郭紫嬋，魏媛，王秀麗，趙蓉，王曉霞

山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001

泛素是一種由76個氨基酸組成的多肽，在真核生物中高度保守［1］。蛋白質(zhì)泛素化過程是通過泛素激活酶E1、E2和E3將泛素共價連接至蛋白質(zhì)底物的賴氨酸殘基上，可調(diào)控真核細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)的發(fā)生及轉(zhuǎn)錄等多種生物功能［2-3］。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）具有從目標(biāo)蛋白上去除泛素，抵消泛素化過程的功能，從而使泛素穩(wěn)態(tài)成為一個高度動態(tài)的過程［4］，這種穩(wěn)態(tài)的破壞可能會導(dǎo)致多種疾病發(fā)生［5］。目前，共有7個結(jié)構(gòu)不同的去泛素酶家族，其中泛素特異性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases，USPs）是最大的家族之一，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，USP42是USPs家族成員之一［6］。有研究表明，USP42在胃癌組織中的表達顯著升高，對胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有重要意義，USP42可能成為胃癌治療的一個新靶點［7］。還有報道發(fā)現(xiàn)，let-7b可通過靶向結(jié)合USP42，抑制組蛋白H2Bub1去泛素化，從而抑制裸鼠非小細(xì)胞肺癌異種移植模型中腫瘤的發(fā)生［8］。另外，在2例兒童急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）和8例成人髓系白血?。╩yelocytic leukemia，ML）病例中發(fā)現(xiàn)，USP42可與RUNX1發(fā)生基因融合［9］。上述結(jié)果表明，USP42對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。

本研究通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA和Ualcan對USP42在不同腫瘤組織中的表達水平進行分析，并構(gòu)建USP42shRNA干擾重組質(zhì)粒，檢測其對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中USP42表達的干擾作用，并探討USP42對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116侵襲和遷移的影響，以期后續(xù)為USP42在腫瘤中的作用及機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞 感受態(tài)E.coliDH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；真核表達載體pGPU6／Neo購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116由國家癌癥中心／國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心／中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室提供。

1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基購自北京細(xì)工生物科技公司；0.25%胰蛋白酶消化液、10%胎牛血清及蛋白酶抑制劑均購自蘇州新賽美科技有限公司；Neofect?DNA轉(zhuǎn)染試劑購自北京瑪因科技有限公司；細(xì)胞蛋白裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人USP42單克隆抗體購自美國Proteintech公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自美國Promega公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.3 生物信息學(xué)分析 通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA（http：／／gepia.cancer-pku.cn／）檢索關(guān)鍵詞“USP42，篩選USP42在癌旁及癌組織間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義的箱型圖［10］。通過在線數(shù)據(jù)庫Ualcan（http：／／ualcan.path.uab.edu／）點擊“TCGA analysis”模塊，檢索關(guān)鍵詞“USP42和Colon adenocarcinoma”，點擊“Expression”模塊，得到USP42在人結(jié)腸癌組織和癌旁組織間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義的箱型圖［11］。

1.4USP42shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中登錄的USP42mRNA序列（NM_001389650），選取RNAi靶序列（5'-AGCGGGTTGTCACCAACAA-3'），經(jīng)BLAST檢索確認(rèn)該序列有特異性，根據(jù)shRNA設(shè)計原則設(shè)計USP42-shRNA模板序列，序列為：5'-AGCGGGTTGTCACCAACAATTCAAGAGATTGTTGGTGAC AACCCGCTTTTTTT-3'，從5'→3'依次包括干擾序列（20 bp）、loop環(huán)（TCAAGAG）、反向互補序列（20 bp）、終止信號（TTTTTT）；陰性對照shRNA（NC-shRNA）模板序列為：5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT-3'［12］。兩種序列均由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。用無菌水溶解USP42-shRNA及NC-shRNA寡核苷酸，以其為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件為：90℃4 min、70℃10 min、55℃10 min、40℃10 min、25℃10 min。以T4 DNA連接酶將PCR擴增產(chǎn)物連接至載體pGPU6／Neo，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，37℃培養(yǎng)過夜；挑取陽性克隆至5 mL LB培養(yǎng)基中進行擴增后，送上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為USP42-shRNA。

1.5 重組質(zhì)粒的表達 將HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達60%～80%時，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，用Neofect?DNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒USP42-shRNA，同時設(shè)對照組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NC-shRNA），收集轉(zhuǎn)染48 h后的HCT116細(xì)胞。用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取30μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗USP42單克隆抗體（1∶500稀釋）及鼠抗人β-actin單克隆抗體（1∶5 000稀釋），4℃孵育過夜；用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000稀釋）及HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶3 000稀釋），室溫孵育1 h，ECL法顯色。應(yīng)用Image J軟件計算USP42／β-actin條帶灰度比值。

1.6 USP42對HCT116細(xì)胞遷移及侵襲能力影響的檢測 采用Transwell小室試驗。將轉(zhuǎn)染48 h后的HCT116細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；取2×105個細(xì)胞加入Transwell上室，下室中加入含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；取出小室，棉棒擦除未遷移的細(xì)胞，甲醇固定10 min；用1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照，并進行細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞侵襲試驗需在每個上室中加入2%的基質(zhì)膠100μL，其他操作同上。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)比較采用非配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP42在腫瘤組織中的表達GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，USP42在多種腫瘤組織中表達，在膽管癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、胃癌和胸腺癌組織中表達顯著高于癌旁組織（P＜0.05），見圖1。Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示，USP42在結(jié)腸癌組織中表達顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見圖2。表明USP42可能是導(dǎo)致這些腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。

圖1 USP42在多種腫瘤組織中的表達情況Fig.1 Expression of USP42 in various tumor tissues

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 測序結(jié)果表明，設(shè)計合成的USP42-shRNA序列與預(yù)期序列相符，見圖3。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.3 USP42蛋白在HCT116細(xì)胞中的表達水平 對照組及干擾組HCT116細(xì)胞中USP42的表達水平分別為（0.937 44±0.043 20）和（0.157 61±0.048 61）。與對照組比較，干擾組HCT116細(xì)胞中USP42表達水平顯著降低（t=16.97，P＜0.001），見圖4。

圖2 USP42在結(jié)腸癌組織中的表達情況Fig.2 Expression level of USP42 in COAD tissue

圖3 USP42-shRNA重組質(zhì)粒測序圖譜Fig.3 Sequencing map of recombinant plasmid USP42-shRNA

圖4 Western blot法檢測HCT116細(xì)胞中USP42的表達Fig.4Western blotting of USP42 expressionin HCT116 cells

2.4 USP42對HCT116細(xì)胞侵襲及遷移的影響 對照組及干擾組HCT116細(xì)胞的侵襲數(shù)分別為（33±6.976 15）和（16±1.699 67），遷移數(shù)分別為（25±1.699 67）和（9±1.699 67）。與對照組比較，干擾組HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著降低（t分別為4.974和7.787，P＜0.01），見圖5。

圖5 干擾USP42表達后對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（標(biāo)尺為：200μm）Fig.5 Effect of interference of USP42 expression on migration and invasion of HCT116 cells（bar=200μm）

3 討論

USP42是一種由1 316個氨基酸組成的DUBs，在多種組織中表達，并可在細(xì)胞中切割泛素，從而實現(xiàn)去泛素化［13］。USP42還參與了DNA修復(fù)的過程，通過與DNA-RNA解旋酶DHX9相互作用，促進r環(huán)解離，增強DNA同源重組的修復(fù)［14］。據(jù)報道，USP42可影響抑癌基因p53的穩(wěn)定性和功能。p53的穩(wěn)定性受到泛素化和去泛素化過程的嚴(yán)格調(diào)控，泛素連接酶MDM2可介導(dǎo)p53的泛素化［15］；而USP42可與p53形成直接復(fù)合物使其去泛素化，從而抑制p53的降解［13，16-17］。

為進一步研究USP42在腫瘤中的作用，本研究首先通過GEPIA和Ualcan網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析了USP42在不同腫瘤組織中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP42在膽管癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、胃癌、胸腺癌、食管癌和結(jié)腸癌組織中表達顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。目前已有報道表明，USP42與AML及胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［7，9］，但關(guān)于USP42對膽管癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、胸腺癌、食管癌和結(jié)腸癌等的影響，目前尚未見相關(guān)文獻報道。

上述結(jié)果表明，USP42可能在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，但作用機制尚未明確，因此本研究采用RNAi技術(shù)，設(shè)計合成了針對USP42基因的特異性shRNA靶序列，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒USP42-shRNA，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116后，經(jīng)Western blot檢測表明，USP42表達水平顯著降低（P＜0.01），表明構(gòu)建的USP42干擾重組質(zhì)?？稍诩?xì)胞中高效特異性地抑制USP42的表達。另外，通過Transwell小室試驗證明，干擾USP42表達后能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究為后續(xù)進一步研究USP42在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機制及在靶向治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。