鄭揚(yáng)康 王鵬禹 趙力 徐浩 孫悅禮 趙永見(jiàn) 梁倩倩* 王擁軍*

1．上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 >2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032 3. 筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 4．上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

淋巴管系統(tǒng)具有免疫監(jiān)控和維持體液平衡的重要生理功能[1]。在皮膚、筋膜、肌肉組織和骨膜等器官含有較豐富的淋巴管，可將組織間液和代謝廢物回流至淋巴循環(huán)[2-4]。Szczesny等[5]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性骨折早期會(huì)出現(xiàn)淋巴管“瘀滯”，淋巴管回流功能若未及時(shí)恢復(fù)會(huì)繼發(fā)創(chuàng)傷后淋巴水腫[6-7]。Arslan等[8]將大鼠后肢回流淋巴管和淋巴結(jié)摘除，成功建立慢性淋巴水腫模型后再造成脛骨骨折，發(fā)現(xiàn)慢性淋巴水腫會(huì)延遲骨折愈合。因此，及時(shí)恢復(fù)創(chuàng)傷后淋巴管回流，可能是促進(jìn)骨折愈合的潛在靶點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨折早期以“活血化瘀、消腫止痛”為治療原則[9]，身痛逐瘀湯是清代名醫(yī)王清任的五逐瘀湯之一，臨床常用于骨折伴有明顯疼痛患者[10-13]。身痛逐瘀湯能否通過(guò)改善淋巴管回流功能以促進(jìn)骨修復(fù)的機(jī)制尚需深入研究。因此，本研究擬通過(guò)建立脛骨骨折復(fù)合髓內(nèi)固定小鼠模型，采用身痛逐瘀湯灌胃，從疏通淋巴管瘀滯角度探究身痛逐瘀湯促進(jìn)骨修復(fù)的藥效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物：6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL /6小鼠共40只，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬) 2018-0004，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)室的溫度和濕度各控制在23 ℃和60 %，保證充足的日照、鼠糧和飲用水。本研究通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批號(hào)為PZSHUTCM211101023。

1.1.2藥物與試劑：身痛逐瘀湯由秦艽3 g、川芎6 g、桃仁9 g、紅花9 g、甘草6 g、羌活3 g、沒(méi)藥6 g、當(dāng)歸9 g、五靈脂6 g、香附3 g、牛膝9 g、地龍6 g組成[11]，上述中藥材均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。按照小鼠與人體表面積等效劑量比值為9.1計(jì)算小鼠(20 g)與人(60 kg)的臨床用藥劑量，則身痛逐瘀湯組小鼠灌胃身痛逐瘀湯的生藥濃度為1.375 g/mL。取上述中藥3劑加水浸泡過(guò)夜，共煎煮兩次，去除藥渣后混合兩次湯劑，分裝后于50 mL離心管中并-80 ℃冷庫(kù)保存。

異氟烷(沃瑞德，中國(guó))，Veet脫毛膏(利潔時(shí)，中國(guó))，吲哚菁綠(Acorn，美國(guó))，TM-100型醫(yī)用超聲耦合劑(津亞，中國(guó))。

1.1.3主要儀器：vivaCT40小鼠Micro-CT 掃描機(jī)(Scanco Medical AG公司，瑞士)；電子數(shù)字稱(KUBEI，中國(guó))；多通道小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(Matrx VMR，美國(guó))；近紅外成像系統(tǒng)(Olympus MVX10，日本)；微量注射器(HAMILTON，中國(guó))，1 mL無(wú)菌注射器(0.45×16 mm，山東威高)；ElectroForce 3200生物力學(xué)機(jī)(TA-Bose，美國(guó))；痛閾測(cè)量?jī)x(Ugo Basile，意大利)，自制軟組織腫脹測(cè)量?jī)x。

1.2 分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法標(biāo)記小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水組和身痛逐瘀湯組，每組各20只。造模前兩天將小鼠右后肢用Veet脫毛膏脫毛，避免損傷皮膚。右側(cè)脛骨骨折復(fù)合髓內(nèi)固定造模方法：小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，取仰臥位，從小鼠右膝中點(diǎn)以下作約1.5 cm縱行切口，暴露脛骨中段外側(cè)緣，鈍性分離脛骨周圍肌肉，避免損傷后肢回流淋巴管與淋巴結(jié)。將1 mL無(wú)菌注射器針頭從脛骨平臺(tái)中點(diǎn)穿入，沿脛骨長(zhǎng)軸刺入骨髓腔約1.5 cm，回退針頭至脛骨平臺(tái)近側(cè)0.2 cm，用刀片輕輕割斷脛骨中段，骨折斷端對(duì)合齊后將針頭再向下插入髓腔至髓內(nèi)固定。當(dāng)髓內(nèi)針與骨骼髓腔內(nèi)壁接觸緊密，輕輕順時(shí)或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)髓內(nèi)針，可見(jiàn)踝關(guān)節(jié)隨同方向轉(zhuǎn)動(dòng)即證明對(duì)位對(duì)線良好，造模成功。剪斷外露于脛骨平臺(tái)的針帽，縫合皮膚并涂抹抗菌藥膏以預(yù)防感染[14]。

1.3 干預(yù)方法

造模后30 min后，身痛逐瘀湯組給予濃度1.375 g/mL身痛逐瘀湯藥液0.2 mL/d，生理鹽水組給予同體積0.2 mL的0.9 % NaCl溶液，兩組均連續(xù)灌胃5 d。至造模后14 d和28 d分別取骨折側(cè)脛骨進(jìn)行Micro-CT掃描和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目與方法

1.4.1近紅外成像監(jiān)測(cè)后肢淋巴管回流功能：在術(shù)前及術(shù)后第1天和7天，分別皮內(nèi)注射小鼠足底0.2 μg/mL的吲哚菁綠溶液5 μL，即刻采用NIR-ICG淋巴成像技術(shù)記錄足底熒光信號(hào)標(biāo)記為0 h，24 h后再次記錄足底熒光信號(hào)標(biāo)記為24 h。運(yùn)用Image J軟件定量分析圖片中ICG的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算0 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的足底ICG熒光強(qiáng)度差值，即足底ICG清除率=(S0 h-S24 h)/S0 h×100 %[15]。

1.4.2改良肢體腫脹測(cè)量?jī)x檢測(cè)骨折處軟組織腫脹度：造模前及成功后第1天、2天、3天、5天、7天，將小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)以下完全浸入新型實(shí)用測(cè)腫儀，測(cè)量3次后取平均值記為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算骨折處軟組織腫脹度=造模后腫脹體積/造模前腫脹體積×100 %。

1.4.3足底熱敏痛閾檢測(cè)：造模后第1天，將提前禁食禁水的小鼠提前放入痛閾測(cè)量?jī)x的封閉小室適應(yīng)2 h，待其安靜后，使用30 %的輻射熱誘導(dǎo)小鼠縮爪反應(yīng)。當(dāng)小鼠感到疼痛并抬起后爪時(shí)，儀器自動(dòng)記錄小鼠的爪子收縮時(shí)對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間。每只老鼠需重復(fù)測(cè)試5次。去掉5次測(cè)量結(jié)果的最高與最低值后，剩余3個(gè)值的平均值即為每只小鼠的平均反應(yīng)時(shí)間[16]。

1.4.4Micro-CT掃描：取75 %乙醇處理過(guò)的小鼠脛骨組織標(biāo)本，放入 Micro-CT儀檢測(cè)艙，進(jìn)行X線掃描，觀察各組小鼠脛骨骨折愈合及骨痂形成情況。隨后對(duì)脛骨樣本(脛骨平臺(tái)至踝關(guān)節(jié)之間的部位)進(jìn)行斷層掃描成像，檢測(cè)參數(shù)：電壓70 kV、電流142 μA、9 μm分辨率，0.5 mm鋁過(guò)濾器。應(yīng)用配套軟件三維重建骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對(duì)骨痂的骨小梁參數(shù)進(jìn)行定量分析[14]。

1.4.5三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：取材后小心地將脛骨標(biāo)本剔除所有附著肌肉，并用生理鹽水溶液浸泡后的紗布包裹于4 ℃保存。待所有標(biāo)本收集齊后，將標(biāo)本逐個(gè)平放于力學(xué)分析機(jī)器內(nèi)，保持骨痂部位統(tǒng)一角度放置于測(cè)試儀中點(diǎn)，鎖定標(biāo)本兩端，打開電腦設(shè)置程序，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析。兩組獨(dú)立數(shù)據(jù)如果服從正態(tài)分布且方差齊，則采用t檢驗(yàn)；若方差不齊則采用t’檢驗(yàn)。兩組獨(dú)立數(shù)據(jù)如果不服從正態(tài)分布，則使用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。兩組多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析和簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)下肢淋巴管回流功能的影響

圖1顯示，造模后第1天和第7天，身痛逐瘀湯組殘留的ICG熒光染料顯著少于生理鹽水組。表1顯示，造模后第1天和第7天，身痛逐瘀湯組骨折側(cè)足底NIR-ICG清除率均顯著高于生理鹽水組(P<0.001)。

圖1 兩組小鼠骨折側(cè)足底NIR-ICG的代表性圖片F(xiàn)ig.1 Representative images of plantar ICG clearance at fractured hindlimbs by NIR

表1 兩組小鼠骨折側(cè)足底ICG清除率比較(%)Table 1 Plantar ICG clearance at fractured hindlimb(%)

2.2 對(duì)骨折斷端軟組織腫脹度的影響

圖2顯示，骨折后第2天，和身痛逐瘀湯組對(duì)比，生理鹽水組骨折側(cè)脛骨和踝關(guān)節(jié)等部位有明顯的軟組織腫脹，皮膚表面伴小面積潰瘍。表2顯示，造模后第2、3、5、7天，身痛逐瘀湯組骨折側(cè)后肢的軟組織腫脹度均明顯低于生理鹽水組(P<0.001)。

圖2 術(shù)后第2天兩組小鼠骨折斷端軟組織腫脹的代表圖Fig.2 Representative picture of soft tissue swelling at fractured hindlimb on day 2

2.3 對(duì)足底熱敏痛閾的影響

表3顯示，骨折后第1天，身痛逐瘀湯組的熱敏痛閾反應(yīng)時(shí)間明顯高于生理鹽水組(P<0.01)。

表2 兩組骨折處軟組織腫脹度比較(%)Table 2 Soft tissue swelling degree of fractured side(%)

表3 兩組小鼠的熱敏痛閾反應(yīng)時(shí)間比較(s)

2.4 對(duì)骨痂形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響

圖3顯示，骨折后第14天，身痛逐瘀湯組小鼠比生理鹽水組的骨痂量更多且更致密，骨折線更模糊。表4顯示，與生理鹽水組相比，身痛逐瘀湯組小鼠骨痂組織的骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.N)均顯著性升高(P<0.05)，但兩組的骨小梁數(shù)量(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 兩組小鼠Micro-CT重建代表性圖片F(xiàn)ig.3 Micro-CT reconstruction images of callus morphology

表4 兩組骨痂計(jì)量學(xué)比較Table 4 Quantitative analysis of callus morphology

2.5 對(duì)骨折愈合生物力學(xué)性能的影響

表5顯示，骨折后第28天，身痛逐瘀湯組小鼠骨痂的最大應(yīng)力、屈服應(yīng)力明顯高于生理鹽水組(P<0.001)。

表5 兩組小鼠脛骨骨折愈合后的生物力學(xué)比較(MPa)Table 5 Biomechanical comparison of healing tibia(MPa)

3 討論

當(dāng)人體遭受外傷，骨骼斷裂，經(jīng)脈受損，血液離開血液循環(huán)之“經(jīng)道”，停留于臟腑、胞宮、腠理之間則形成脈外瘀血。查閱既往古籍與文獻(xiàn)，瘀血不利于骨修復(fù)的原因包括纖維蛋白未及時(shí)清除會(huì)減少骨折斷端軟骨內(nèi)血管生成和骨化[17]，不利于局部組織的血供[18]，血液高凝狀態(tài)造成肺栓塞[19]，瘀血留滯、氣血不暢、不通則痛。然而，目前未有研究從淋巴管瘀滯的角度探討?zhàn)鲅獙?duì)骨修復(fù)的影響。

Szczesny等[5]推測(cè)創(chuàng)傷后淋巴管瘀滯的機(jī)制可能與滲入組織間隙的血液發(fā)生凝固進(jìn)而堵塞毛細(xì)淋巴管或淋巴液直接凝固有關(guān)，Wandolo等[20]發(fā)現(xiàn)瘀血里的紅細(xì)胞裂解物(血紅蛋白、含鐵血黃素和肌紅蛋白)可直接抑制淋巴管的搏動(dòng)。淋巴管作為引流組織間液、轉(zhuǎn)運(yùn)組織代謝產(chǎn)物的主要通道之一，對(duì)維持人體津液輸布和平衡有重要作用[21]。故疏通淋巴管瘀滯是緩解骨折早期血瘀證的重要切入點(diǎn)。

身痛逐瘀湯出自王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有活血祛瘀、通絡(luò)止痛無(wú)功效。方中君藥為川芎，性辛溫發(fā)散，善走竄，為血中之氣藥；輔以臣藥當(dāng)歸、桃仁、紅花共同活血祛瘀；佐以沒(méi)藥和五靈脂以化瘀止痛，地龍、秦艽和羌活以祛風(fēng)除濕，香附可疏肝理氣，牛膝可引血下行；使甘草調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代研究證實(shí)身痛逐瘀湯具有明顯的抗血栓、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥效[22]。由于復(fù)方具有多成分與多靶點(diǎn)的復(fù)雜性，以上藥效可能均是身痛逐瘀湯明顯改善創(chuàng)傷后淋巴管瘀滯的藥理機(jī)制。

既往臨床研究評(píng)價(jià)身痛逐瘀湯促進(jìn)骨修復(fù)的可信度不高，因其設(shè)計(jì)多疊加其他治療方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，且存在樣本量少、缺乏合理的對(duì)照組、以次要指標(biāo)(如關(guān)節(jié)活動(dòng)度、炎癥因子水平)評(píng)價(jià)骨修復(fù)、納入不同部位和不同程度骨折患者等不足。本研究采用空白對(duì)照設(shè)計(jì)，以Micro-CT和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)作為主要指標(biāo)直接評(píng)價(jià)身痛逐瘀湯對(duì)骨修復(fù)的療效。綜上所述，本研究基于疏通淋巴管瘀滯，增強(qiáng)淋巴管回流的角度，采用小鼠骨折模型證實(shí)身痛逐瘀湯具有明顯促進(jìn)骨修復(fù)的作用，為中醫(yī)骨傷科早期活血化瘀法促進(jìn)骨修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)，開拓了中醫(yī)活血化瘀法促進(jìn)骨修復(fù)藥理機(jī)制研究的新領(lǐng)域。