液處理后，雜交緩沖液中稀釋LINC00671探針混合，并在37 ℃下培養(yǎng)溫育過夜。DNA在密封前用DAPI染色10 min。在相同的光學(xué)強(qiáng)度條件下，用激光共聚焦成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）觀察LINC00671亞細(xì)胞定位。

1.5 細(xì)胞增殖實驗

采用CCK-8轉(zhuǎn)染細(xì)胞并接種在24孔板中，每孔2×104～5×104個細(xì)胞，常規(guī)環(huán)境中培養(yǎng)，在0、24、48和72 h于450 nm波長的D值下評估細(xì)胞增殖情況。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

對于凋亡實驗，選擇流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行定量比較。細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理后，利用膜聯(lián)蛋白Ⅴ和碘化丙啶對培養(yǎng)物進(jìn)行30 min的雙重染色。收集培養(yǎng)物，并通過配備CellQuest 3.3計算機(jī)程序的流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞凋亡情況，凋亡率以早期凋亡加晚期凋亡計算。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗

細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后，通過在培養(yǎng)板（1×106）中使用100 μL塑料移液管尖端進(jìn)行垂直劃痕。劃痕后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察劃痕大小并在光學(xué)顯微鏡下拍照。以（0～24 h）/0 h為愈合百分比定量，測量虛線區(qū)域之間的細(xì)胞垂直遷移寬度比來評估腫瘤細(xì)胞遷移情況。

1.8 細(xì)胞侵襲實驗

將轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞接種于帶有8 μm孔徑聚碳酸酯過濾器的transwell小室內(nèi)，并在此之前于底部鋪上ECM550基質(zhì)膠。將裝有無血清培養(yǎng)基的小室置于含完全培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)24 h后，取出小室，細(xì)胞固定并染色拍照。

1.9 在線生物信息學(xué)分析系統(tǒng)

LINC00671在HCC及正常肝組織中的表達(dá)、預(yù)后及相關(guān)性分析在GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis；http://gepia2.cancerpku.cn/#index）及starBase 3.0（Encyclopedia of RNA Interactomes，ENCORI；https://starbase.sysu.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行［8-10］；LINC00671的亞細(xì)胞定位通過lncAtlas網(wǎng)站（https://lncatlas.crg.eu/）進(jìn)行預(yù)測［11］；此外，LINC00671下游Hoogsteen堿基配對DNA則通過LongTarget網(wǎng)站（http://lncrna.smu.edu.cn/show/DNATriplex）進(jìn)行［12］；同時通過UCSC網(wǎng)站（http://genome.ucsc.edu/）調(diào)取并查詢下游基因c-myc啟動子序列信息［13］。

1.10 甲基化DNA免疫共沉淀PCR（methylated DNA immunoprecipitation-PCR，MeDIPPCR）

將細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后，提取基因組DNA，超聲碎裂至0.3-1.0 kb長度。使用5-甲基胞嘧啶抗體（比利時Eurogentec公司）進(jìn)行甲基化沉淀，并在VⅡA 7 real-time PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）分析純化的DNA。對應(yīng)啟動子甲基化的變化可通過測量免疫沉淀DNA的數(shù)量，其PCR所需的c-myc上游引物為5'-CCCATATTCTCCCGTCTAGCAC-3'，下游引物為5'-CCAATTTCTCAGCCAGGTTTCA-3'；將該值與總input DNA的數(shù)量（MeDIP/input）進(jìn)行比較來確定。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用表示。采用t檢驗分析各組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織及細(xì)胞間LINC00671表達(dá)差異及亞細(xì)胞定位

我們利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了LINC00671在HCC組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，LINC00671在HCC組織中的表達(dá)顯著下調(diào)（圖1A）。隨后我們在starBase數(shù)據(jù)庫中分析了LINC00671對生存預(yù)后的影響，我們發(fā)現(xiàn)LINC00671高表達(dá)可能預(yù)示著較好的預(yù)后（P＜0.05，圖1B）。而在體外細(xì)胞系中，我們對比了正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系與HCC細(xì)胞系中LINC00671的表達(dá)差異。RTFQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)LINC00671在HCC細(xì)胞系中顯著下調(diào)，同時在不同的HCC細(xì)胞系中，LINC00671表達(dá)水平存在差異。其在Huh7細(xì)胞中表達(dá)相對較高，而在HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平較低（圖1C）。隨后通過lncAtlas數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00671主要分布于細(xì)胞核內(nèi)（圖1D）。為了進(jìn)一步證實這一預(yù)測，我們通過RNA FISH實驗對LINC00671亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析，結(jié)果提示LINC00671確實主要集中于細(xì)胞核中（圖1E）。

圖1 LINC00671在HCC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位Fig.1 Expression and subcellular localization of LINC00671 in HCC tissues and hepatoma cell lines

2.2 LINC00671可以抑制HCC細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡

以上結(jié)果證實了LINC00671在Huh7細(xì)胞中表達(dá)較高而在HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平較低，由此我們選取Huh7細(xì)胞系進(jìn)行敲減實驗并選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)實驗。我們首先在體外對Huh7進(jìn)行了ASO轉(zhuǎn)染，RTFQ-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASO對LINC00671敲低效果較好（圖2A）。同時，在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LINC00671過表達(dá)質(zhì)粒后，RTFQ-PCR結(jié)果提示過表達(dá)效果明顯（圖2A）。在此基礎(chǔ)上，我們分別觀察了Huh7和HepG2細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果證實當(dāng)LINC00671敲低后，Huh7細(xì)胞增殖增加（圖2B）；而LINC00671過表達(dá)后，HepG2細(xì)胞增殖明顯受到抑制（圖2C）。此外，流式細(xì)胞式術(shù)實驗結(jié)果顯示，LINC00671被敲低后，Huh7細(xì)胞凋亡顯著減少（圖2D）；而在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)LINC00671后，其凋亡率顯著增加（圖2E）。

圖2 LINC00671能夠影響HCC增殖和凋亡Fig.2 The regulation of LINC00671 on proliferation and apoptosis in hepatoma cells

2.3 LINC00671抑制HCC遷移和侵襲

為了進(jìn)一步驗證LINC00671對HCC遷移和侵襲的影響，我們在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了ASO并在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)了LINC00671，隨后進(jìn)行細(xì)胞劃痕及transwell實驗觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，LINC00671敲低后，Huh7細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)（圖3A）；而LINC00671表達(dá)增加后，HepG2細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制（圖3B）。此外，LINC00671敲降后，Huh7細(xì)胞侵襲能力明顯增加（圖3C）；而過表達(dá)LINC00671后，其可以明顯抑制HepG2細(xì)胞侵襲（圖3D）。

圖3 LINC00671抑制HCC遷移和侵襲Fig.3 LINC00671 inhibits migration and invasion of hepatoma cells

2.4 LINC00671可以通過介導(dǎo)啟動子甲基化下調(diào)c-myc表達(dá)

通過生物信息學(xué)預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)LINC00671與癌基因c-myc啟動子區(qū)可能存在Hoogsteen配對結(jié)合（圖4A）。這一結(jié)果提示c-myc可能是LINC00671的下游靶基因。我們隨后在以上數(shù)據(jù)庫中分析了LINC00671與c-myc表達(dá)的相關(guān)性，Spearman分析提示LINC00671與c-myc在HCC組織中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（圖4B～4C）。這一結(jié)果提示c-myc可能是LINC00671的靶基因且可能被LINC00671負(fù)向調(diào)控。為了明確c-myc是否是LINC00671下游靶基因，我們在Huh7細(xì)胞中敲低了LINC00671并在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)了LINC00671。隨后通過RTFQ-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LINC00671確實可以下調(diào)c-myc的表達(dá)（圖4D～4E）。已有研究［14-15］指出，核內(nèi)lncRNA可以介導(dǎo)下游靶基因啟動子區(qū)甲基化修飾從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。因此，我們用同樣的方法轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞后，利用MeDIP-PCR檢測了c-myc啟動子區(qū)甲基化水平變化。結(jié)果提示LINC00671可以顯著升高c-myc啟動子甲基化水平（圖4F）。由此可見，LINC00671可能在細(xì)胞核內(nèi)通過介導(dǎo)c-myc啟動子甲基化抑制c-myc表達(dá)，從而抑制了HCC的生物學(xué)行為。

圖4 LINC00671對c-myc的調(diào)控Fig.4 The regualtion of LINC00671 on c-myc

3 討 論

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和研究的逐漸深入，越來越多的lncRNA分子被證明在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。雖然目前有關(guān)lncRNA的文章越來越多，但仍有許多l(xiāng)ncRNA的生物功能未知，并且同一lncRNA在不同腫瘤中的作用和機(jī)制可能也不盡相同。因此對于這類分子的研究將為未來腫瘤的分子診斷和分子治療提供理論證據(jù)。

LINC00671定位于人體第17號染色體，目前已知僅有一個轉(zhuǎn)錄本，成熟體由1844個核苷酸組成。當(dāng)前對于LINC00671的報道并不多，在胰腺癌中，LINC00671被證明可能作為臨床分子標(biāo)志與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)［16］。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)GEPIA數(shù)據(jù)庫提示LINC00671在HCC組織中出現(xiàn)下調(diào)，并且starBase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)其可能與HCC患者預(yù)后生存有關(guān)，即LINC00671高表達(dá)可能預(yù)示著較好的預(yù)后。機(jī)制上，其被證明能夠通過發(fā)揮內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）作用吸附miRNA分子從而通過多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制胰腺癌進(jìn)展［17-18］。在甲狀腺癌中，LINC00671受到轉(zhuǎn)錄因子STAT3的調(diào)控，同時通過抑制糖酵解抑制甲狀腺癌進(jìn)展［19］。近期還有研究［20］報道了LINC00671在腎癌中同樣通過ceRNA作用抑制了腎癌的進(jìn)展。以上幾項研究雖然從不同癌種揭示了LINC00671的作用，但僅有一項研究進(jìn)行了LINC00671的亞細(xì)胞定位驗證［19］。本研究證明了LINC00671可以顯著抑制HCC的生物學(xué)行為，這與先前的幾篇報道一致。不同于其他腫瘤，LINC00671在HCC中雖然也發(fā)揮抑癌效應(yīng)，但其主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。因此，其可能有著與之前完全不同的分子機(jī)制。

通過生物信息學(xué)預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)LINC00671可能與癌基因c-myc啟動子區(qū)存在Hoogsteen配對從而介導(dǎo)后者啟動子甲基化修飾，這提示c-myc可能是LINC00671的靶基因。而數(shù)據(jù)庫分析同樣發(fā)現(xiàn)LINC00671與c-myc在HCC組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步實驗也證實：LINC00671可以通過介導(dǎo)c-myc啟動子甲基化從而下調(diào)后者表達(dá)。C-myc基因（又稱MYC）是一個公認(rèn)的癌基因，其在不同腫瘤中均可扮演促癌基因的角色。從調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄到影響染色體穩(wěn)定性［21］，c-myc幾乎在所有腫瘤中均存在促癌作用而被稱為腫瘤的主宰基因之一［22］。在HCC中，c-myc同樣可以在腫瘤細(xì)胞生長、增殖、遷移及侵襲等多方面影響HCC的生物學(xué)行為［23］。而本研究發(fā)現(xiàn)LINC00671可以在細(xì)胞核內(nèi)介導(dǎo)c-myc啟動子甲基化從而下調(diào)c-myc基因的表達(dá)，而這直接導(dǎo)致了LINC00671抑制HCC的生物學(xué)行為，即LINC00671抑制HCC進(jìn)展的分子機(jī)制。

本研究揭示了LINC00671在HCC中發(fā)揮的作用，初步探討了其抑制HCC進(jìn)展的分子機(jī)制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LINC00671在腫瘤中可以發(fā)揮核RNA的作用并可能通過介導(dǎo)啟動子甲基化修飾從而下調(diào)靶基因的表達(dá)。

本研究也存在部分不足之處：首先，從臨床角度，雖然我們證明了LINC00671在HCC細(xì)胞系中有明顯下調(diào)，但數(shù)據(jù)庫納入的樣本量依舊有限并且其納入病例可能均存在潛在偏倚。因此，關(guān)于LINC00671的臨床意義仍需要大樣本臨床數(shù)據(jù)深入探究。其次，LINC00671對HCC的影響，包括生長與轉(zhuǎn)移，仍缺乏體內(nèi)動物實驗的進(jìn)一步驗證；最后，在機(jī)制方面，我們雖然發(fā)現(xiàn)LINC00671可能通過調(diào)控c-myc來抑制HCC的生物學(xué)行為，但其調(diào)控的深入機(jī)制，包括具體結(jié)合位點、互作的甲基化酶及組蛋白甲基化位點均仍有待未來進(jìn)一步研究。

綜上所述，LINC00671可以顯著影響HCC的生物學(xué)行為，即其可以在體外顯著抑制HCC進(jìn)展；同時，其可以介導(dǎo)癌基因c-myc啟動子甲基化修飾從而導(dǎo)致后者下調(diào)表達(dá)，這可能是LINC00671抑制HCC的重要分子機(jī)制。

利益沖突聲明：所有作者聲明均不存在利益沖突。