張婷婷，王偉，陳子楊，李景良，張穎，孫宏亮，常軍亮

1.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012；2.黑龍江紅十字（森工總）醫(yī)院急診科，黑龍江 哈爾濱 150040

蜱傳腦炎（tick-borne encephalitis，TBE）又稱森林腦炎，是由森林腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)橹饕卣鞯募毙詡魅静。?-3］。TBEV屬于黃病毒科黃病毒屬，主要通過蜱蟲傳播。臨床重癥TBE患者以高熱、頭痛、昏迷、頸項強直、腦膜刺激癥為主要特征，病死率及致殘率極高。東北地區(qū)為我國TBE主要自然疫源地［4-7］。目前臨床尚無針對TBEV特效抗病毒治療藥物，主要采用對癥治療的輔助手段，緩解癥狀，治療效果差，疫苗接種是預(yù)防該疾病最有效的方法［7-8］。黃病毒屬病毒間存在較強的抗原交叉反應(yīng)性，使疾病的診斷及鑒別診斷、病原及血清流行病學(xué)調(diào)查、疫苗研究和檢測試劑的開發(fā)存在一定的困難［9-10］。

TBEV基因組為單股正鏈RNA，全長約11 000 bp，為單一開放讀碼框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、M、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、ND4a、NS4b、NS5）。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1為相對分子質(zhì)量46 000～55 000的高度保守的糖蛋白，具有糖基化位點、二硫鍵，不包含任何跨膜區(qū)及翻譯后脂質(zhì)修飾。在細(xì)胞中，NS1以二聚體形式存在，協(xié)助病毒基因組復(fù)制以及感染宿主，同時部分NS1以分泌形式存在于細(xì)胞外，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的保護性抗體，參與細(xì)胞免疫［11］。有研究表明，NS1抗體不直接參與病毒中和，但在黃病毒種間具有特異性，這為基于NS1建立特異性黃病毒感染的血清學(xué)診斷提供了新的選擇，NS1蛋白是黃病毒的主要抗原標(biāo)志，感染宿主血液中NS1抗體含量很高，在初次接觸4～8 d內(nèi)的感染者血液中即可被檢測到，因此，NS1是黃病毒感染早期診斷的標(biāo)志［12-14］。

目前商品化的登革熱NS1抗原檢測試劑盒采用原核表達(dá)的重組NS1蛋白作為ELISA包被抗原，用于診斷登革熱病毒早期感染［15-16］?；谏鲜鳇S病毒研究數(shù)據(jù)，本研究原核表達(dá)、純化TBEV“森張”株重組NS1蛋白，鑒定其與TBEV全病毒多克隆抗體的特異性反應(yīng)，并采用以重組NS1蛋白為包被抗原的間接ELISA法檢測臨床血清，初步評價其在TBEV抗體檢測的臨床應(yīng)用價值，為TBE疾病診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查、病毒蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、毒株、蛋白及血清pGEX-4T-1質(zhì)粒、TBEV“森張”株、TBEV全病毒感染小鼠不同天數(shù)血清及TBEV重組E蛋白均為長春生物制品研究所有限責(zé)任公司生物技術(shù)室保存；大腸埃希菌Trans1-T1 Phage Resistant和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；臨床血清樣本由黑龍江紅十字（森工總）醫(yī)院提供。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、fastpfuDNA聚合酶和質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；片段回收試劑盒和凝膠回收試劑盒購自日本TaKaRa公司；羊抗鼠IgM-HRP購自武漢Elabscience公司、小鼠抗人IgG-HRP購自武漢科源安博生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GST瓊脂糖凝膠填料購自美國GE公司；增強型DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凝膠成像分析儀和全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-rad公司；高壓均質(zhì)機購自加拿大ATS公司；SCG純化系統(tǒng)購自蘇州賽普儀器公司。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank上登錄的TBEV“森張”株NS1基因序列（JQ650523.1），應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計TBEVC基因擴增引物，上游引物序列：5'-ATGGATCCATGGATGTTGGCTGTGCTGTGGA-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點），下游引物序列：5'-ATCTCGAGTTATGCCACTACCATTGAGCGA-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因的擴增 采用TRIZOL法從TBEV中提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系共50μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各1μL（10μmol／L），5×fastpfubuffer 10μL，dNTP（2.5 mmol／L）4μL，fastpfuDNA聚合酶1μL，補ddH2O 32μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-1分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，膠回收試劑盒回收目的基因片段及載體片段，以T4 DNA連接酶于16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性（50μg／mL）選擇培養(yǎng)，挑取形態(tài)良好的單克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，并提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒送吉林省庫美生物科技有限公司測序，測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-NS1。

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-NS1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性（50μg／mL）的固體瓊脂平板上培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆菌，接種于氨芐青霉素抗性（50μg／mL）LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)8 h；按1%的接種量轉(zhuǎn)接至300 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌液A600為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol／L的IPTG，37℃，200 r／min誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲破碎，13 800×g離心2 min，收集上清和沉淀，經(jīng)10%SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)，應(yīng)用Image Lab 3.0軟件分析蛋白的表達(dá)量。

1.7 目的蛋白的純化 誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌液于4℃，10 000×g離心30 min，收集菌體沉淀，按1∶10（W／V）比例加入PBS（pH 7.3）緩沖液重懸菌體，800 bar條件下均質(zhì)3次；均質(zhì)破碎后的菌液經(jīng)10 000×g離心30 min，收集菌體沉淀（即包涵體）。包涵體經(jīng)變性復(fù)性處理后，收集含目的蛋白的溶液，4℃，10 000×g離心30 min，收集上清液，用0.45μm濾膜抽濾，收集濾液。采用SCG純化系統(tǒng)進(jìn)行GST bestarose 4FF親和層析純化，用5個體積PBS緩沖液（pH 7.3）平衡GST bestarose 4FF介質(zhì)，上樣流速為1 mL／min，用含10 mmol／L還原性谷胱甘肽的50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）洗脫液洗脫目的蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE鑒定，應(yīng)用Image Lab 3.0軟件分析純度。

1.8 重組蛋白的Western blot分析 純化的重組蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h；PBST洗滌3次，加入TBEV全病毒感染小鼠血清（1∶1 000稀釋），室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h；PBST洗滌5次，DAB顯色。

1.9 重組NS1和E蛋白血清檢測趨勢一致性分析 采用間接ELISA法，以重組NS1和E蛋白分別作為固相抗原，檢測TBEV全病毒感染小鼠不同天數(shù)血清，比較其檢測一致性。分別用純化的重組NS1蛋白和重組E蛋白的最佳包被濃度（10μg／mL）包被酶標(biāo)板，4℃過夜（＞16 h）；棄上清，每孔加入200μL含10%新生牛血清的PBS，4℃封閉過夜；加入待檢血清（1∶100稀釋），100μL／孔，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入羊抗鼠IgM-HRP（1∶5 000稀釋），100μL／孔，37℃孵育30 min；PBST洗滌5次，加入TMB底物顯色，100μL／孔，37℃孵育15 min；加入2 mol／L H2SO4，50μL／孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A450值。

1.10 重組NS1蛋白臨床應(yīng)用的特異性與敏感度分析 采用間接ELISA法，用重組NS1蛋白包被酶標(biāo)板，小鼠抗人IgG-HRP為二抗，測定15份TBE陽性臨床血清，15份流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）臨床血清和25份健康志愿者血清，分析檢測特異性和敏感度，評價重組NS1蛋白用于TBE臨床診斷的可行性。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定TBEVNS1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 056 bp的特異性條帶，大小與理論值一致，見圖1。

圖1 TBEV NS1基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of TBEV NS1 gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-NS1轉(zhuǎn)化菌落的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，7號和10號菌落呈陽性，可見1 056 bp的特異性條帶，大小與理論值一致，見圖2。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可見1 056 bp的目的基因片段和4 969 bp的載體片段，見圖3，質(zhì)粒測序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 表達(dá)的重組蛋白經(jīng)10%SDSPAGE分析，在相對分子質(zhì)量約65 000處可見特異性蛋白條帶，大小與理論值一致，見圖4。經(jīng)Image Lab 3.0軟件分析，重組NS1蛋白的表達(dá)量約占重組菌體蛋白的22.1%。誘導(dǎo)后的重組菌超聲破碎物上清和沉淀中均可見目的蛋白條帶，但主要以包涵體形式存在，見圖5。

圖2 pGEX-4T-1-NS1重組菌的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant colonies with pGEX-4T-1-NS1 by PCR

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-NS1的雙酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmid pGEX-4T-1-NS1（BamHⅠ／XhoⅠ）

圖4 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant protein

2.4 純化產(chǎn)物的鑒定10%SDS-PAGE分析顯示，純化的重組蛋白相對分子質(zhì)量約65 000，大小與預(yù)期相符，見圖6。蛋白純度為93.7%。

圖5 重組蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of form of expressed protein by SDS-PAGE

圖6 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified product

2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化的重組蛋白可與TBEV全病毒感染小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對分子質(zhì)量約65 000處可見反應(yīng)條帶，而未誘導(dǎo)菌體未見該條帶，見圖7。表明重組NS1蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.6 血清檢測趨勢一致性 間接ELISA法檢測結(jié)果表明，重組NS1蛋白與重組E蛋白作為包被抗原測定TBEV全病毒感染不同天數(shù)小鼠血清特異性IgM抗體具有一致性，且NS1蛋白與E蛋白的檢測吸光度值基本一致，見圖8。表明重組NS1蛋白與包膜E蛋白具有較高的IgM抗體檢測趨勢一致性，具有應(yīng)用于血清學(xué)診斷的價值。

2.7 重組NS1蛋白臨床應(yīng)用的特異性和敏感度 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，以重組NS1蛋白作為包被抗原測定15份TBE陽性臨床血清均為陽性，敏感度為100%（15／15）；檢測15份JE臨床血清14份為陰性，檢測25份健康志愿者血清24份為陰性，特異性為95%（38／40）。

圖7 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.7 Western blotting of recombinant protein

圖8 兩種固相抗原檢測小鼠血清IgM抗體趨勢圖Fig.8 Trends of IgM determined with two solid phase antigens

3 討論

TBE是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病。近年來，隨著我國城鎮(zhèn)化進(jìn)程加快，TBE流行范圍不斷擴大，發(fā)病率不斷上升，成為社會日益關(guān)注的公共健康問題［17］。TBEV感染常用臨床輔助診斷方法包括常規(guī)的生化、血常規(guī)、腦電圖檢查等非特異性理化檢測和腦脊液病毒分離、RT-PCR核酸檢測、血清學(xué)檢測等特異性方法。在特異性檢測方法中，由于病毒分離周期長，生物安全防護要求高，難以實現(xiàn)臨床常規(guī)檢測；RT-PCR病毒核酸檢測方法具有高通量、時間短、特異性高等優(yōu)點，但由于病毒核酸可檢測窗口期滯后和病毒血癥期短暫，導(dǎo)致核酸檢測敏感度較低，使得TBEV感染臨床標(biāo)本核酸檢測手段難以發(fā)揮關(guān)鍵作用。血清學(xué)檢測方法主要有血清抗體中和試驗、血凝抑制試驗（hemagglutination inhibition test，HLT）及補體結(jié)合試驗（complement fixation test，CFT），其中中和試驗檢測過程中須用到活病毒，不適用于實驗室常規(guī)檢測；HLT、CFT檢測雙份血清效價增加4倍以上具有診斷意義，方法特異性低。ELISA法因其具有簡便快速、敏感度高、可操作性強等特點，最常應(yīng)用于臨床輔助診斷及抗體水平的監(jiān)測［18-19］。雖然TBEV包膜E蛋白是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，為誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體的主要抗原，但黃病毒屬E蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體間存在較強的交叉反應(yīng)性，用于抗體檢測特異性較低，不能單獨作為理想的特異性抗體檢測指標(biāo)［20］。因此，高特異性抗原用于臨床黃病毒血清學(xué)檢測在疾病輔助診斷上具有重要意義。黃病毒的NS1蛋白之間也存在交叉反應(yīng)性，但研究認(rèn)為，NS1蛋白比E蛋白含有更多的種特異性表位［21-22］。近來有研究顯示，黃病毒的NS1蛋白可作為一種新型疫苗的靶標(biāo)［14］。因此，NS1蛋白除用于疾病診斷外，在疫苗免疫效果評價方面也有待進(jìn)一步研究。

本研究構(gòu)建了TBEV NS1蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了重組蛋白，Western blot分析顯示，其與TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反應(yīng)原性；分別以重組NS1蛋白和重組E蛋白作為包被抗原，采用間接ELISA法測定TBEV全病毒感染不同天數(shù)小鼠血清，結(jié)果表明，兩種蛋白作為抗原在檢測特異性抗體產(chǎn)生時間及吸光度值方面具有較高的一致性。采用間接ELISA法，以NS1蛋白作為固相抗原，對15份TBE陽性臨床血清、15份JE臨床血清及25份健康志愿者血清樣本進(jìn)行檢測，敏感度為100%，特異性為95%，表明NS1蛋白存在作為鑒別TBEV感染與其他黃病毒感染所產(chǎn)生的NS1特異性抗體的可能性。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了TBEV重組NS1蛋白，以其為包被抗原，經(jīng)間接ELISA法測定臨床血清，顯示出良好的特異性和敏感度，表明重組NS1蛋白存在作為ELISA檢測中的一種特異性包被抗原，并用于鑒別診斷TBEV感染與其他黃病毒感染的可能性，為進(jìn)一步開發(fā)TBE診斷試劑及完善黃病毒NS1蛋白研究奠定了基礎(chǔ)。