劉晶晶，李玉華

中國食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室，北京 102629

森林腦炎（forest encephalitis）又名蜱傳腦炎（tickborne encephalitis，TBE），是由森林腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的一種以入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要特征的急性傳染病，致死率高達20%～30%［1］。我國《人間傳染的病原微生物名錄》將TBEV定為第一類危害程度的高風險微生物。TBE的流行對歐亞大陸的公共衛(wèi)生安全造成了嚴重威脅。近年，我國報告的TBE發(fā)病率呈上升趨勢，東北、西北和西南為主要發(fā)病地區(qū)［2］。目前，尚無針對TBE的特異性治療方法及藥物，接種疫苗是預(yù)防其傳播的最有效方法［3］。美國GSK公司生產(chǎn)的TBE疫苗Ⅳ期臨床試驗結(jié)果表明，加強免疫TBE疫苗后，10年內(nèi)可維持較高的中和抗體水平［4］。1952年，我國科學工作者從TBE患者腦組織中分離出TBEV，命名為“森張”株，其為前蘇聯(lián)遠東型病毒，用于森林腦炎疫苗的研發(fā)［5］，2004年經(jīng)原國家食品藥品監(jiān)督管理局審批，2005年正式于國內(nèi)上市。目前，我國使用的森林腦炎滅活疫苗是以原代地鼠腎細胞為細胞基質(zhì)的純化疫苗（商品名：森泰保），該疫苗免疫后的陽轉(zhuǎn)率達86.8%，局部反應(yīng)發(fā)生率僅為0.13%，顯示了良好的安全性和免疫原性［6-5］；Ⅳ期臨床試驗的前期結(jié)果顯示，加強免疫該疫苗可為受試者提供3年以上的保護［7-8］。

我國對森林腦炎滅活疫苗規(guī)定的質(zhì)量標準收錄在《中國藥典》三部（2015版）中［9］，且采用批簽發(fā)形式，以確保上市疫苗的安全性及有效性。為提高森林腦炎滅活疫苗的質(zhì)量監(jiān)管力度，及時有效地進行監(jiān)測，確保其質(zhì)量可控，本研究對自完成2013年場地變更后，2015—2019年申報批簽發(fā)的47批，共計116.5萬人份森林腦炎疫苗的安全性及有效性指標進行趨勢分析，并將中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）與企業(yè)自檢結(jié)果進行比較，以期為該疫苗后續(xù)批次的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 疫苗2015—2019年申報批簽發(fā)的47批，共計116.5萬人份森林腦炎滅活疫苗均由長春生物制品研究所有限責任公司生產(chǎn)。

1.2 病毒“森張”株TBEV由長春生物制品研究所有限責任公司提供。

1.3 主要試劑 乙二胺四乙酸二鈉滴定液及鋅滴定液購自中國食品藥品檢定研究院；二甲酚橙、鹽酸羥胺及雙硫腙購自國藥集團化學試劑有限公司；汞單元素溶液標準物質(zhì)購自中國計量研究院。

1.4 實驗動物SPF級昆明小鼠，30只，雌性，18～21日齡，體質(zhì)量10～12 g，由長春生物制品研究所有限責任公司提供，動物合格證號為：201600014430。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進行。

1.5 檢測方法

企業(yè)按照《中國藥典》三部（2015版）［9］中規(guī)定的方法，對47批森林腦炎滅活疫苗的效價、氫氧化鋁含量及硫柳汞含量進行測定；中檢院抽取16批疫苗進行效價測定，6批疫苗進行氫氧化鋁含量測定，6批疫苗進行硫柳汞含量測定。

1.5.1 效價測定 將待檢樣品經(jīng)腹腔免疫30只小鼠，0.3 mL／只，共免疫2次，間隔7 d；同時設(shè)空白對照組，30只，不進行處理。初次免疫后14 d，試驗組及空白對照組分別以10-2～10-6稀釋度和10-6～10-10稀釋度的“森張”株TBEV懸液進行腹腔攻擊，每個病毒稀釋度攻擊6只小鼠，均0.3 mL／只。攻擊后3 d內(nèi)死亡者不計（動物死亡數(shù)量應(yīng)不得超過試驗動物總數(shù)的20%），連續(xù)21 d觀察小鼠存活情況［9］。

1.5.2 氫氧化鋁含量測定 精密量取待檢樣品5 mL，置250 mL錐形瓶中，加入磷酸溶液1.5 mL，完全溶解。精密加入乙二胺四乙酸二鈉滴定液（0.05 mol／L）及醋酸-醋酸銨緩沖液（pH 4.5）各10 mL，沸水浴加熱10 min；冷卻至室溫，加入二甲酚橙指示液1 mL，用鋅滴定液（0.025 mol／L）進行滴定，當溶液由亮黃色變?yōu)槌壬?，即為終點［9］。

1.5.3 硫柳汞含量測定 精密量取待檢樣品1 mL，置3 cm×24 cm試管中，加蓋，于85～90℃水浴加熱1 h；冷卻后加入去離子水至40 mL，再加入20%鹽酸羥胺溶液5 mL。用40 mL的去離子水將上述溶液分3次沖洗至125 mL分液漏斗中，再用雙硫腙滴定液進行滴定，每次加入滴定液后，振搖10 s，靜置分層，棄四氯化碳層，繼續(xù)滴定，直至雙硫腙溶液的綠色保持不變，即為終點［9］。

1.6 數(shù)據(jù)分析 收集企業(yè)47批森林腦炎滅活疫苗的檢測結(jié)果，當平均值和標準差（SD）趨于穩(wěn)定時，暫時固定平均值和SD，即在連續(xù)趨勢分析中不再隨著新增的檢驗結(jié)果重新計算平均值和SD，避免因引入新的檢測數(shù)據(jù)而掩蓋檢測結(jié)果發(fā)生偏移的情況。中檢院檢測結(jié)果數(shù)少于40個，數(shù)據(jù)監(jiān)測需隨著數(shù)據(jù)積累添加每個新的檢測結(jié)果，并重新計算平均值和SD。均以平均值±2SD為警戒限，平均值±3SD為行動限，作為數(shù)據(jù)糾偏依據(jù)；數(shù)據(jù)較少時，不設(shè)警戒限和行動限［10］。

1.7 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，中檢院和企業(yè)測定的效價、氫氧化鋁含量及硫柳汞含量結(jié)果的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 森林腦炎滅活疫苗關(guān)鍵質(zhì)量控制項目數(shù)據(jù)的比較中檢院僅對6批森林腦炎疫苗中氫氧化鋁和硫柳汞含量進行了測定，獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)較少，因此未確定警戒限和行動限。中檢院和企業(yè)測定的森林腦炎滅活疫苗效價平均值分別為8.1和8.0 lgLD50／0.3 mL，兩者差異無統(tǒng)計學意義（t=0.547，P＞0.05）；氫氧化鋁含量平均值分別為0.56和0.43 mg／mL，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=3.653，P＞0.05）；硫柳汞含量平均值分別為53和54μg／mL，兩者差異無統(tǒng)計學意義（t=1.464，P＞0.05）。見表1。表明中檢院和企業(yè)測定的氫氧化鋁含量結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義；兩個實驗室對效價和硫柳汞含量測定結(jié)果的一致性在可接受的范圍內(nèi)。

2.2 森林腦炎滅活疫苗關(guān)鍵質(zhì)量控制項目結(jié)果的趨勢分析

2.2.1 效價 企業(yè)的效價測定結(jié)果中有2個不連續(xù)批次超出行動下限，但均在質(zhì)量標準范圍內(nèi)，這2批疫苗是生產(chǎn)場地變更后起始階段生產(chǎn)的，尚在趨勢分析數(shù)據(jù)收集階段，其他數(shù)據(jù)無過高或過低的情況，也未見連續(xù)3批超出警戒限的批次。中檢院效價測定結(jié)果的數(shù)據(jù)監(jiān)測顯示，在生產(chǎn)場地變更后起始階段生產(chǎn)的1批疫苗超出警戒下限，未見超出行動限和連續(xù)3批超出警戒限的批次。見圖1?？傮w上，企業(yè)的趨勢分析結(jié)果與中檢院數(shù)據(jù)監(jiān)測結(jié)果較為穩(wěn)定，一致性良好。

2.2.2 氫氧化鋁含量 企業(yè)測定氫氧化鋁含量的結(jié)果均未超出警戒限，均在其質(zhì)量標準的范圍內(nèi)，且趨勢未見嚴重漂移，批間一致性良好，企業(yè)針對該項目的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定，見圖2。中檢院的測定結(jié)果均符合其質(zhì)量標準，結(jié)果未超過6個數(shù)據(jù)，無法顯示趨勢。

圖1 森林腦炎滅活疫苗效價測定結(jié)果趨勢分析Fig.1 Trend analysis of titer determination results of inactivated TBE vaccine

圖2 森林腦炎滅活疫苗氫氧化鋁含量測定結(jié)果的趨勢分析Fig.2 Trend analysis of determination results of aluminium hydroxide content of inactivated TBE vaccine

表1 森林腦炎滅活疫苗關(guān)鍵質(zhì)量控制項目的檢測結(jié)果Tab.1 Test results of critical quality control indicators of inactivated TBE vaccine

2.2.3 硫柳汞含量 企業(yè)測定的柳硫汞含量結(jié)果均未超出警戒限，均在其質(zhì)量標準的范圍內(nèi)，在初始數(shù)據(jù)收集階段，存在一定的數(shù)據(jù)漂移現(xiàn)象，待生產(chǎn)工藝穩(wěn)定后，后期批次的測定結(jié)果趨于一致，見圖3。中檢院的測定結(jié)果均符合其質(zhì)量標準，結(jié)果未超過6個數(shù)據(jù)，無法顯示趨勢。

圖3 森林腦炎滅活疫苗硫柳汞含量測定結(jié)果的趨勢分析Fig.3 Trend analysis of determination results of thiomersalate content of inactivated TBE vaccine

3 討論

隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展和新版疫苗批簽發(fā)指導原則的實施，對疫苗關(guān)鍵指標的質(zhì)量控制更加完善。其中趨勢分析作為批簽發(fā)的組成部分，對監(jiān)測疫苗生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性、不同批次的批間一致性起到重要的作用。本研究就森林腦炎滅活疫苗安全性、有效性評價中的效價、氫氧化鋁含量和硫柳汞含量測定項目，對2015—2019年間的47批疫苗進行了數(shù)據(jù)監(jiān)測和趨勢分析。由于森林腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)批次較少，且批簽發(fā)實行動態(tài)抽檢方式，因此中檢院的試驗結(jié)果僅進行數(shù)據(jù)監(jiān)測。

疫苗有效性是衡量抗原誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)達到預(yù)期保護效果的重要指標，效價測定是評價疫苗有效性、監(jiān)測批間一致性的關(guān)鍵手段之一［11］。本研究結(jié)果顯示，從效價測定結(jié)果的趨勢分析來看，除生產(chǎn)場地變更起始階段有個別數(shù)據(jù)波動外，未發(fā)現(xiàn)有嚴重偏移現(xiàn)象，結(jié)果均符合質(zhì)量標準，疫苗有效性和批間一致性較好，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

鋁佐劑是目前應(yīng)用最為廣泛的疫苗佐劑，已有的研究結(jié)果認為鋁佐劑具有抗原儲存、提高機體固有免疫應(yīng)答、增強抗原遞呈、增強Th2細胞介導的適應(yīng)性免疫應(yīng)答、激活B細胞誘導抗體產(chǎn)生、激活補體等作用［12］，但作用機理尚未明確?？紤]到抗原應(yīng)答和疫苗長期免疫效應(yīng)的關(guān)系，國家藥品監(jiān)督管理局建議結(jié)合鋁佐劑和疫苗質(zhì)量趨勢分析對鋁佐劑質(zhì)量穩(wěn)定性進行定期分析［13］。本研究對森林腦炎滅活疫苗的氫氧化鋁含量測定結(jié)果的趨勢分析中，未發(fā)現(xiàn)超出警戒限的數(shù)據(jù)，整體趨勢良好；統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，中檢院與企業(yè)的氫氧化鋁含量測定結(jié)果存在差異（P＜0.05），可能與樣本量較少有關(guān)，還需進一步積累數(shù)據(jù)進行分析。

WHO自2002年起對有關(guān)使用硫柳汞作為疫苗防腐劑和滅活劑的相關(guān)科學證據(jù)進行了多年的密切監(jiān)測，特別是全球疫苗安全咨詢委員會，對硫柳汞與自閉癥等42項神經(jīng)發(fā)育疾病的相關(guān)性進行了評估，該委員會認為，目前無證據(jù)表明疫苗中的硫柳汞會對健康構(gòu)成風險［14］。但作為預(yù)防措施，WHO等機構(gòu)已啟動了減少和／或消除硫柳汞使用的措施［15］，硫柳汞已從大多數(shù)發(fā)達國家兒童計劃免疫的疫苗中去除［16］。本研究對森林腦炎滅活疫苗中硫柳汞含量的趨勢分析表明，在生產(chǎn)場地變更后早期生產(chǎn)的疫苗，出現(xiàn)了一定的數(shù)據(jù)漂移現(xiàn)象，隨著生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定，總體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，所有測定結(jié)果均符合質(zhì)量標準。為響應(yīng)WHO的建議，進一步提高疫苗質(zhì)量，企業(yè)開展了硫柳汞去除工藝的研究，在減少添加劑使用、保障安全性方面，進行了疫苗生產(chǎn)工藝的改進，去除硫柳汞等工藝變更后的疫苗現(xiàn)已正式上市。

從疫苗整體的趨勢分析上看，森林腦炎滅活疫苗的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，隨后的質(zhì)量控制過程中，仍需進行關(guān)鍵指標的動態(tài)監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)可能的異常數(shù)據(jù)，溯源生產(chǎn)和質(zhì)控系統(tǒng)。對工藝變更后的疫苗，做好數(shù)據(jù)積累和比對工作。