劉德珍，沈克飛，付利芝，徐登峰，張素輝

1.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院 重慶 402460；2.重慶市畜牧科學(xué)院 重慶 402460

化膿性感染是一種常見的接觸性傳染病，由化膿菌（pyogenic bacteria）通過受損皮膚或黏膜感染而引起，造成組織化膿性或壞死性病變?；撾[秘桿菌（Trueperella pyogenes）是動(dòng)物化膿性感染的常見病原菌，人通過與患病動(dòng)物的密切接觸也能被其感染［1-4］?；撾[秘桿菌在山羊化膿性感染病例中分離率較高［5］，感染主要引發(fā)山羊淋巴結(jié)炎、牙齦炎、化膿性肺炎、流產(chǎn)、死胎等臨床癥狀［5-7］，其中化膿性肺炎對山羊健康危害最大。化膿隱秘桿菌感染引發(fā)的山羊肺炎一般為慢性消耗性疾?。?］，感染早期不易被發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出臨床癥狀時(shí)又因細(xì)菌耐藥性而難以治療［9］，影響羔羊成活率，降低了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益?；撾[秘桿菌為革蘭陽性菌，是動(dòng)物皮膚、上呼吸道和泌尿生殖道黏膜微生物群落的一部分，同時(shí)也是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌［1］。

目前，在化膿隱秘桿菌感染、免疫中抗體應(yīng)答方面的研究報(bào)道不多?；撾[秘桿菌已報(bào)道的抗原有溶血素（pyolysin，PLO）和鐵ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合蛋白——鐵結(jié)合蛋白（iron-binding protein，IBP）等，PLO和IBP在分離株中普遍存在，也是該菌的免疫保護(hù)性抗原［1，10-11］，研究兩者在感染和疫苗免疫過程中的抗體應(yīng)答，可為血清學(xué)檢測靶標(biāo)選擇及疫苗研發(fā)提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。另外，盡管化膿隱秘桿菌是山羊化膿性感染的常見病原菌，但對其流行情況了解不多。為此，本研究利用ELISA方法測定感染模型、圈養(yǎng)羔羊、免疫動(dòng)物血清中抗PLO和IBP的IgG抗體水平，以期了解感染強(qiáng)度、組織損傷與抗PLO抗體水平的相關(guān)性及免疫動(dòng)物中PLO和IBP的抗體應(yīng)答情況，為化膿隱秘桿菌感染的鑒定及評價(jià)滅活苗免疫效果的血清學(xué)檢測靶標(biāo)選擇提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株及血清 化膿隱秘桿菌山羊分離株由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所分離、鑒定及提供［6］，rPLO小鼠抗血清、表達(dá)rPLO（37-281位氨基酸殘基）（pET-28a-PLO）［12］和rIBP（pGEX-4T-1-IBP）［11］的重組大腸埃希菌BL21（DE3）、化膿隱秘桿菌陰性山羊血清［12］均由該所保存和提供；540份羔羊血清采自重慶地區(qū)規(guī)?；窖蝠B(yǎng)殖場，羔羊無體表膿腫和呼吸道疾病，圈養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器TSA、TSB、蛋白胨和酵母提取物均購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體均購自美國EarthOx Life Sciences公司；Gluthathione-Sepharose 4B和Ni-NTA填料購自北京諾和生物技術(shù)有限公司；Quick Start Bradford購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；BCTP／NBT購自生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB單組分顯色液購自索萊寶生物科技有限公司；酶標(biāo)板購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；明膠購自廣州賽國生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級昆明小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量約為25 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2019-0008；用于免疫的山羊?yàn)?月齡羔羊，由重慶某規(guī)?；窖蝠B(yǎng)殖場提供。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照重慶市畜牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（文件號：C9aa2020014）。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng) 將化膿隱秘桿菌單菌落接種于含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)48 h；將新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋后涂布于含8%小牛血清的TSA平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長成可見菌落后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.5 小鼠感染模型的建立 將PBS和新鮮培養(yǎng)的100～10-5稀釋的化膿隱秘桿菌，采用腹腔注射方式接種健康昆明小鼠［12］，0.2 mL／只，各注射20只。觀察小鼠死亡、注射部位病變情況。以注射部位未出現(xiàn)組織病變劑量對20只健康小鼠腹腔注射新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌，間隔2 d注射1次，連續(xù)3次，觀察小鼠死亡、注射部位皮膚病變情況。最后1次注射后的2、4、8周，隨機(jī)各取5只小鼠，經(jīng)眶前靜脈竇采血，分離血清，用于抗體水平檢測。

1.6 PLO檢測 新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌經(jīng)6 000×g離心10 min，保留上清，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用截留分子量為10 000的膜塊進(jìn)行超濾濃縮，最終濃縮液體積約為初始體積的1／10。Western blot法鑒定濃縮液中的PLO：濃縮液樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST洗滌3次，與rPLO小鼠抗血清（1∶100稀釋）室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h；最后置BCTP／NBT中顯色。PLO相對分子質(zhì)量為54 500。

1.7 動(dòng)物免疫 向新鮮的化膿隱秘桿菌培養(yǎng)物（≥1×1010CFU／mL）中加入0.2%甲醛溶液，37℃滅活24 h，每6 h振搖1次。向無菌檢驗(yàn)合格的滅活細(xì)菌培養(yǎng)物中加入弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑制備成抗原。采用肌肉注射途徑免疫動(dòng)物，每只小鼠0.2 mL，共45只；每只山羊1 mL，共10只。小鼠和山羊均進(jìn)行3次免疫，每次間隔2周。第1次免疫使用弗氏完全佐劑制備的抗原，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑制備的抗原。第3次免疫后2周采集小鼠眶前靜脈血或山羊靜脈血，分離血清，用于抗體水平檢測。

1.8 重組蛋白的制備 將含pET-28a-PLO和pGEX-4T-1-IBP的重組大腸埃希菌BL21（DE3）分別接種至LB培養(yǎng)基中，37℃，180 r／min振搖培養(yǎng)至菌體A600約為0.6時(shí)，加入終濃度0.1 mmol／L的IPTG，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)3 h，收集菌體。冰水浴中超聲裂解菌體（超聲功率為300 W，工作4 s間歇5 s，超聲裂解15 min）。采用Ni-NTA或Gluthathione-Sepharose 4B親和層析法從裂解菌體中純化rPLO或rIBP，12% SDS-PAGE分析純化結(jié)果（rPLO和rIBP相對分子質(zhì)量分別為29 000和57 500）。經(jīng)0.22μm濾器過濾后，采用Quick Start Bradford測定蛋白質(zhì)濃度。

1.9 抗原包被酶標(biāo)板的制備 制備rPLO和rIBP包被的酶標(biāo)板，分別稱為rPLO-ELISA和rIBP-ELISA：采用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋抗原rPLO和rIBP，每孔加入稀釋抗原100μL，抗原用量為0.2μg，4℃包被過夜；用200μL PBST洗滌3次，加入2%明膠溶液，200μL／孔，37℃封閉2 h；用200μL PBST洗滌3次，備用。

1.10 血清抗體水平檢測 將小鼠感染模型、圈養(yǎng)羔羊、免疫動(dòng)物血清1∶100稀釋，加入包被酶標(biāo)板孔中，100μL／孔，37℃孵育1 h；用200μL PBST洗滌3次，加入酶標(biāo)抗體（1∶20 000稀釋），100μL／孔，37℃孵育1 h；用200μL PBST洗滌3次，加入TMB單組分顯色液，100μL／孔，室溫反應(yīng)10 min；加入2 mol／L硫酸溶液，50μL／孔，終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值。測定結(jié)果以A450平均值（）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。計(jì)算PBS注射小鼠血清、化膿隱秘桿菌陰性山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450的和SD，以樣本的A450＞+3SD時(shí)判為陽性，設(shè)定陰陽性臨界值=+3SD［12］。

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染模型的建立 腹腔注射不同稀釋度的化膿隱秘桿菌，隨著細(xì)菌數(shù)量的降低，小鼠從死亡、注射部位出現(xiàn)化膿及皮膚壞死到不表現(xiàn)出明顯癥狀。注射2×109CFU以上細(xì)菌對小鼠致死率高于80%，小鼠在1周內(nèi)死亡，存活小鼠注射部位出現(xiàn)化膿及皮膚壞死，見圖1；（1～8）×108CFU細(xì)菌對小鼠無致死性，所有小鼠注射部位出現(xiàn)化膿及皮膚壞死；注射5×107CFU以下細(xì)菌，所有小鼠注射部位未出現(xiàn)化膿、皮膚壞死及死亡；間隔2 d連續(xù)3次注射2×107CFU細(xì)菌，所有小鼠注射部位未出現(xiàn)化膿、皮膚壞死及死亡。PBS注射小鼠未出現(xiàn)化膿和皮膚壞死癥狀。

圖1 小鼠接種部位組織病變Fig.1 Tissue lesion of mice in injection site

2.2 PLO檢測Western blot分析顯示，超濾濃縮的化膿隱秘桿菌培養(yǎng)物上清與rPLO小鼠抗血清反應(yīng)顯現(xiàn)1條帶，相對分子質(zhì)量約為55 000，與PLO預(yù)期大小相符，見圖2。表明化膿隱秘桿菌用含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基在37℃振搖培養(yǎng)48 h有PLO分泌。

圖2 化膿隱秘桿菌PLO的Western blot分析Fig.2 Western blotting of PLO of T.pyogenes

2.3 重組蛋白的純化 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，利用Ni-NTA從含pET-28a-PLO的重組菌中純化得到rPLO，濃度為1.21 mg／mL，純度為95%；利用Gluthathione-Sepharose 4B從含pGEX-4T-1-IBP的重組菌中純化得到rIBP，濃度為0.84 mg／mL，純度為88%。見圖3。

2.4 血清抗體水平

2.4.1 小鼠感染模型血清 以PBS注射小鼠血清rPLOELISA和rIBP-ELISAA450的x+3SD確定小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA的陰陽性臨界值，結(jié)果分別為0.345和0.382。腹腔注射化膿隱秘桿菌2周后，注射1×108CFU以上細(xì)菌的存活小鼠和連續(xù)注射2×107CFU細(xì)菌小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450均遠(yuǎn)高于臨界值，見表1。注射后2、4、8周，單次注射5×107CFU以下細(xì)菌的小鼠僅能檢測到低水平的抗IBP抗體，檢測不到明顯的抗PLO抗體。

圖3 重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified recombinant proteins

表1 ELISA法檢測腹腔注射化膿隱秘桿菌后2周小鼠血清中抗PLO和IBP的IgG抗體水平（A450，x±SD，n=5）Tab.1 Determination of IgG levels against PLO and IBP in sera of mice 2 weeks after intraperitoneal injection with T.pyogenes by ELISA（A450，x±SD，n=5）

2.4.2 臨床圈養(yǎng)羔羊血清 以化膿隱秘桿菌陰性山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450的x+3SD確定山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA的陰陽性臨界值，結(jié)果分別為0.466和0.388。540份圈養(yǎng)羔羊血清rPLO-ELISA的陽性率為26.38%，rIBP-ELISA的陽性率為11.11%，rIBP-ELISA與rPLO-ELISA的陽性符合率為100%，但rPLO-ELISA和rIBP-ELISA讀值均偏低。

2.4.3 免疫動(dòng)物血清 第3次免疫后2周，30%小鼠血清rPLO-ELISAA450低于陰陽性臨界值，33.3%山羊血清rPLO-ELISAA450低于陰陽性臨界值，而對應(yīng)血清的rIBP-ELISA檢測結(jié)果為陽性，見表2。表明滅活化膿隱秘桿菌不能使所有免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗PLO的IgG抗體，但能產(chǎn)生抗IBP的IgG抗體。

表2 ELISA法檢測化膿隱秘桿菌免疫動(dòng)物血清中抗PLO和IBP的IgG抗體水平（A450，x±SD）Tab.2 Determination of IgG levels against PLO and IBP in sera of animals immunized with T.pyogenes by ELISA（A450，x±SD）

3 討 論

馮峰［13］通過腹腔注射化膿隱秘桿菌研究其對小鼠的致病性，結(jié)果表明，該菌可感染小鼠?；撾[秘桿菌的毒力與plo基因的表達(dá)水平有關(guān)，感染宿主體內(nèi)plo基因表達(dá)水平高的菌株毒力更強(qiáng)［14］。PLO是化膿隱秘桿菌分泌的唯一外毒素，能溶解包括紅細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞。PLO的細(xì)胞溶解活性能使細(xì)菌獲得在宿主體內(nèi)復(fù)制所必需的游離鐵和其他生長因子，對化膿隱秘桿菌體內(nèi)生存和疾病發(fā)展具有重要意義［1］。在很多研究中，使用細(xì)胞模型和動(dòng)物感染模型對PLO與疾病發(fā)展的相關(guān)性進(jìn)行評估，應(yīng)用培養(yǎng)的牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞闡明了PLO參與組織損傷，在小鼠模型中進(jìn)行的研究表明PLO與腹膜炎有關(guān)，PLO對小鼠和兔子有致死作用，靜脈和腹腔注射后對豚鼠有皮膚壞死作用［1，14-17］。腹腔注射1×108CFU以上化膿隱秘桿菌，引發(fā)小鼠注射部位出現(xiàn)化膿和皮膚壞死，甚至導(dǎo)致小鼠死亡，在存活小鼠血清中檢測到高水平抗PLO抗體。腹腔注射5×107CFU以下化膿隱秘桿菌，小鼠注射部位未觀察到組織病變，血清中檢測不到明顯的抗PLO抗體，而在連續(xù)注射小鼠血清中均檢測到高水平的抗PLO抗體。表明抗PLO的抗體水平與機(jī)體感染的化膿隱秘桿菌數(shù)量或感染頻率呈正相關(guān)，與組織病變相關(guān)，提示PLO的表達(dá)水平高低可能與感染造成的組織損傷程度呈正相關(guān)。圈養(yǎng)羔羊體內(nèi)低抗PLO抗體水平與無體表膿腫和呼吸道疾病癥狀，也間接說明抗PLO抗體水平與臨床癥狀相關(guān)。

鐵是一種必需微量元素，參與細(xì)菌多種關(guān)鍵代謝途徑，包括生物合成、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、呼吸和氧化應(yīng)激反應(yīng)等［18］。病原菌擁有高效的鐵攝取系統(tǒng)，以維持體內(nèi)外生存和毒力，抵御宿主的殺菌作用［19］。革蘭陽性細(xì)菌鐵攝取系統(tǒng)主要有鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、二價(jià)金屬離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、血紅素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體等［20］，它們在不同的宿主體內(nèi)微環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)差異表達(dá)，以適應(yīng)病原菌在體內(nèi)的生存環(huán)境。在腹腔注射的感染模型中，除了在出現(xiàn)化膿和皮膚壞死的小鼠血清中檢測到抗IBP抗體，在未觀察到注射部位組織病變的小鼠血清中檢測到一定水平的抗IBP抗體，表明IBP在化膿隱秘桿菌通過腹腔注射途徑的感染過程中表達(dá)，提示化膿隱秘桿菌在該感染途徑中可能通過鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體從宿主體內(nèi)攝取鐵元素。

化膿隱秘桿菌感染能刺激機(jī)體產(chǎn)生感染或免疫能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PLO特異性抗體，基于抗PLO抗體的間接ELISA法具有良好的特異性［12，21］。圈養(yǎng)羔羊血清中抗PLO的IgG抗體陽性率高，表明化膿隱秘桿菌在圈養(yǎng)羔羊群體中的感染率很高，盡管感染強(qiáng)度不高，提示化膿隱秘桿菌對圈養(yǎng)羔羊健康有潛在威脅。高感染率可能是造成化膿隱秘桿菌在山羊肺炎病例中高分離率的原因［5］。圈養(yǎng)羔羊化膿隱秘桿菌高感染率提示防控化膿隱秘桿菌感染需保持好圈舍清潔衛(wèi)生和提高飼養(yǎng)管理水平。

雖然化膿隱秘桿菌在含8%小牛血清的TSB培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)48 h有PLO分泌，但含量低，需濃縮才能通過Western blot檢測出來。用分泌有PLO的滅活化膿隱秘桿菌培養(yǎng)物免疫小鼠和山羊，均有部分動(dòng)物未產(chǎn)生PLO抗體，可能與PLO含量太低、免疫動(dòng)物個(gè)體差異等因素有關(guān)。培養(yǎng)基營養(yǎng)、培養(yǎng)條件等因素會(huì)影響化膿隱秘桿菌毒力因子的表達(dá)及表達(dá)水平［10］，考慮到PLO是化膿隱秘桿菌的主要毒力因子和保護(hù)性抗原，在滅活疫苗研制中需篩選利于提高體外培養(yǎng)過程中PLO分泌水平的培養(yǎng)基營養(yǎng)、培養(yǎng)條件。鑒于不同濃度的PLO對免疫機(jī)體免疫功能的影響不同［1］，考查PLO的活性可能也是化膿隱秘桿菌免疫中應(yīng)注意的問題。考慮到偽結(jié)核棒狀桿菌感染小鼠血清與rIBP有明顯的交叉反應(yīng)［21］，且抗PLO抗體水平與感染強(qiáng)度、組織損傷強(qiáng)度有關(guān)，rPLO-ELISA更適用于檢測化膿隱秘桿菌臨床感染情況、評價(jià)化膿隱秘桿菌滅活疫苗的免疫預(yù)防效果。