張娟，魯明，朱海蓮，何麗存，顧冉，李代英，3，陳俊英，3，潘玥，3，孫強(qiáng)明，3

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118；3.云南省蟲媒傳染病防控研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000

外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中，是由活細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的外囊泡，直徑為30～150 nm，密度在1.10～1.20 g／mL之間［1］。起初，外泌體被當(dāng)作細(xì)胞的“代謝廢物”，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)外泌體在生物體的生理學(xué)和病理學(xué)中發(fā)揮著重要作用［2］。外泌體可包裹蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性分子，經(jīng)過“內(nèi)吞-融合-外排”等一系列過程到達(dá)機(jī)體各處，進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3-5］。

登革病毒（Dengue virus，DENV）為單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，包括4種不同的血清型，每一型均具有傳染性且能致?。?-7］。DENV通過白紋伊蚊和埃及伊蚊叮咬后傳播，引發(fā)登革熱，是全球分布最廣、發(fā)病較多、危害較大的一種蟲媒病疾?。?］。乳倉鼠腎細(xì)胞（baby hamster syrian kidney，BHK）是培養(yǎng)和分離DENV的哺乳細(xì)胞系之一，該細(xì)胞易培養(yǎng)，增殖快，對病毒易感，在研發(fā)和生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛［9］。

外泌體的形成和釋放依賴多泡體（multivesicular bodies，MVBs）與質(zhì)膜的融合，病毒作為細(xì)胞內(nèi)寄生物，必須在細(xì)胞內(nèi)才能完成復(fù)制周期從而產(chǎn)生新的感染性病毒粒子，該過程需要胞內(nèi)囊泡的參與［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)，從豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive respiratory syndrome，PRRS）、甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染細(xì)胞上清中提取的外泌體中包含病毒核酸，可在受體細(xì)胞中建立新的感染且無法被病毒特異性中和抗體阻斷［12-14］。病毒能利用外泌體在宿主靶細(xì)胞之間自由穿梭和準(zhǔn)確定位的特點(diǎn)，將自身基因組和蛋白等病毒組分載入外泌體中，隨體液循環(huán)到達(dá)機(jī)體各處，導(dǎo)致免疫功能的失調(diào)，造成病毒擴(kuò)散及產(chǎn)生免疫抑制［15］。越來越多的研究表明，外泌體在DENV感染細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，ZHU等［16］發(fā)現(xiàn)，干擾素誘導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（interferoninduced transmembrane protein 3，IFITM3）能夠通過外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行交流，從而阻止DENV進(jìn)入細(xì)胞。另有研究證實(shí)，DENV感染C6／36細(xì)胞分泌的外泌體中包含病毒核酸和蛋白，這些外泌體可在未感染的細(xì)胞中建立感染［17-18］。

本研究通過構(gòu)建篩選出一種能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和外泌體標(biāo)志蛋白CD63的BHK-21細(xì)胞系，進(jìn)一步得到GFP標(biāo)記的BHK-21源性外泌體并進(jìn)行鑒定，最后通過共培養(yǎng)和Transwell試驗(yàn)對外泌體進(jìn)行示蹤，觀察外泌體在受體細(xì)胞中的攝取情況以及DENV感染后細(xì)胞外泌體分泌量的變化，為后續(xù)研究外泌體在病毒感染過程中的信號傳遞和細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞及質(zhì)粒 Ⅲ型登革病毒株（基因序列號：KR296744）、BHK-21和293T細(xì)胞均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子流行病研究室保存；pCT-CD63-GFP（CYTO120-PA-1）慢病毒表達(dá)質(zhì)粒購自美國SBI公司；pVS-VG（Env）包膜質(zhì)粒和pSPAX（structure）質(zhì)粒由美國馬里蘭大學(xué)Basile John博士惠贈；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 聚凝胺、嘌呤霉素和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；UItra-Fection 3.0高效轉(zhuǎn)染試劑購自四正柏生物科技（北京）有限公司；mRNA selective PCR kit購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA酶抑制劑和Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；鼠抗CD63、CD81單克隆抗體購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和鼠抗GAPDH單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DIO染液和BSA購自北京索萊寶科技有限公司；ZetaView儀購自德國Particle Metrix公司。

1.3 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取 取100μL冰上融化的E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒pCT-CD63-GFP，輕輕混勻，冰上靜置30 min；42℃水浴熱激45 s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2 min；向離心管中加入500μL無抗性LB培養(yǎng)液，37℃，200 r／min復(fù)蘇60 min；取合適體積的復(fù)蘇液均勻涂布至氨芐抗性（100μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜；待培養(yǎng)基上長出明顯的菌落，挑取單個(gè)菌落，在LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中混勻，37℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)12～13 h后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.4 慢病毒包裝及滴度測定 以2.5×106個(gè)／皿的密度將293T細(xì)胞接種至10 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層后，利用UItraFection 3.0高效轉(zhuǎn)染試劑將pVSVG（Env）包膜質(zhì)粒、pSPAX（structure）質(zhì)粒和pCTCD63-GFP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染8 h后，棄去含有轉(zhuǎn)染混合液的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于更換培養(yǎng)基24、48和72 h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清，使用0.22μm濾膜對病毒液進(jìn)行過濾后，分裝保存至-80℃冰箱。滴度檢測前24 h，將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，將收獲的病毒原液連續(xù)10倍系列稀釋（10-1～10-5），加入板中，100μL／孔，同時(shí)設(shè)空白對照組，培養(yǎng)48 h；加入100μL新鮮培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d。熒光顯微鏡下觀察，利用倍比稀釋法檢測慢病毒滴度，對熒光比例合適（10%～30%）的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按下式計(jì)算病毒滴度。

1.5 慢病毒感染BHK-21細(xì)胞 取生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞，胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)基，鋪入6孔板中，2 mL／孔，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h；待細(xì)胞密度長至80%時(shí)，加入慢病毒和聚凝胺，輕輕混勻，至細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；48和72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)GFP-CD63 BHK-21細(xì)胞株的篩選將BHK-21細(xì)胞按4×104個(gè)／孔的密度接種24孔板，待其長至單層，依次加入終濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10μg／mL的嘌呤霉素，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞存活率，確定抗生素篩選開始4～6 d內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物最低濃度。

取出經(jīng)慢病毒感染的靶細(xì)胞，加入最佳濃度的嘌呤霉素，每隔3 d更換新的含嘌呤霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)篩選。篩選2周后出現(xiàn)細(xì)胞克隆，熒光顯微鏡下挑取單個(gè)綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中CD63蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。收取GFP-CD63-BHK-21和BHK-21細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入抗CD63和GAPDH單克隆抗體（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h。經(jīng)ECL系統(tǒng)曝光顯影后獲得相應(yīng)條帶。

1.8 外泌體提取 取穩(wěn)定表達(dá)GFP的BHK-21細(xì)胞株，用10%不含外泌體血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h后收集細(xì)胞上清100 mL，按照以下步驟提取外泌體：4℃，300×g離心10 min去除細(xì)胞；2 000×g離心10 min去除死細(xì)胞；10 000×g離心30 min去除細(xì)胞碎片；100 000×g超速離心70 min，100μL PBS重懸沉淀，-80℃保存。

1.9 外泌體鑒定

1.9.1 標(biāo)志蛋白CD63和CD81的檢測 采用Western blot法。使用RIPA裂解液（含1% PMSF）裂解外泌體，測定蛋白濃度，確定上樣量。樣品與5×SDS變性緩沖液煮沸變性后，經(jīng)12%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入鼠抗CD63和CD81單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4℃過夜；加入山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL顯影。以GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞裂解液作為陽性對照。

1.9.2 形態(tài)特征觀察 取10μL新鮮提取的外泌體，3%磷鎢酸負(fù)染1～2 min，室溫干燥后用透射顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。

1.9.3 粒徑分析 將提取的外泌體沉淀用PBS稀釋至合適濃度，使用Zetaview儀，通過納米顆粒示蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術(shù)檢測外泌體粒子分布大小。

1.9.4 熒光顯微鏡觀察 將20μL提取的外泌體樣品，用PBS稀釋至100μL，滴至載玻片上，熒光顯微鏡下觀察熒光狀態(tài)。

1.10 外泌體攝取試驗(yàn) 將BHK-21細(xì)胞接種至6孔板，置37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取20μg提取的GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞源外泌體，與BHK-21細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，同時(shí)以DIO標(biāo)記的BSA作為對照；孵育結(jié)束后，DAPI染色5 min，熒光顯微鏡觀察BHK-21細(xì)胞攝取外泌體情況。

1.11 DENV感染對外泌體釋放影響的檢測 采用Transwell法。將GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞置于孔徑為0.4μm的Transwell小室上室，下室為BHK-21細(xì)胞。DENV按MOI=1感染上室細(xì)胞，同時(shí)設(shè)PBS對照組，24 h后，通過熒光顯微鏡觀察下室細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，評估上室細(xì)胞外泌體的釋放量。模式圖見圖1。

為了驗(yàn)證Transwell法的準(zhǔn)確性，將GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞接種至T75瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，按MOI=1接種DENV，同時(shí)設(shè)PBS對照組，感染2 h后，更換為含2%無外泌體血清的細(xì)胞維持液培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，提取外泌體。通過NTA和Western blot法檢測外泌體濃度。

圖1 Transwell法檢測外泌體釋放的模式圖Fig.1 Pattern diagram of determination of exosome release by Transwell assay

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SEM）表示，通過Graphpad Prism 6軟件，采用Student-t檢驗(yàn)分析組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次。胞團(tuán)，見圖6B。挑取單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，重復(fù)篩選3次，最終獲得1株可穩(wěn)定表達(dá)GFP-CD63融合蛋白的BHK-21單克隆細(xì)胞株，命名為GFP-CD63-BHK-21。

圖2 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒的熒光顯微鏡觀察（×100）Fig.2 Fluorescence microscopy of 293T cells transfected with packaged virus（×100）

圖3 慢病毒滴度檢測（熒光顯微鏡，×100）Fig.3 Determination of lentivirus titer（fluorescence microscopy，×100）

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒的包裝及滴度 熒光顯微鏡下觀察可見，重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCT-CD63-GFP與輔助質(zhì)粒pVS-VG（Env）、pSPAX（structure）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24 h，GFP已表達(dá)；48 h時(shí)，GFP表達(dá)增多；72 h收集病毒液。見圖2。慢病毒稀釋至10-3時(shí)，熒光比例為20%，細(xì)胞總數(shù)為2×103個(gè)，病毒滴度=2×103×20%×103／0.01=4×107（TU／mL），見圖3。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)GFP-CD63融合蛋白細(xì)胞株的篩選加入嘌呤霉素第5天，嘌呤霉素濃度為0μg／mL時(shí)，BHK-21細(xì)胞存活率為95%，形態(tài)正常；嘌呤霉素濃度為2μg／mL時(shí)，部分細(xì)胞皺縮變圓；嘌呤霉素濃度為3μg／mL時(shí)，細(xì)胞存活率為0%。見圖4。因此確定在BHK-21細(xì)胞中，嘌呤霉素最佳篩選濃度為3μg／mL。重組慢病毒感染BHK-21細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見，80%～90%的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，見圖5。之后加入3μg／mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，36 h后細(xì)胞大量死亡，見圖6A，攜帶嘌呤霉素抗性基因的細(xì)胞存活；經(jīng)2周篩選，得到單克隆細(xì)

圖4 BHK-21細(xì)胞加入不同濃度嘌呤霉素5 d后的倒置相差顯微鏡觀察（×100）Fig.4 Inverted phase contrast microscopy of BHK-21 cells 5 d after addition with different concentrations of puromycin（×100）

圖5 慢病毒感染BHK-21細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察（×100）Fig.5 Fluorescence microscopy of BHK-21 cells infected with lentivirus（×100）

圖6 穩(wěn)定表達(dá)GFP-CD63融合蛋白細(xì)胞系的篩選Fig.6 Screening of cell lines stably expressing GFP-CD63 fusion protein

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中CD63蛋白的表達(dá)Western blot分析顯示，與BHK-21細(xì)胞相比，GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞內(nèi)CD63蛋白的表達(dá)量明顯升高（t=-4.524，P=0.001），見圖7。

圖7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的Western blot鑒定Fig.7 Western blotting of stably transfected cell lines

2.4 GFP-CD63-BHK-21源性外泌體的鑒定

2.4.1 標(biāo)志蛋白CD63和CD81的檢測Western blot分析顯示，外泌體存在特異性標(biāo)志蛋白CD63和CD81，見圖8。

圖8 Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81Fig.8 Western blotting of exosome marker proteins CD63 and CD81

2.4.2 形態(tài)特征 透射電鏡觀察可見，外泌體呈橢圓形，具有雙凹圓盤狀膜結(jié)構(gòu)，直徑在30～200 nm之間，見圖9。

圖9 外泌體的透射電鏡觀察（×20 000）Fig.9 Transmission electron microscopy of exosomes（×20 000）

2.4.3 粒徑分析NTA檢測顯示，外泌體在110.2 nm處有峰值，見圖10。

2.4.4 熒光顯微鏡觀察 提純后的外泌體發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光信號，見圖11。

2.5 外泌體攝取GFP-CD63-BHK-21細(xì)胞分離得到的外泌體與BHK-21細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后，BHK-21細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光顆粒，而DIO標(biāo)記的BSA未觀察到綠色熒光，表明外泌體可作為載體在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。見圖12。

2.6 DENV感染對外泌體釋放的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，DENV感染24 h后，感染組的熒光強(qiáng)度高于PBS組，見圖13。表明DENV可刺激細(xì)胞分泌外泌體，且供體細(xì)胞（GFP-CD63-BHK-21）產(chǎn)生的外泌體可被受體細(xì)胞（BHK-21）有效攝取。

NTA檢測結(jié)果顯示，DENV感染細(xì)胞上清中外泌體顆粒含量約為2.5×105個(gè)／mL，PBS組為1.2×105個(gè)／mL，病毒感染誘導(dǎo)外泌體釋放量增加了2倍。Western blot結(jié)果同樣證實(shí)了DENV感染可促進(jìn)GFPCD63-BHK-21細(xì)胞外泌體的釋放（t=13.816，P=0.000），見圖14。

圖10 粒徑分析檢測外泌體直徑Fig.10 Exosome diameter determined by particlesize analysis

圖11 熒光顯微鏡下觀察提純的外泌體（×100）Fig.11 Fluorescence microscopy of purified exosomes（×100）

圖12 BHK-21細(xì)胞攝取外泌體的熒光顯微鏡觀察（×400）Fig.12 Fluorescence microscopy of uptake of exosomes in BHK-21 cells（×400）

圖13 熒光顯微鏡觀察Transwell小室下室細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（×100）Fig.13 Fluorescence microscopy of fluorescence intensity of cells in lower chamber of Transwell（×100）

圖14 Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)Fig.14 Western blotting of expression of exosome marker protein CD63

3 討論

外泌體是一類由細(xì)胞分泌的直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，可轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性分子，介導(dǎo)細(xì)胞間信息交流［19］。由于外泌體屬于納米顆粒，常規(guī)檢測技術(shù)難以直接觀測到，因此，在追蹤外泌體在細(xì)胞間活動或活體動物體內(nèi)行為時(shí)，需對外泌體進(jìn)行標(biāo)記。目前常用熒光染料、熒光蛋白、熒光素酶和物理標(biāo)記等多種標(biāo)記方法，不同的標(biāo)記方法各有特點(diǎn)［20-22］。GFP是一種常用的報(bào)告蛋白，可利用自身結(jié)構(gòu)催化形成生色團(tuán)，將外泌體膜內(nèi)外的蛋白分子與熒光蛋白偶聯(lián)，構(gòu)建出特定的融合蛋白，帶熒光的膜蛋白會表達(dá)至外泌體膜上，通過檢測融合蛋白發(fā)出的熒光信號對外泌體進(jìn)行示蹤分析［23］。與熒光染料法相比，GFP在標(biāo)記活細(xì)胞和活性組織時(shí)無細(xì)胞毒性，靈敏度高，半衰期長，熒光性質(zhì)穩(wěn)定［24-25］。用GFP標(biāo)記外泌體，易于熒光顯微鏡觀察，更適用于實(shí)驗(yàn)周期較長的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)。

本研究構(gòu)建了能夠融合表達(dá)CD63外泌體標(biāo)記蛋白和GFP的BHK-21細(xì)胞株，并進(jìn)行外泌體的提取和鑒定。熒光顯微鏡觀察可見，提取的外泌體均能發(fā)出綠色熒光。將外泌體與BHK-21細(xì)胞共培養(yǎng)，6 h后可在BHK-21細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到大量綠色熒光顆粒，表明外泌體可被受體細(xì)胞所攝取。相對NTA和Western blot法，利用Transwell法檢測外泌體釋放量，通過檢測下室受體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來評估上室細(xì)胞外泌體分泌量，操作簡單且便于觀察。研究顯示，許多病毒可將自身蛋白、核酸或完整的病毒顆粒載入外泌體中在細(xì)胞間進(jìn)行傳播，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行感染和擴(kuò)散。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）等病毒可利用外泌體釋放通路完成自身的復(fù)制與釋放，而病毒感染會導(dǎo)致細(xì)胞代謝活動發(fā)生改變進(jìn)而影響外泌體的釋放，調(diào)控機(jī)體的免疫、凋亡、代謝等生理病理過程［26-27］。為了探討外泌體在DENV中的作用，后續(xù)我們將提純出DENV感染GFP-CD63-BHK-21來源的外泌體，與受體細(xì)胞共培養(yǎng)，并將外泌體注射入小鼠進(jìn)行示蹤，研究外泌體在機(jī)體內(nèi)外的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。由于GFP在體內(nèi)外示蹤的優(yōu)越性，以及外泌體在病毒感染中起著重要作用，GFP標(biāo)記的外泌體將可能成為病毒傳播機(jī)制研究中的有力工具。