王雅迪 張鶴揚 秦巧臻 黑俊皓 江小霞 劉一涵 賀慧霞

頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞（jaw bone marrow mesenchymal stem cells，JBMMSCs）是從頜骨中分離得到的具有高度增殖、遷移活性及分化潛能的一類成體干細胞。JBMMSCs起源于外胚層，在頜面部胚胎發(fā)育期由顱神經(jīng)嵴（CNC）細胞從神經(jīng)管遷移到顱骨前區(qū)，形成面部和前顱骨的一些骨骼和軟骨［1,2］。JBMMSCs可在一定誘導條件下向成骨細胞（通過膜內(nèi)成骨直接形成骨）、脂肪細胞、軟骨細胞（通過軟骨內(nèi)成骨形成骨和軟骨）、神經(jīng)細胞等分化［3-5］。有研究表明［6,7］，JBMMSCs在增殖及成骨分化方面的能力明顯優(yōu)于BMSCs（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），且具有臨床上易得、與頜骨同源等優(yōu)勢，成為目前修復頜骨缺損領(lǐng)域研究的熱點。

另一方面，頜骨缺損常由頜面部創(chuàng)傷、腫瘤、感染等引起，而這些因素都會極大的損傷頜骨周圍神經(jīng)，骨損傷導致的神經(jīng)纖維損傷后，其周圍骨組織的自然愈合及骨形成的時間會明顯延長，這表明，神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織代謝密切相關(guān)［8］。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一類，它能使中樞神經(jīng)元和外周神經(jīng)元加速生長、促進發(fā)育，修復損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。同時，在骨代謝、成骨分化中有促進作用［9-11］。近年來，有研究證實NGF 能促進中胚層來源的長骨骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化及骨形成，但未見NGF 對外胚層來源的JBMMSCs 功能的影響研究。因此，本文擬探討NGF對JBMMSCs增殖及成骨分化作用的影響，為其用于頜骨骨缺損的修復與再生篩選合適的作用濃度，為其臨床應用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 α-MEM 培養(yǎng)基（gibco，Ameican)，胎牛血清（Excell，China），胰蛋白酶（BioFrox，American)，地塞米松、抗壞血酸C、β-甘油酸鈉、NGF(Peportech，American)，F(xiàn)ITC標記 的抗體CD45，APC 標記的 抗體CD29、90，CCK-8 試劑盒（Sigma，American），堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（Sigma，American）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，American)、qRT-PCR 試劑（上海生工生物，中國)、RIPA 裂解液（Solarbio，China）、BCA 蛋白定量試劑盒（上海貝博生物科技公司，China），OPN、RUNX2、MCM-2、Ki67 抗體（Abcam，American)。

1.1.2 儀器 細胞培養(yǎng)箱（Thermo，American)，離心機（Thermo，American)，流式細胞儀（BD，American)，倒置顯微鏡（Olympus，American)，F(xiàn)TC-3000P 實時熒光定量 PCR 儀（Funglyn Biotech Inc，American)，酶標儀（Thermo，American)，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad，American）。

1.2 方法

1.2.1 JBMMSCs 的提取及鑒定 將新生BL3C57 小鼠處死后，于75%的乙醇浸泡5 min，無菌條件下取下頜骨，剪為約1 mm3大小的組織塊；收集后加入胰酶消化約20 min，棄胰酶，加入α-MEM 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后半量換液，72 h 后完全更換培養(yǎng)基，以后每3 d 換1次，細胞80%～90%融合消化、傳代。本研究經(jīng)中國人民解放軍軍事醫(yī)學研究院實驗動物管理與使用委員會批準（IACUC-DWZX-2021-759）。

1.2.2 JBMMSCs的鑒定 取P2代對數(shù)期生長的JBMMSCs（下同），胰酶消化后收集，用α-MEM培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞密度至1×105/ml，使用FITC標記的抗體CD45、APC標記的抗體CD29、CD90的單克隆抗體于4℃冰箱內(nèi)避光孵育30～40 min，用PBS洗滌3遍后進行流式細胞術(shù)分析。

1.2.3 分組及處理 根據(jù)NGF 濃度設為四組，處理方法如下：0 ng/ml NGF組、10 ng/ml NGF組、50 ng/ml NGF組、100 ng/ml NGF組［20-22］。分別以含有上述濃度NGF 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)JBMMSCs，每3 d換液1次。

1.2.4 CCK-8 檢測增殖 取JBMMSCs 以每孔4×103個細胞的密度接種于96 孔板中，24 h 后更換為含不同濃度NGF（0、10、50、100 ng/ml）的完全培養(yǎng)基。分別在第0、1、3、5、7 d 時，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長處各孔A值。

1.2.5 堿性磷酸酶染色（ALP）取JBMMSCs以每孔3×104個細胞的密度接種于24 孔板中，24h后更換為含不同濃度NGF（0、10、50、100ng/ml）的完全培養(yǎng)基，每3d換液1次，誘導7d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛溶液固定30-60min，根據(jù)ALP試劑盒說明配置染液，室溫避光孵育4h后，PBS 洗滌3次，使用BIX 顯微鏡觀察。Image J軟件分析各組ALP染色的光密度。

1.2.6 qRT-PCR基因表達檢測 取JBMMSCs以3×105個/孔的密度接種于六孔板中，以上述分組進行培養(yǎng)3 d后［23］，根據(jù)說明書使用總RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，分光光度計檢測mRNA濃度及純度。然后使用Hifair? Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus）試劑盒去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄1μgmRNA。在NCBI上查找ALP、OPN、RUNX2、BMP2、Ki67、MCM-2及內(nèi)參GAPDH的mRNA序列，Primer 5軟件設計引物，引物序列見（表1)，由生工生物工程股份有限公司合成，使用Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix進行qPCR，每個反應使用同一cDNA 樣品進行3次重復。擴增程序為：預變性95℃5 min，1個循環(huán)；變性95℃10 s，退火/延伸60℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算目標基因相對于內(nèi)參基因GAPDH表達量。

表1 增殖及成骨相關(guān)基因引物序列

1.2.7 Western blot 蛋白表達檢測 取JBMMSCs 以3×105個/孔的密度接種于六孔板中，以上述分組培養(yǎng)3 d 后用RIPA 裂解液裂解細胞并提蛋白，BCA 法測蛋白濃度后，與loading buffer 混合為20 μg 蛋白樣本，100℃煮沸后，加入SDS-PAGE 進行電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，OPN、Ki67、RUNX2、MCM-2（1∶1000）一抗于4℃孵育過夜；次日，1×TBST 洗PVDF 膜3 遍，每遍5 min 后室溫孵育1∶2000 稀釋的二抗1 h，再次洗PVDF 膜3遍，每遍10 min，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)灰度值分析蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用t 檢驗，P<0.05 為組間差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 JBMMSCs 形態(tài)學觀察 原代培養(yǎng)的JBMMSCs 4 h貼壁，6 h細胞伸展呈紡錘狀、短梭形或多角形，細胞集落融合成片，呈玫瑰花狀生長。3～4 d 匯合達90%進行消化、傳代。傳代后的細胞增殖速度明顯減慢，但細胞體積略變大，形態(tài)較為均一，胞漿豐富，緊貼于皿底（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察JBMMSCs形態(tài)

2.2 JBMMSCs 流式表型分析 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:JBMMSCs 表面相對特異性標志物：CD29（99.6%）、CD90（79%）陽性表達，CD45（0.1%）陰性表達。表明本實驗所用的JBMMSCs 與骨髓來源間充質(zhì)干細胞具有相似表型（圖2）。

圖2 流式細胞儀檢測JBMMSCs的表型

2.3 CCK-8 細胞增殖檢測 不同濃度NGF 刺激JBMMSCs 后CCK-8 檢測結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間延長，各組細胞增殖明顯增加。與對照組比較，第3 d 時100 ng/ml組細胞呈現(xiàn)增殖趨勢；第5 d時50 ng/ml、100 ng/ml組細胞增殖顯著（P<0.05，P<0.0001），第7 d各組均較對照組細胞增殖速度顯著增加，其中50 ng/ml、100 ng/ml組JBMMSCs細胞活力均高度顯著增加（P<0.001）。以上結(jié)果可表明，NGF可促進JBMMSCs增殖，其促進作用具有NGF濃度和時間依賴性（圖3）。

圖3 不同濃度的NGF對JBMMSCs增殖能力的影響（*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001,Mean±SEM，n=6）

2.4 ALP活性檢測 成骨誘導培養(yǎng)至第7 d，ALP染色胞漿呈現(xiàn)藍紫色，隨著NGF濃度增加，細胞增多，胞漿染色加深。當NGF在濃度大于50 ng/ml時，細胞呈團塊狀，胞漿染色呈深紫藍色，表明ALP活性明顯增強。圖像灰度半定量分析結(jié)果顯示50 ng/ml、100 ng/ml組ALP 活性顯 著高 于0 ng/ml組及10 ng/ml組（P<0.05）（圖4）。

圖4 不同濃度NGF對JBMMSCs ALP染色結(jié)果的影響

2.5 Real-timePCR 增殖及成骨相關(guān)基因檢測 不同濃度的NGF 處理JBMMSCs 3 d，可見與0 ng/ml組比較,各組ALP、OPN、BMP2、RUNX2的表達量均顯著升高（P<0.05），其中50ng組、100ng組更顯著（P<0.0001）。此外，Ki67、MCM-2 的表達量隨著濃度的升高而升高，而100 ng/ml NGF 時表達量卻呈明顯下降趨勢（P<0.05）（圖5）。

圖5 qRT?PCR檢測不同濃度NGF對JBMMSCs成骨及增殖相關(guān)基因表達的影響（A?F）隨著NGF濃度的增加，ALP、OPN、RUNX2、BMP2的mRNA表達量也隨之增加；Ki67、MCM?2在NGF 50 ng/ml時表達量達到最高，100 ng/ml NGF時表達量卻呈下降趨勢（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,Mean±SEM，n=3）

2.6 Western blot 檢測增殖及成骨相關(guān)蛋白表達 NGF 處理JBMMSCs 3 d，WB 結(jié)果顯示：OPN、Ki67、MCM-2 表達隨著NGF 濃度升高而升高（P<0.05），而RUNX2 在低濃度時mRNA 表達呈濃度依賴性，而在100 ng/ml高濃度時呈下降趨勢（P<0.001）（圖6）。

圖6 WB檢測不同濃度NGF對JBMMSCs增殖及成骨相關(guān)蛋白表達

3.討論

提高下頜骨缺損修復效果、減少其延遲愈合或不愈合，始終是口腔臨床醫(yī)學中亟待解決的重要課題。近來，越來越多的研究表明骨骼感覺神經(jīng)在骨骼損傷修復過程中發(fā)揮重要的作用，NGF 也因此受到越來越多的關(guān)注。NGF 作為最早發(fā)現(xiàn)的細胞生長調(diào)節(jié)因子，具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促進突起生長的雙重生物學功能［9］，此外，NGF 還可通過其高親和力的受體原肌球蛋白受體激酶A (TrkA）誘導骨骼神經(jīng)再生，進而對骨修復后期的發(fā)生的血運重建和骨基質(zhì)沉積發(fā)揮促進作用［8,12,13］。Grills［14］等人在肋骨骨折的大鼠模型中首次發(fā)現(xiàn)，在骨折斷端處的骨膜祖細胞、成熟或不成熟的骨細胞、部分軟骨細胞中均有NGF 的出現(xiàn)，以旁分泌和自分泌的形式作用于骨折端的成骨細胞。Li Z［11］等人的研究發(fā)現(xiàn)，在骨折小鼠的組織學切片中顯示骨膜基質(zhì)祖細胞和骨折相關(guān)的巨噬細胞中NGF 的表達顯著上調(diào)，且反應性骨膜中富含NGF的CGRP+TrkA+的感覺神經(jīng)纖維活化明顯；通過注射TrkA 抑制劑1NMPP1抑制其活性，可發(fā)現(xiàn)感覺神經(jīng)纖維數(shù)量的減少，更重要的是骨折處血運重建減緩，骨折處組織愈合顯著延遲，這說明NGF可能通過TrkA 調(diào)控骨組織修復。同樣的，Asaumi［15］等人在大鼠股骨骨折模型中發(fā)現(xiàn)，NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophins-3）的mRNA 表達水平在骨折修復過程中增加，且在骨折發(fā)生的第二天其NGF 的值達到頂峰，明確了NGF 在骨損傷修復中的重要促進作用。新出現(xiàn)的證據(jù)表明［9,13］，NGF 除了可誘導神經(jīng)生長并促進其存活，NGF 還可與其低親和力受體P75 結(jié)合，促進細胞向骨組織受損處遷移，促進骨愈合。綜上所述，NGF 不僅能夠在周圍神經(jīng)損傷時發(fā)揮維持、保護及再生的作用，同時能夠促進細胞向骨組織損傷處遷移，上調(diào)成骨基因表達，并加快損傷周圍的骨組織愈合速度。但這些研究多集中在股骨、肋骨等骨組織，而NGF對頜骨損傷修復的作用尚未見報道。

顱頜面骨是由外胚層的神經(jīng)嵴細胞發(fā)育而來，其骨形成的方式為膜內(nèi)成骨，不同于由中胚層的間葉細胞發(fā)育而來的長骨—軟骨成骨［1,2］。哺乳動物顱面骨的修復及再生需要多種類型的細胞和外在誘導因子的共同作用，與軀干骨不同，頜骨的發(fā)育形成和愈合不需要軟骨作為基礎(chǔ)，而是由間充質(zhì)祖細胞凝聚而成［11,12,16］。JBMMSCs 作為頜骨組織中骨形成的關(guān)鍵細胞，具有明確的定向成骨分化能力。近年來，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)JBMMSCs 的成骨分化能力要明顯優(yōu)于BMSCs。Aghaloo 等人［6］對原代頜骨與長骨骨髓間充質(zhì)干細胞進行比較研究，通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)：JBMMSCs 中堿性磷酸酶活性、成骨細胞礦化等基因表達量明顯高于BMSCs。更重要的是，植入裸鼠后，頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞形成的鈣結(jié)節(jié)較長骨骨髓間充質(zhì)干細胞所形成的鈣結(jié)節(jié)大70%，骨礦化程度是長骨骨髓間充質(zhì)干細胞的3 倍。本實驗與之相似，Brandon 等人［7］比較了豬頜骨與長骨骨髓間充質(zhì)干細胞的體外增殖、成骨分化特性和基因表達的不同。結(jié)果顯示JBMMSCs 的增殖和成骨分化能力明顯強于BMSCs，此外，通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)404個高豐度的基因，其中334個基因與成骨和成血管相關(guān)，48個基因的差異表達至少升高1.5 倍，顱神經(jīng)嵴相關(guān)基因BMP44 在頜骨髓間充質(zhì)干細胞中高表達。本課題前期實驗初步證實JBMMSCs 具有自我增殖、更新及多向分化能力，可作為種子細胞適用于同源性骨缺損的修復與再生。然而，單純JBMMSCs 的成骨分化能力依舊較差［17］。因此，研究外胚層細胞來源的NGF 對同樣來源于外胚層的JBMMSCs 增殖及成骨分化能力的影響，以及可能的理論機制，對提高JBMMSCs 的成骨分化及增殖效率，進而修復頜骨缺損具有重要意義。

NGF的濃度對其作用效果有重要影響。崔國勝［18］等人研究NGF對大鼠骨髓基質(zhì)細胞成骨分化的影響，選用100 ng/ml NGF為終濃度進行實驗，結(jié)果表明：NGF可能通過TrkA受體，在一定程度上促進大鼠骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化、增強其礦化能力，且此促進作用可以被TrkA受體抑制劑K252a阻斷。此外，汪瓊等人［19］研究了NGF對脂多糖誘導的成骨細胞炎癥反應的影響，選用100 ng/ml NGF對成骨細胞進行刺激，發(fā)現(xiàn)：高中劑量的NGF可顯著抑制LPS誘導的成骨細胞一氧化氮的釋放，該濃度下細胞活力不受影響。本實驗對比研究了不同濃度NGF 對JBMMSCs的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NGF能夠有效的提高JBMMSCs的增殖及成骨分化能力，但不同濃度NGF作用不盡相同。50 ng/ml NGF能有效提高JBMMSCs的增殖能力且其增殖能力隨NGF濃度的增加而提高，同時Ki67、MCM-2等基因及蛋白的表達在一定濃度范圍內(nèi)也隨濃度增加而增加，但100 ng/ml NGF時，Ki67、MCM-2的表達卻呈下降趨勢。不同濃度NGF對JBMMSCs分化的影響也呈現(xiàn)此特點。JBMMSCs 表達ALP、OPN、RUNX2、BMP2等成骨相關(guān)基因，而且隨著NGF劑量的加大，ALP、OPN、RUNX2、BMP2的基因及蛋白表達也隨之升高，但在100 ng/ml時，這些基因及蛋白表達卻下降。這表明：NGF在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，濃度過高作用反而下降。本實驗濃度篩選結(jié)果表明：50 ng/ml NGF刺激能有效提高外胚層來源的JBMMSCs 增殖及成骨分化能力，該濃度為應用JBMMSCs 修復骨缺損、促進骨再生的最佳濃度。50 ng/ml NGF的刺激與正常干細胞最為接近，可模擬最佳的體內(nèi)修復環(huán)境?？梢?，給予不同濃度NGF對應用JBMMSCs治療頜骨缺損等疾病具有重要意義。

綜上所述：本研究檢測了不同濃度NGF 對小鼠JBMMSCs 增殖及成骨分化的影響,為NGF 應用于頜骨缺損、骨代謝性疾病所致的骨質(zhì)不佳、骨量不足進行骨修復和再生治療提供一定的理論和實驗依據(jù)。也為進一步研究神經(jīng)刺激在頜骨修復再生中的作用奠定基礎(chǔ)。