張寶獻，劉亞芳，張劍濤，李冠軍，李光飛，孫振國，張學(xué)成

1.華蘭生物工程重慶有限公司研發(fā)部，重慶 408102；2.華蘭生物工程股份有限公司開發(fā)部，河南 新鄉(xiāng) 453003

靜注人免疫球蛋白是以健康人血漿經(jīng)低溫乙醇法制備的組分Ⅱ沉淀為原料，經(jīng)Fractogel?EMD TMAE（簡稱TMAE）陰離子交換層析、納米膜除病毒過濾、超濾、調(diào)制、除菌分裝和低pH孵放病毒滅活制備［1］。層析介質(zhì)的純化性能直接影響終產(chǎn)品藥物的安全性和有效性，層析介質(zhì)的重復(fù)使用可大大降低生產(chǎn)工藝成本，但同時其性能也會隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低。層析填料在生物藥物純化過程中屬于關(guān)鍵原材料，《中國藥典》三部（2020版）中《生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制》將層析填料分為第3級中等風(fēng)險的原材料，需進行相應(yīng)的質(zhì)量控制［2］。近幾年來，對層析填料的管理和驗證已成為法規(guī)監(jiān)管和現(xiàn)場核查的重點項目之一，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》中已明確提出需對純化用材料（如層析柱填料）重復(fù)使用的可接受限度進行驗證，即層析填料的壽命驗證［3］。

本研究在不改變工藝參數(shù)的條件下，對靜注人免疫球蛋白制備工藝中使用的TMAE層析介質(zhì)在縮小模型的使用壽命進行界定，通過對離子交換層析洗脫組分中的雜質(zhì)蛋白分析確定雜質(zhì)蛋白成分，并進行檢測分析，以確保產(chǎn)品具有良好的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 靜注人免疫球蛋白樣品 由華蘭生物工程股份有限公司制備。

1.2 主要試劑及儀器Fractogel?EMD TMAE層析介質(zhì)及層析柱購自德國默克公司；IgA和IgM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自美國ICL Lab公司；MK3多功能酶標(biāo)儀和LP Vortex Mixer漩渦振蕩器購自芬蘭Thermo公司；GENIO電泳儀購自意大利Italy INTERLAB公司；UV-2600型分光光度計和TSKgel 3000SW購自日本島津公司；AKTA Pure150型層析系統(tǒng)和Severs-900型總有機碳分析儀購自美國GE公司；IX-51型顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 縮小模型的建立 通用的縮小模型的建立原則是采用線性縮小的方法學(xué)［5-9］。依據(jù)該線性縮小方法學(xué)，1個生產(chǎn)規(guī)模的層析柱的線性縮小模型參數(shù)見表1。在第1個和每次隔20個循環(huán)后，對收集液進行IgA、IgM、分子大小分布檢測。在每20個循環(huán)后進行N+1次空白試驗，空白試驗使用與料液性質(zhì)一致（相同pH，電導(dǎo)）的緩沖液替代料液進行上樣，通過層析圖譜對比分析是否有紫外吸收峰出現(xiàn)，再生之后繼續(xù)進行純化水清潔2～3個層析凝膠體積（column volume，CV），開始取樣檢測總有機碳（total organic carbon，TOC）。每次空白試驗后進行1次柱效檢測，并對層析介質(zhì)運行過程中的層析圖譜、蛋白回收率、IgA、gM、分子大小分布、壓力、理論塔板數(shù)、對稱系數(shù)和TOC進行趨勢分析。對每次層析的參數(shù)進行比對，分析隨著循環(huán)次數(shù)的增加關(guān)鍵參數(shù)的變化情況，從而確定層析介質(zhì)使用壽命。層析介質(zhì)壽命的界定需考察其性能指標(biāo)隨周期延長的變化［10-13］。

表1 生產(chǎn)規(guī)模與縮小模型參數(shù)Tab.1 Parameters in production scale and downsizing model

1.4 層析流程

1.4.1 層析介質(zhì)的清洗和消毒 在純化處理下一批次樣品前，用0.5 mol／L氫氧化鈉對層析介質(zhì)進行清洗和消毒，消毒時間30～60 min。

1.4.2 層析介質(zhì)的平衡和上樣 層析上樣前，先用層析緩沖液對層析介質(zhì)進行平衡。平衡完畢后，按照15倍柱體積上樣量上樣，上樣過程中保留時間為20 min。

1.4.3 層析介質(zhì)的洗脫和再生 樣品上樣結(jié)束后，分別使用3倍柱床體積的洗脫液和再生液對層析介質(zhì)進行處理，最終保存在20%的乙醇溶液中。

1.5 IgA和IgM含量檢測 采用ELISA法，按照試劑盒說明書操作，其中IgA應(yīng)≤100μg／mL，IgM應(yīng)≤50μg／mL。

1.6 層析柱清洗效果驗證 顯微鏡觀察使用再生和清潔程序是否可去除功能基團上強的吸附物質(zhì)以及積累的污染物，確定清潔步驟是否有效。

1.7 分子大小分布檢測 采用分子排阻高效液相色譜法。測定方法和結(jié)果分析按照《中國藥典》三部（2020版）通則3122［2］進行，IgG單體和二聚體含量之和應(yīng)不低于95.0%。

1.8 TOC檢測 采用經(jīng)過校正的儀器進行在線監(jiān)測，測定方法和結(jié)果分析按照《中國藥典》四部（2020版）通則0682［4］進行。

1.9 電泳及痕量雜蛋白分析 分別收集離子交換層析后流穿液和洗脫液，采用Protein A特異性吸附層析，進行8%SDS-PAGE，并進行痕量雜蛋白分析。

1.10 層析紫外色譜圖疊加對比 選取其中20次循環(huán)層析純化280 nm紫外色譜圖進行疊加對比分析，觀察層析圖譜是否發(fā)生明顯變異或峰形出現(xiàn)拖尾等惡化現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 洗脫成分分析 離子交換層析洗脫組分中的雜質(zhì)蛋白主要有相對分子質(zhì)量900 000、170 000、100 000、50 000這4個條帶，見圖1。依據(jù)大小推測為IgM、IgA以及一些小分子雜蛋白。

圖1洗脫成分的SDS-PAGE非還原電泳圖Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE profile of eluate

2.2 層析柱清洗效果驗證 顯微鏡觀察顯示，凝膠介質(zhì)使用后，凝膠表面吸附有雜質(zhì)蛋白；使用洗脫及再生溶液接觸層析介質(zhì)30～60 min，再次觀察可見凝膠顆粒表面光滑。見圖2。表明使用再生和清潔程序可去除功能基團上強的吸附物質(zhì)以及積累的污染物，此清潔步驟有效。

圖2 層析介質(zhì)清洗前（A）、后（B）的顯微鏡觀察（×400）Fig.2 Microscopy of chromatographic medium before（A）and after（B）cleaning（×400）

2.3 層析柱縮小模型層析的效果 在240次循環(huán)的層析介質(zhì)壽命驗證過程中，IgA檢測均值≤100μg／mL，IgM≤50μg／mL，IgG單體與二聚體含量之和＞95.0%，均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準，見表2。

在240次循環(huán)的層析介質(zhì)壽命驗證過程中，層析介質(zhì)對料液中的雜質(zhì)蛋白保持穩(wěn)定的去除能力，分離純化效果未發(fā)生衰減。隨著層析介質(zhì)使用次數(shù)增加，在層析介質(zhì)允許的壓力報警值以下，層析介質(zhì)的壓力呈逐步升高的趨勢，蛋白回收率下降，在可接受范圍內(nèi)。見表2。

每20次循環(huán)進行1次理論塔板數(shù)和對稱系數(shù)檢測，共進行了12次檢測，理論塔板數(shù)可達2 000以上，均值為3 196，對稱系數(shù)均在0.8～1.5范圍內(nèi)，均值為1.13，均在要求范圍之內(nèi)，見表2。表明層析介質(zhì)可耐受240次靜注人免疫球蛋白樣品的層析使用。

表2 層析柱縮小模型純化靜注人免疫球蛋白樣品的層析效果Tab.2 Purification effect of human immunoglobulin for intravenous injection with chromatographic column in downsizing model

2.4 層析空白對照TOC檢測 層析空白對照運行次數(shù)21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241的TOC檢測結(jié)果分別為32.4、53.3、30.4、31.3、34.1、33.8、42.1、45.7、51.1、44.0、33.8、47.0 ppb，均值為39.9 ppb，均小于0.5 mg／L（藥典規(guī)定純化水檢測標(biāo)準），表明清潔步驟有效。

2.5 層析紫外色譜圖疊加對比20次循環(huán)的層析圖譜表現(xiàn)出較高的一致性，表明隨著層析純化次數(shù)的增多，層析圖譜未發(fā)生明顯變異或峰形出現(xiàn)拖尾等惡化現(xiàn)象，見圖3。

圖3 層析過程280 nm紫外色譜疊加圖Fig.3 UV superposition diagram at 280 nm of chromatographic process

3 討論

本研究層析介質(zhì)為TMAE強陰離子交換凝膠，其功能性離子交換集團通過線性聚合物鏈結(jié)合，因此，膠粒具有很高的機械和化學(xué)穩(wěn)定性，可用于分離生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)的純化。根據(jù)該特性將雜質(zhì)蛋白吸附于凝膠上，目標(biāo)蛋白在流穿液中，實現(xiàn)對靜注人免疫球蛋白的純化。每種層析凝膠的使用壽命應(yīng)進行獨立、專一的研究，建立該層析凝膠使用壽命的研究數(shù)據(jù)，并在常規(guī)商業(yè)化生產(chǎn)過程中對該數(shù)據(jù)進行同步確認。

在建立縮小模型中通常保持層析柱柱高，線性流速不變，降低層析柱的柱直徑和體積流速。另外，上樣載量、緩沖液體積與柱體積的比值也要保持不變。有時由于硬件原因不能保持柱高和線性流速時，可考慮通過同時改變柱高和線性流速而保持保留時間不變的方案。縮小模型中的前3個循環(huán)實驗數(shù)據(jù)與以往的生產(chǎn)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，做差異顯著性檢驗，結(jié)果無顯著性差異，說明縮小模型的建立有效，可代表原生產(chǎn)規(guī)模的層析效果和行為。

層析填料的壽命衰減是一個層析性能逐漸退化的過程，并受多種因素的影響：層析介質(zhì)位于純化不同階段、層析模式、介質(zhì)類型、層析料液的蛋白濃度、上樣量和料液中雜質(zhì)污染過程；所采用的層析介質(zhì)清洗方案的有效性、其對清洗方案的耐受性及其理化性質(zhì)；層析介質(zhì)的儲存條件和裝填頻率等也會影響其使用壽命。因此，需通過系統(tǒng)化的使用壽命研究方案進行數(shù)據(jù)的收集和分析，從而建立一個合理的使用壽命周期。迄今，已開發(fā)了很多方法來提高層析填料的壽命和性能，再生條件優(yōu)化可有效延長使用壽命，澄清技術(shù)的改進改變了原料的性質(zhì)和后續(xù)的層析工藝條件，如流速、流動相黏度等，也可有效延長層析填料的壽命。層析介質(zhì)的壽命評估必須考慮填料的購置成本、清洗成本、使用次數(shù)、驗證成本等綜合因素決定，越長的壽命，風(fēng)險越大，驗證費用大，并不一定能真正節(jié)省成本［14-16］。

層析填料的壽命判斷標(biāo)準主要是層析性能的改變，如動態(tài)結(jié)合載量的改變、收率的降低以及雜質(zhì)分離效果的降低等。洗脫收集譜圖的變化也可作為一個標(biāo)準，層析填料的污染往往會導(dǎo)致峰展寬。層析柱的柱效測量標(biāo)準，如理論塔板數(shù)和對稱系數(shù)也可用來反映層析填料的壽命變化。層析介質(zhì)的清洗驗證與層析介質(zhì)的壽命對于生物藥物的生產(chǎn)十分重要，優(yōu)化清洗試劑以及清洗的操作程序可延長層析介質(zhì)的壽命。同時，層析系統(tǒng)的選擇（包括層析儀、層析柱以及裝柱、層析柱運行的輔助設(shè)備）也會影響層析介質(zhì)的壽命。

本研究對靜注人免疫球蛋白層析介質(zhì)進行了240次循環(huán)上樣、洗脫和清洗循環(huán)后，層析圖譜擬合度較好，無多余的雜峰或發(fā)生峰的偏移，表現(xiàn)出較高的一致性；制品關(guān)鍵參數(shù)IgA、IgM和IgG單體與二聚體含量之和均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準，將靜注人免疫球蛋白TMAE層析介質(zhì)的純化使用次數(shù)暫定為240次。該層析工藝的清洗方法能夠有效去除層析過程中結(jié)合在層析柱上的雜質(zhì)成分，使用240次不會對層析介質(zhì)的分離純化性能造成影響?？s小規(guī)模試驗得到的數(shù)據(jù)僅能證明在層析柱縮小模型的效果，目前使用的TMAE凝膠在商業(yè)規(guī)模下已使用150次，次數(shù)還在不斷增加，目前產(chǎn)品質(zhì)量檢測結(jié)果穩(wěn)定且均符合規(guī)定，繼續(xù)使用縮小規(guī)模驗證TMAE的使用壽命，可為商業(yè)規(guī)模提供數(shù)據(jù)支持，降低商業(yè)規(guī)模中生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險［17-18］。