李素貞，閆甲麗，劉建偉，祁芳冰，劉明楊，郭蓓蕾，晁華，王健

國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司第四研究室，北京 101111

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征［1-2］。NAFLD患者疾病終末期會因嚴(yán)重肝病、腦血管疾病導(dǎo)致死亡［3］。NAFLD也是日益增長的肝硬化和肝癌的發(fā)生原因之一［4］，隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，NAFLD逐漸成為威脅人類健康及增加經(jīng)濟負(fù)擔(dān)最常見的慢性肝病之一［5］，發(fā)病率不斷升高，且患病人群日趨年輕化［6-7］。但目前仍缺乏有效的治療NAFLD的藥物［3，8-9］。

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）是一個具有多種生物活性的神經(jīng)生長因子［10-13］，自從發(fā)現(xiàn)其具有減輕體重的作用后［14］，多個研究探索了其作為潛在的治療肥胖［15］、改善糖脂代謝藥物的成藥性［16-18］，及其促進糖、脂代謝和調(diào)節(jié)能量平衡以及攝食行為［19］。這些作用均提示了CNTF對NAFLD具有一定的治療作用，有必要進行深入研究。但CNTF在體內(nèi)血液中的保留半衰期很短，僅2.9 min［20］，聚乙二醇修飾（PEGylation）能通過減少腎清除率、降低酶解速率及免疫原性等改善藥物的理化性質(zhì)，從而有效延長藥物在體內(nèi)的停留時間、增強體內(nèi)藥效［21-22］。

本研究組用PEG定點修飾重組突變體rhCNTF的63位精氨酸殘基，獲得了具有更長半衰期的產(chǎn)物PEGrhCNTF［23］。本研究進一步通過ob／ob小鼠動物模型探討rhCNTF及PEG-rhCNTF對NAFLD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料SPF級野生型C57BL／6J小鼠（14只，雌性，4～10周齡，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，體質(zhì)量平均18.9 g）和SPF級ob／ob小鼠（83只，雌性，4～10周齡，以高脂飼料喂養(yǎng)，體質(zhì)量平均49.4 g）均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002，本實驗均以科研為目的對小鼠進行養(yǎng)殖和使用，且按照《北京市實驗動物福利倫理審查指南》相關(guān)規(guī)定進行（35892-2018）；標(biāo)準(zhǔn)飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司；高脂飼料購自上海普路騰生物科技有限公司。

1.2 rhCNTF和PEG-rhCNTF注射用rhCNTF和PEG-rhCNTF由本實驗室制備［11］。

1.3 主要試劑 利拉魯肽購自諾和諾德（中國）制藥有限公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒Mouse Insulin（INS）ELISA Kit購自武漢華美生物工程有限公司。

1.4 動物分組及給藥C57BL／6J小鼠作為對照組，ob／ob小鼠隨機分為7組，每組11～12只：rhCNTF 0.1 mg／kg組，每天皮下注射給藥1次，0.1 mL／10 g，共給藥16 d；PEG-rhCNTF 3個劑量組（0.05、0.1、0.2 mg／kg）和賦形劑（成分3%甘氨酸，3%海藻糖，8%甘露醇）組，每4 d皮下注射給藥1次，0.1 mL／10 g，共給藥4次；利拉魯肽0.1 mg／kg組，每天皮下注射給藥2次，共給藥16 d；利拉魯肽0.2 mg／kg組，每4 d皮下注射給藥1次，與PEG-rhCNTF給藥同步。在測定連續(xù)血糖的當(dāng)天（PEG-rhCNTF第1、3針），rhCNTF和PEG-rhCNTF均移至上午給藥，其他均在下午4：00給藥。動物處死前一夜禁食不禁水，次日上午于處死前2 h給藥1次。

1.5 動物體質(zhì)量及飼料消耗量測定 給藥前連續(xù)測定3 d的24 h飼料消耗量，取平均值，給藥后每天定時測定24 h飼料消耗量及體質(zhì)量，按下式計算體質(zhì)量和攝食量變化率。

1.6 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）及血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）檢測 小鼠禁食不禁水12～14 h，先測空腹（0 h）血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），再于灌胃20%葡萄糖溶液（高壓滅菌）后0.5、1、2 h分別測定血糖濃度，建立血糖-時間曲線，并計算AUC。

1.7 胰島素抵抗測定 試驗終點時，所有動物禁食12～14 h后給藥，并在給藥后約2 h測定FPG水平。乙醚麻醉后經(jīng)眼眶動靜脈采血，室溫放置30 min后1 000×g離心10 min分離血清，-80℃低溫冰箱保存，測定空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)，用穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMAIR）來評估，按下式計算。HOMA-IR反映了機體對胰島素的敏感度，其值越小，表明機體對胰島素越敏感。

1.8 肝臟濕重及脂肪變性程度檢測 肝臟稱重后取肝中葉一塊于福爾馬林中固定，另取一份用預(yù)冷的生理鹽水沖洗、濾紙吸干水分后，置于液氮中保存。將小鼠肝中葉以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片后HE染色，光鏡下觀察，若肝細胞內(nèi)出現(xiàn)1個或多個完整透明的圓形空泡且肝細胞核受壓迫偏移至一側(cè)，判為肝細胞脂肪變性。脂肪變性程度判定標(biāo)準(zhǔn)為0級：肝細胞形態(tài)正常，幾乎未出現(xiàn)脂肪變性；Ⅰ級：脂肪變性的肝細胞數(shù)＜30%，為輕度肝臟脂肪變性；Ⅱ級：30%～60%的肝細胞發(fā)生脂肪變性，為中度肝臟脂肪變性；Ⅲ級：＞60%的肝細胞發(fā)生脂肪變性，為重度肝臟脂肪變性。

1.9 體脂重量測定 取腸系膜脂肪、后腹膜脂肪和皮下脂肪分別稱重，三者之和為體脂總重量，腸系膜和后腹膜脂肪之和為內(nèi)臟脂肪重量，并取后腹膜（生殖器周圍）脂肪于福爾馬林中固定。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠攝食和體質(zhì)量的影響 各組小鼠攝食量變化率見表1，體質(zhì)量變化率見表2。PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠的食欲有顯著影響，0.05 mg／kg劑量組攝食量變化率給藥后1～10 d與給藥前相比，除3 d外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.120，P分別為0.000、0.006、0.000、0.001、0.000、0.004、0.000、0.000、0.011）；0.1 mg／kg劑量組攝食量變化率給藥后1～10 d與給藥前相比，除3和4 d外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.469，P均為0.000）；0.2 mg／kg劑量組攝食量變化率給藥后1～10 d與給藥前相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.253，P分別為0.000、0.000、0.003、0.015、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001）。且伴隨著食欲的抑制，體質(zhì)量也顯著降低，0.05 mg／kg劑量組體質(zhì)量變化率給藥后1～16 d與給藥前相比，除1、3、4 d外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.502，2、5 d的P分別為0.016和0.044，之后時間的P均為0.000）；0.1 mg／kg劑量組體質(zhì)量變化率給藥后1～16 d與給藥前相比，除1、4、5 d外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.206，2、3 d的P分 別 為0.021和0.022，之 后 時 間 的P均 為0.000）；0.2 mg／kg劑量組體質(zhì)量變化率給藥后1～16 d與給藥前相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.024，1 d的P為0.010，之后時間的P均為0.000）；這種變化具有明顯的劑量依賴性。至最后1個給藥周期，其對食欲的抑制作用有所減弱，同時也伴隨著體質(zhì)量的回升。表明PEG-rhCNTF的減肥作用，尤其是在治療初期，與抑制食欲密切相關(guān)。利拉魯肽0.2 mg／kg組攝食量變化率僅給藥當(dāng)天（即4、8、12 d）與給藥前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.878，P分別為0.000、0.000和0.028），體質(zhì)量變化率僅給藥次日和最后兩天（即1、5、9、15、16 d）與給藥前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.563，P分別為0.000、0.001、0.000、0.028和0.002），效果不如PEG-rhCNTF，表明PEG-rhCNTF的減質(zhì)量和食欲抑制效果更穩(wěn)定，更持久。rhCNTF 0.1 mg／kg組能在給藥初期（給藥后1～10 d）減少ob／ob小鼠的攝食量，與給藥前相比，除3 d外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.007，P分別為0.001、0.023、0.028、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001和0.035），但至實驗結(jié)束，小鼠體質(zhì)量變化率與給藥前相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.502，P均＞0.05），表明與rhCNTF相比，PEG-rhCNTF減質(zhì)量和食欲抑制效果更明顯、更穩(wěn)定可靠，且克服了其短效、需每天給藥的缺點。

2.2 PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠口服葡萄糖耐量的影響 給藥前ob／ob小鼠糖耐量顯著異常，與對照組相比，ob／ob小鼠FPG及各檢測時間點血糖均明顯升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（0 h的F=4.230，P分別為0.001、0.001、0.000、0.000、0.000、0.003、0.000；0.5 h的F=9.929，P均為0.000；1 h的F=3.189，P分別為0.002、0.001、0.001、0.000、0.012、0.003、0.001；2 h的F=6.375，P均為0.000），見表3。給藥16 d后，rhCNTF對ob／ob小鼠的糖耐量異常無明顯改善作用，rhCNTF 0.1 mg／kg組FPG及各檢測時間點血糖與對照組相比，均明顯升高（0 h的F=4.458，P=0.045；0.5 h的F=25.874，P=0.000；1 h的F=11.862，P=0.000；2 h的F=7.800，P=0.000），與賦形劑組相比，則基本無變化（0 h的F=4.458，P=1.000；0.5 h的F=25.874，P=1.000；1 h的F=11.862，P=1.000；2 h的F=7.800，P=0.542）；PEG-rhCNTF可改善糖耐量異常，且呈劑量依賴性，其中PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg組FPG及各檢測時間點血糖與對照組相比，基本無變化（F分別為4.458、25.874、11.862、7.800，P均 為1.000）。見表4。

表1 各組ob／ob小鼠的攝食量變化率（%，±s）Tab.1 Change rates of food intake of ob／ob mice in various groups（%，±s）

表1 各組ob／ob小鼠的攝食量變化率（%，±s）Tab.1 Change rates of food intake of ob／ob mice in various groups（%，±s）

注：與0 d相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

組別對照賦形劑利拉魯肽0.1 mg／kg利拉魯肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11給藥后時間（d）00 0 0 0 0 0 0 0 1 0.01±0.19-0.15±0.04-0.49±0.16aa-0.07±0.08-0.26±0.07aa-0.41±0.10aa-0.59±0.12aa-0.87±0.02aa 2-0.21±0.18-0.18±0.14-0.45±0.12aa-0.48±0.12-0.20±0.11a-0.26±0.12aa-0.44±0.17aa-0.86±0.09aa 3-0.21±0.13-0.04±0.03-0.48±0.06aa 0.08±0.23-0.17±0.11-0.04±0.08-0.08±0.11-0.48±0.14aa 4-0.15±0.12-0.07±0.09-0.44±0.03aa-0.57±0.07aa-0.20±0.02a-0.32±0.10aa-0.24±0.15-0.43±0.07a 5-0.21±0.21-0.20±0.05-0.32±0.14-0.21±0.13-0.30±0.04aa-0.67±0.04aa-0.81±0.06aa-0.94±0.03aa 6-0.18±0.17-0.16±0.06-0.37±0.12 0.05±0.11-0.30±0.04aa-0.49±0.09aa-0.66±0.16aa-0.82±0.27aa 7-0.05±0.22-0.23±0.23-0.28±0.25 0.04±0.12-0.27±0.05aa-0.26±0.05aa-0.43±0.15aa-0.87±0.10aa組別對照賦形劑利拉魯肽0.1 mg／kg利拉魯肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11給藥后時間（d）8-0.19±0.19-0.24±0.07-0.35±0.14-0.73±0.05aa-0.35±0.06aa-0.37±0.05aa-0.56±0.07aa-0.78±0.14aa 9-0.10±0.11-0.18±0.12-0.29±0.14 0.01±0.10-0.25±0.10aa-0.41±0.06aa-0.62±0.06aa-0.78±0.11aa 10-0.07±0.20-0.03±0.03-0.20±0.16 0.18±0.18-0.20±0.05a-0.25±0.07a-0.43±0.09aa-0.52±0.22aa 11-0.20±0.13-0.12±0.07-0.22±0.19 0.22±0.16-0.17±0.03-0.12±0.09-0.24±0.09-0.38±0.23 12 0.09±0.21-0.11±0.12-0.16±0.13-0.35±0.05a-0.18±0.06-0.20±0.10-0.16±0.04-0.33±0.16 13-0.24±0.13-0.08±0.04-0.23±0.20 0.01±0.15-0.17±0.04-0.32±0.05aa-0.26±0.16-0.27±0.17 14-0.09±0.19-0.12±0.11-0.28±0.10 0.24±0.14-0.27±0.14aa-0.17±0.11-0.21±0.17-0.19±0.16 15-0.04±0.22-0.12±0.07-0.31±0.13 0.22±0.10-0.21±0.07a-0.16±0.10-0.15±0.05-0.18±0.11

表2 各組ob／ob小鼠的體質(zhì)量變化率（%，±s）Tab.2 Change rates of body weight of ob／ob mice in various groups（%，±s）

表2 各組ob／ob小鼠的體質(zhì)量變化率（%，±s）Tab.2 Change rates of body weight of ob／ob mice in various groups（%，±s）

注：與0 d相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

組別對照賦形劑利拉魯肽0.1mg／kg利拉魯肽0.2mg／kg rhCNTF 0.1mg／kg PEG-rhCNTF 0.05mg／kg PEG-rhCNTF 0.1mg／kg PEG-rhCNTF 0.2mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11給藥后時間（d）9-1.73±3.04 3.34±3.85-4.26±5.24-3.98±1.36aa 0.01±2.54-5.16±2.38aa-11.01±4.90aa-21.50±2.52aa 10-2.97±4.10a 2.12±4.40-5.36±5.34a-1.38±2.35-1.72±2.66-6.94±2.38aa-12.57±4.64aa-23.60±2.89aa 11 0.34±2.63 4.20±4.89a-4.28±6.92 0.94±3.04-0.56±2.51-6.11±2.58aa-11.82±5.31aa-22.68±4.37aa 12 0.62±2.99 4.38±5.33a-4.44±7.39 1.04±2.99-0.16±2.83-5.15±2.86aa-11.05±6.15aa-20.77±7.36aa 13 1.62±3.66 5.05±6.08aa-3.98±7.88-1.71±2.80-0.50±3.55-5.52±3.45aa-10.54±5.9aa-21.10±5.57aa 14 2.04±3.77 5.41±5.94aa-4.12±8.00 1.87±3.66 0.33±4.03-6.62±3.4aa-10.50±6.90aa-20.40±6.64aa 15 0.95±3.54 6.07±5.71aa-4.18±8.36 2.33±4.05a 0.07±5.09-4.97±3.64aa-9.99±7.48aa-19.06±6.93aa 16 1.57±3.92 6.35±6.54aa-4.28±8.99 3.30±4.48aa 0.52±4.96-4.47±3.56aa-8.94±7.84aa-18.21±6.95aa組別對照賦形劑利拉魯肽0.1 mg／kg利拉魯肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 11 11 11 11 11 12 11 11給藥后時間（d）0000 0 0 0 0 0 1-1.26±2.51 1.09±1.30-3.99±1.39-4.23±1.14aa-0.33±0.90-0.94±0.74-2.44±1.49-4.69±1.47aa 2-2.12±2.50 0.95±1.08-3.95±2.16-1.27±1.24-0.59±0.81-2.37±1.20a-5.05±2.35a-8.55±1.20aa 3-1.92±3.61 1.24±1.73-4.19±3.03-0.94±1.30-0.51±1.09-1.35±1.42-4.88±3.24a-10.92±1.70aa 4-1.72±1.39 2.68±2.33-3.77±3.16 0.89±1.49 0.67±1.50-0.20±1.55-3.94±4.20-10.48±2.05aa 5-1.94±2.57 3.10±3.03-3.88±3.33-3.49±1.24aa 0.70±1.71-1.98±1.88a-3.50±4.44-10.75±1.97aa 6-2.69±3.47a 2.45±2.82-4.14±3.31-0.55±1.53 0.20±1.80-4.80±2.04aa-8.65±3.85aa-15.4±1.62aa 7-2.81±3.5a 2.91±3.48-3.85±4.11 0.00±1.88-0.41±2.07-5.12±1.57aa-9.41±4.55aa-18.91±1.73aa 8-2.72±3.27a 3.42±4.08-5.05±3.96a 1.25±2.41-0.06±2.30-3.99±2.24aa-8.47±3.88aa-20.61±2.00aa

表3 給藥前各組小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.3 Oral glucose tolerances of mice in various groups before treatment（mol／L，±s）

表3 給藥前各組小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.3 Oral glucose tolerances of mice in various groups before treatment（mol／L，±s）

注：與對照組相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

組別對照賦形劑利拉魯肽0.1 mg／kg利拉魯肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg 2 h 4.41±1.27 7.43±1.50aa 7.91±1.48aa 9.02±2.92aa 7.77±1.60aa 8.15±1.68aa 8.17±2.46aa 7.64±1.93aa n 13 12 12 12 11 12 12 12 0 h 3.85±0.71 7.04±1.96aa 6.98±1.88aa 7.34±3.34aa 7.95±1.90aa 7.83±2.65aa 6.63±2.25aa 7.39±2.46aa 0.5 h 13.65±4.11 25.34±4.92aa 24.12±5.10aa 23.86±5.39aa 26.13±3.59aa 25.76±5.00aa 24.23±4.08aa 24.83±4.24aa 1 h 7.68±1.65 13.26±3.69aa 13.73±4.52aa 13.67±4.25aa 14.67±6.51aa 12.10±2.76a 12.94±4.82aa 13.63±4.83aa

表4 給藥后各組小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.4 Oral glucose tolerances of mice in various groups after treatment（mol／L，±s）

表4 給藥后各組小鼠的口服葡萄糖耐量（mol／L，±s）Tab.4 Oral glucose tolerances of mice in various groups after treatment（mol／L，±s）

注：與對照組相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

組別對照賦形劑利拉魯肽0.1 mg／kg利拉魯肽0.2 mg／kg rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg n 10 10 12 10 11 12 11 11給藥后時間（d）0 h 5.30±0.91 6.46±1.39 6.06±3.19 3.95±0.77 8.11±3.09a 6.00±1.37 4.79±1.34 4.90±1.69 0.5 h 10.68±2.04 27.01±2.38aa 22.54±6.01aa 15.65±3.36aa 26.72±5.52aa 23.21±1.83aa 20.99±4.94aa 11.52±3.96 1 h 6.97±1.12 16.38±5.12aa 10.43±4.77 5.63±1.42 17.59±6.44aa 11.41±4.44 11.10±5.26 5.79±1.61 2 h 5.01±0.85 7.21±2.89 4.18±1.13 4.07±0.94 9.46±3.87aa 6.78±2.35 5.95±1.79 4.85±1.51

2.3 PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠FPG、FINS及胰島素敏感性的影響 利拉魯肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF均具有減輕胰島素抵抗的作用（利拉魯肽0.1 mg／kg組：t=3.619，P=0.002；利拉魯肽0.2 mg／kg組：t=4.339，P=0.001；rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=2.342，P=0.032；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg組：t=2.947，P=0.008；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=4.379，P=0.001；PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg組：t=6.457，P=0.000），但PEG-rhCNTF還具有控制血糖（0.1 mg／kg組：t=5.235，P=0.000；0.2 mg／kg組：t=6.666，P=0.000）和減輕高胰島素血癥（0.05 mg／kg組：t=2.942，P=0.008；0.1 mg／kg組：t=2.390，P=0.029；0.2 mg／kg組：t=4.041，P=0.001）的作用，利拉魯肽則未體現(xiàn)出減輕高胰島素血癥的作用（0.1 mg／kg組：t=0.211，P=0.835；0.2 mg／kg組：t=-0.317，P=0.754），rhCNTF不能有效控制血糖（t=-0.320，P=0.753），且其為短效制劑，需每天給藥。見圖1。因此，在減輕胰島素抵抗作用中，PEG-rhCNTF的效果優(yōu)于利拉魯肽和rhCNTF。

圖1 各組ob／ob小鼠FPG（A）、FINS（B）和HOMA-IR（C）Fig.1 FPG（A），F(xiàn)INS（B）and HOMA-IR（C）of ob／ob mice in various groups

續(xù)圖1各組ob／ob小鼠FPG（A）、FINS（B）和HOMAIR（C）Fig.1（Continued）FPG（A），F(xiàn)INS（B）and HOMA-IR（C）of ob／ob mice in various groups

2.4 PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠肝臟和脂肪重量的影響PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg和利拉魯肽0.1 mg／kg組ob／ob小鼠與賦形劑組比較，肝臟重量顯著降低（t分別為3.770和3.887，P分別為0.001和0.01），其余各給藥組與賦形劑組小鼠比較，肝臟重量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（利拉魯肽0.2 mg／kg組：t=1.347，P=0.193；rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=0.717，P=0.481；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=1.573，P=0.131；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg組：t=1.240，P=0.229），表明PEG-rhCNTF有減輕ob／ob小鼠肝濕重的作用。試驗終點時，與賦形劑組腸系膜、后腹膜和皮下脂肪重量比較，PEG-rhCNTF的減脂作用主要體現(xiàn)在減輕皮下脂肪的重量（t=4.958，P=0.000），表明其減肥作用與減輕皮下脂肪含量密切相關(guān)。而利拉魯肽和rhCNTF的減脂作用并不明顯（體脂總重，利拉魯肽0.1 mg／kg組：t=1.919，P=0.069；利拉魯肽0.2 mg／kg組：t=0.215，P=0.832；rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=0.985，P=0.336）。見圖2。

2.5 PEG-rhCNTF對ob／ob小鼠肝臟脂肪病變程度的影響 肝臟組織HE切片觀察顯示，對照組C57小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索明顯，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，動脈壁粉色淺染，肝細胞呈多邊形，胞漿豐富且淺染，細胞核圓形深染且居中，偶見處于分裂期的雙核細胞，可見核仁，匯管區(qū)清晰可辨，無纖維組織增生及炎細胞浸潤病變。與C57小鼠相比，賦形劑組ob／ob小鼠肝臟組織出現(xiàn)重度脂肪性變，光鏡下80%以上肝細胞的胞漿中出現(xiàn)多數(shù)大的脂肪空泡，脂變的肝細胞以中央靜脈向外彌散，越遠離中央靜脈，脂肪空泡越大。肝細胞較正常細胞體積明顯增大，胞漿內(nèi)充滿大小不一的球形脂肪空泡，有的大的脂肪空泡可充滿整個胞漿將胞核擠至一側(cè)，細胞核發(fā)生固縮，甚至有些細胞難以觀察到細胞核，體積變大，變圓，形似脂肪細胞，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯。由于制做切片時脂滴被脂溶性溶劑溶解，只剩下圓形空泡。除了發(fā)生脂肪性變外，賦形劑組ob／ob小鼠肝細胞還出現(xiàn)了匯管區(qū)纖維組織增生，并伴有炎細胞浸潤，小葉間膽管增生，動脈壁增厚且紅染，并伴有細胞核豎立，部分肝細胞出現(xiàn)嗜酸樣變以及少量小灶狀炎細胞浸潤，小葉間出現(xiàn)纖維化。與賦形劑組相比，利拉魯肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF各劑量組ob／ob小鼠肝細胞的以下病變均有所減輕：匯管區(qū)纖維組織增生并伴有炎細胞浸潤，小葉間膽管增生，小灶狀炎細胞浸潤，嗜酸樣變，核固縮以及纖維化；而對動脈壁增厚且紅染，細胞核豎立的癥狀并無減輕作用。見圖3。

圖2 各組ob／ob小鼠的肝臟和脂肪重量Fig.2 Liver and fat weights of ob／ob mice in various groups

圖3 各組ob／ob小鼠的肝臟脂肪病變程度觀察（HE染色，×400）Fig.3 Microscopy of hepatic steatosis of ob／ob mice in various groups（HE staining，×400）

對ob／ob小鼠肝脂肪變性程度的半定量統(tǒng)計結(jié)果表明，利拉魯肽、rhCNTF和PEG-rhCNTF均可減輕肝脂肪變性，與賦形劑組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（利拉魯肽0.1 mg／kg組：t=3.619，P=0.002；利拉魯肽0.2 mg／kg組：t=4.339，P=0.001；rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=2.342，P=0.032；PEG-rhCNTF 0.05 mg／kg組：t=2.947，P=0.008；PEG-rhCNTF 0.1 mg／kg組：t=4.379，P=0.001；PEG-rhCNTF 0.2 mg／kg組：t=6.457，P=0.000），但PEG-rhCNTF的效果優(yōu)于利拉魯肽和rhCNTF。見圖4。

圖4 各組ob／ob小鼠肝臟脂肪變性程度Fig.4 Degrees of hepatic steatosis of ob／ob mice in various groups

3 討 論

本研究通過測定小鼠治療期間體質(zhì)量和24 h飼料消耗量的變化，以及實驗終點時腸系膜脂肪、后腹膜脂肪和皮下脂肪重量，來探討PEG-rhCNTF的減肥作用特點。結(jié)果表明，PEG-rhCNTF減質(zhì)量和食欲抑制效果明顯、穩(wěn)定可靠，且克服了短效、需每天給藥的缺點，其減脂作用主要體現(xiàn)在減輕皮下脂肪的重量。

OGTT是目前公認(rèn)的診斷糖尿病的金標(biāo)準(zhǔn)［24］。通過治療期間對隨機血糖和連續(xù)血糖的監(jiān)測，可得出PEG-rhCNTF具有穩(wěn)定可靠的降糖作用，且具有量效關(guān)系，劑量越大，降糖效果越穩(wěn)定。利拉魯肽和rhCNTF的降糖作用在治療后期均有一定程度的減弱，效果不夠穩(wěn)定，且隨著給藥周期的延長，血糖均出現(xiàn)回升，可能與其免疫原性較強有關(guān)。胰島素抵抗是誘發(fā)糖尿病的主要因素之一。本研究對實驗終點FPG和FINS水平進行測定，并計算HOMA-IR。HOMAIR反映了機體對胰島素的敏感度，其值越小，表明機體對胰島素越敏感。實驗結(jié)果表明，PEG-rhCNTF、利拉魯肽和rhCNTF均具有減輕胰島素抵抗的作用，但PEG-rhCNTF還具有控制血糖和減輕高胰島素血癥的作用，而利拉魯肽未體現(xiàn)出減輕高胰島素血癥的作用，rhCNTF不能有效控制血糖，且其為短效制劑，需每天給藥。因此，在減輕胰島素抵抗作用中，PEGrhCNTF優(yōu)于利拉魯肽和rhCNTF。

肝臟是機體糖代謝和能量代謝的主要器官，當(dāng)機體脂代謝紊亂時，肝臟將過多的甘油三酯轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸并釋放入血，這些游離脂肪酸沉積在機體的外圍組織，引起組織的脂變，并且造成外圍組織胰島素抵抗的發(fā)生［25-26］。對ob／ob小鼠肝脂肪變性程度的半定量統(tǒng)計結(jié)果表明，PEG-rhCNTF、利拉魯肽和rhCNTF均可減輕肝脂肪變性，但PEG-rhCNTF的效果優(yōu)于利拉魯肽和rhCNTF，該組小鼠肝臟脂變程度已接近正常小鼠水平。

綜上所述，PEG-rhCNTF有減輕ob／ob小鼠肝脂肪變性的作用，其短期作用的主要機理是抑制食欲、減少能量攝入，同時還能降低血糖和血胰島素水平，改善糖耐量異常，增強胰島素敏感性。但PEG-rhCNTF目前尚處于臨床前藥理學(xué)研究階段，尚不能確定該藥物能否作為脂肪肝治療的一種有效手段，對其能否應(yīng)用于臨床還需進一步研究。本研究對PEG-rhCNTF的藥效學(xué)和免疫原性研究尚處于起步階段，特別是針對其具體作用機理，仍需進一步開展研究。