關(guān)文竹，火文，李雄雄，王云瑾，王曉，程亞慧，寇桂英，包紅，白慕群

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730046

人3型副流感病毒（human parainfluenza virus type-3，HPIV-3）是僅次于呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）引起5歲以下嬰幼兒急性下呼吸道嚴(yán)重疾病的病原體，主要引起嬰幼兒肺炎、支氣管炎和中耳炎［1］，且與幼兒呼吸暫停有關(guān)［2］。流行病學(xué)研究顯示，5歲以下嬰幼兒80%感染過(guò)HPIV-3，造成了很大的疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另外，HPIV-3感染還是導(dǎo)致老年慢性病患者和免疫力低下成年人下呼吸道疾病及死亡的重要原因［3-6］；在器官移植和免疫抑制患者中，HPIV-3感染導(dǎo)致的死亡率為3%～47%［7-8］。

目前尚無(wú)治療HPIV-3感染的特效藥物和預(yù)防性疫苗上市［9-10］。HPIV-3疫苗研發(fā)中，滅活疫苗由于其接種后的疾病增強(qiáng)作用而被放棄［11］，減毒活疫苗和亞單位疫苗是目前疫苗研發(fā)的主要目標(biāo)。本研究旨在篩選具有冷適應(yīng)（cold-adaptation，Ca）及溫度敏感（temperature sensitivity，Ts）特性的HPIV-3毒株，并在小鼠動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)其安全性、免疫原性和保護(hù)效力，以期為HPIV-3減毒活疫苗的研發(fā)提供候選毒株。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 為甘肅省婦幼保健醫(yī)院下呼吸道感染住院患兒下呼吸道分泌物標(biāo)本。

1.2 細(xì)胞及病毒 人胚肺成纖維細(xì)胞（WI-38）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第二研究室傳代并保存；HPIV-3LZ1728C19（HPIV-3野毒株，滴度為8.5×108拷貝／mL，用于攻毒試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞刺激抗原的制備）、HPIV-3LZ150-1W3（HPIV-3野毒株，從HPIV-3陽(yáng)性臨床標(biāo)本克隆純化并去除了包括支原體在內(nèi)的7種外源因子，為CPW3的親本野毒株，滴度為8.9×107拷貝／mL）和CPW3毒株（HPIV-3冷適應(yīng)溫度敏感株，由HPIV-3LZ1501W3高滴度克隆純化毒株按1∶100稀釋度接種于T25 Vero細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并加入5-氟尿嘧啶，終濃度為10μg／mL。培養(yǎng)溫度從35℃開(kāi)始連續(xù)低溫傳代，降溫幅度2℃，即35、33、31、29、27、25℃，每個(gè)溫度培養(yǎng)10代。25℃時(shí)經(jīng)55次傳代，最終獲得具有Ca和Ts特性的HPIV-3毒株CPW3，25℃時(shí)滴度為2.1×106拷貝／mL）均由該研究室分離篩選并保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性BALB／c小鼠，2周齡，體質(zhì)量13.5～14.5 g，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物室提供并飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2017-0001。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.4 主要試劑及儀器Anti-Mouse IgA antibody-HRP conjugate、Anti-Mouse IgG（H+L）antibody-HRP conjugate和去支原體抗生素Plasmocin均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）+離子霉素（ionomycin）、Fc block（Rat Anti-Mouse CD16／CD32）、FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse CD8ɑ、APC Rat Anti-Mouse IFNγ、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD3、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse IL-4、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA（brefeldin A）、細(xì)胞固定／細(xì)胞破膜溶液試劑盒、Stain Buffer和AccuriTMC6流式細(xì)胞分析儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司；TrueBlueTMPeroxidase Substrate顯色劑購(gòu)自美國(guó)KPL公司；RNeasy mini kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；One-Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）購(gòu)自日本TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、MEM、RPMI1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；新生小牛血清購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；HEPES緩沖液、中性紅、5-氟尿嘧啶、細(xì)胞消化用胰酶和噬斑用低熔點(diǎn)瓊脂糖均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗重組HPIV-3 HN和F蛋白多克隆抗體為蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第二研究室制備；鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；7500 Real Time PCR System購(gòu)自美國(guó)AB公司；Elispot／FluoroSpot Reader System購(gòu)自德國(guó)AID公司。

1.5 HPIV-3 Ca和Ts毒株的篩選

1.5.1 HPIV-3陽(yáng)性臨床標(biāo)本的篩選 取甘肅省婦幼保健醫(yī)院下呼吸道感染住院患兒下呼吸道分泌物標(biāo)本，渦旋振蕩后，12 000×g離心20 min，上清液用0.22μm針式濾器除菌過(guò)濾后，接種至鋪滿(mǎn)WI-38細(xì)胞的6孔板中，37℃孵育2 h；棄上清，加入3 mL含10μg／mL支原體去除劑Plasmocin的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，孔對(duì)孔連續(xù)傳代10次后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，挑取HPIV-3陽(yáng)性孔。

1.5.2 HPIV-3陽(yáng)性培養(yǎng)物的噬斑克隆純化 將10次連續(xù)傳代培養(yǎng)的HPIV-3陽(yáng)性培養(yǎng)上清液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-1～10-8），各稀釋度病毒分別接種至鋪滿(mǎn)WI-38細(xì)胞的6孔板中，1 mL／孔，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；棄上清液，加入DMEM配制的0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖，3 mL／孔，室溫凝固后，倒置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d；加入DMEM配制的含0.015%中性紅的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖，1 mL／孔，室溫凝固后，倒置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；在病毒高稀釋度孔中挑取噬斑，接種于鋪滿(mǎn)WI-38細(xì)胞的24孔板中，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d；qRT-PCR檢測(cè)HPIV-3陽(yáng)性克隆培養(yǎng)物，挑取12個(gè)HPIV-3陽(yáng)性初始克隆，每個(gè)連續(xù)克隆5次，克隆所用液體中均加入10μg／mL支原體去除劑Plasmocin；最后挑選12個(gè)來(lái)源于不同HPIV-3陽(yáng)性初始克隆的高滴度HPIV-3克隆毒株進(jìn)行外源因子檢測(cè)，12個(gè)克隆毒株分別命名為L(zhǎng)Z1501W1～LZ1501W12。

1.5.3 HPIV-3 Ca和Ts株的篩選 采用誘變劑加逐步降溫法篩選。將上述克隆純化去除外源因子的12個(gè)LZ1501高滴度克隆純化毒株按照1∶100分別接種至鋪滿(mǎn)WI-38細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5-氟尿嘧啶（終濃度10μg／mL），進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度從35℃開(kāi)始，降溫幅度2℃，即35、33、31、29、27、25℃，每個(gè)溫度傳代培養(yǎng)10代，直至出現(xiàn)具有Ts特性的毒株。

1.6 Ca和Ts特性鑒定

1.6.1 CPW3病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的Ca和Ts特性鑒定 將CPW3及其親本野毒株LZ1501W3分別接種于鋪滿(mǎn)WI-38細(xì)胞的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，兩毒株各接種3瓶，分別置25、37和40℃培養(yǎng)7 d，qRT-PCR測(cè)定每瓶病毒培養(yǎng)液的滴度，并觀(guān)察細(xì)胞病變。

1.6.2 CPW3在小鼠模型上的Ts特性鑒定 將BALB／c小鼠隨機(jī)分為2組，每組21只。所有小鼠均經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛麻醉，100μL／只，待小鼠失去行動(dòng)力后，一組經(jīng)鼻腔接種CPW3病毒培養(yǎng)液2.1×106拷貝／mL，20μL／只；另一組經(jīng)鼻腔接種CPW3毒株的野生親本毒株LZ1501W3病毒培養(yǎng)液8.9×107拷貝／mL，20μL／只。接種后第3天，qRT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織和鼻洗液中HPIV-3滴度。

1.7 CPW3病毒Ca和Ts株的純化及電鏡觀(guān)察 將CPW3病毒株以0.01 MOI接種于WI-38細(xì)胞，置于25℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，收集培養(yǎng)上清液，qRT-PCR檢測(cè)病毒滴度，4℃保存。取病毒培養(yǎng)液，4℃，8 000×g離心30 min，沉淀細(xì)胞碎片，收集上清液；取50 mL上清加入70 mL專(zhuān)用離心管中，用8 cm長(zhǎng)針頭從底部輕輕推入20 mL 50%蔗糖（操作中注意保持界面清晰），4℃，35 000×g超速離心4 h；棄上清液，用無(wú)菌三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（TNE Buffer）重懸沉淀，測(cè)定病毒蛋白濃度，電鏡觀(guān)察病毒形態(tài)（由蘭州大學(xué)電鏡中心完成）。

1.8 CPW3病毒外殼HN和F蛋白的Western blot鑒定 將超速離心純化的CPW3病毒蛋白經(jīng)12%SDSPAGE分離后，進(jìn)行Western blot分析，以兔抗重組HPIV-3 HN和F蛋白抗體為一抗。

1.9 Ca和Ts株的遺傳特征分析 采用二代基因測(cè)序法對(duì)CPW3毒株全基因序列進(jìn)行測(cè)定，由上海伯杰醫(yī)療科技有限公司完成。

1.10 HPIV-3減毒活疫苗候選株的制備 將CPW3病毒培養(yǎng)液按0.01 MOI接種WI-38細(xì)胞，置于25℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，qRT-PCR測(cè)定病毒滴度為2.1×106拷貝／mL，8 000×g離心40 min，收集上清，作為疫苗備用。

1.11 動(dòng)物分組及免疫 將BALB／c小鼠隨機(jī)分為11組：試驗(yàn)組（CPW3組）9組、陽(yáng)性對(duì)照組（LZ1501W 3組）1組、陰性對(duì)照組1組，每組21只，所有小鼠均經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛麻醉，100μL／只，待小鼠失去行動(dòng)力。試驗(yàn)組均經(jīng)鼻腔接種CPW3病毒培養(yǎng)液，20μL／只，其中1～3組接種1劑，4～6組接種2劑，7～9組接種3劑，間隔28 d；陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)鼻腔接種LZ1501W3病毒培養(yǎng)液（滴度8.9×107拷貝／mL），與試驗(yàn)組分開(kāi)飼養(yǎng)，只接種1劑；陰性對(duì)照組經(jīng)鼻腔接種20μL DMEM液體培養(yǎng)基，與試驗(yàn)組分開(kāi)飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.12 免疫小鼠體溫及體質(zhì)量檢測(cè) 每天監(jiān)測(cè)各組小鼠體溫及體質(zhì)量。

1.13 免疫小鼠對(duì)HPIV-3感染的保護(hù)效力檢測(cè) 分別在2劑和3劑CPW3接種后第40天用HPIV-3野毒株HPIV-3LZ1728C19經(jīng)鼻腔進(jìn)行攻毒，攻毒后第3天，采用qRT-PCR法檢測(cè)小鼠肺中病毒載量。分別選取CPW3 3劑免疫后3 d及攻毒后3 d，親本株LZ1-501W3及野毒株HPIV-3LZ1728C19感染后3 d的小鼠肺，做病理切片。

1.14 HPIV-3減毒活疫苗候選株免疫原性檢測(cè)

1.14.1 小鼠上、下呼吸道CPW3病毒載量的檢測(cè) 每劑接種后第3天，取小鼠鼻腔灌洗液和肺組織，采用qRT-PCR方法檢測(cè)CPW3病毒載量。用RNeasy mini kit試劑盒提取小鼠鼻腔灌洗液和肺組織RNA，將純化的病毒RNA置0℃冰浴備用。用One-Step Prime-ScriptTMRT-PCR Kit完成qRT-PCR，引物（realHNS／realHNA）和探針HNprobe序列均位于HPIV-3的HN基因上，序列未公布。用4.7～4.7×107拷貝／mL體外轉(zhuǎn)錄HNRNA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。反應(yīng)體系：2×one step RTPCR bufferⅢ10μL，TaKaRa Ex TaqHS 0.4μL，Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL，realHNS（10 pmol／μL）0.6μL，realHNA（10 pmol／μL）0.6μL，HNProbe（10 pmol／μL）0.2μL，50×ROX參比染料0.4μL，RNA模板2μL，RNase free H2O 5.4μL。擴(kuò)增程序：42℃5 min，95℃10 s；95℃5 s，57℃34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.14.2 體液免疫應(yīng)答檢測(cè)

1.14.2.1 小鼠血清HPIV-3特異性中和抗體檢測(cè) 采用噬斑減少試驗(yàn)檢測(cè)CPW3 2劑和3劑免疫小鼠后第40天，小鼠血清HPIV-3特異性中和抗體滴度。

HPIV-3 LZ1728C19病毒工作稀釋度確定：病毒5倍系列稀釋后，接種于鋪滿(mǎn)Vero細(xì)胞的24孔板，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)2 h；棄上清液，加入MEM配置的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖1 mL，室溫凝固后，倒置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d；加入MEM配置的含0.015%中性紅的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖1 mL，室溫凝固后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，次日觀(guān)察出斑，以80%細(xì)胞出現(xiàn)噬斑的病毒稀釋度作為病毒的工作稀釋度。

血清特異性中和抗體測(cè)定：CPW3陽(yáng)性血清2倍系列稀釋后，與等體積工作稀釋度的HPIV-3 LZ1728-C19病毒混合，37℃下結(jié)合2 h；將結(jié)合的血清-病毒液分別接種于鋪滿(mǎn)Vero細(xì)胞的24孔板，后續(xù)方法與上述相同?？瞻讓?duì)照血清稀釋液與等體積工作稀釋度的HPIV-3 LZ1728C19病毒混合，37℃下結(jié)合2 h后，接種于Vero細(xì)胞作為mock對(duì)照。與mock對(duì)照的噬斑數(shù)相比，能使噬斑數(shù)降低50%的血清稀釋度為血清中和抗體滴度。

1.14.2.2 小鼠HPIV-3特異性IgA、IgG抗體分泌淋巴細(xì)胞（antibody secreting cells，ASC）的免疫應(yīng)答檢測(cè) 為了研究CPW3免疫后小鼠組織定植ASC的免疫應(yīng)答，分別于不同劑次免疫后第3天（post innoculation day 3，PID3）、免疫后第40天（post inoculation day 40，PID40）攻毒前及免疫后第43天（post inoculation day 43，PID43）／攻毒后第3天（post challenge day 3，PCD3），提取小鼠肺、脾和外周血淋巴細(xì)胞，檢測(cè)HPIV-3特異性ASC應(yīng)答。

1.14.2.2.1 淋巴細(xì)胞分離 外周血：每7只小鼠眼球采血3.5 mL左右，滴入10 mL 37℃預(yù)熱枸櫞酸抗凝劑中，混勻后加入13.5 mL 37℃預(yù)熱的RPMI1640培養(yǎng)基并混勻，采用反推法緩慢在底部推入13.5 mL淋巴細(xì)胞分離液；脾、肺：無(wú)菌取小鼠脾和肺，在200目研磨網(wǎng)上用小鼠淋巴細(xì)胞分離液研磨，每7只小鼠的肺或脾臟研磨液分別放入15 mL離心管，用淋巴細(xì)胞分離液定容至10 mL，在離心管上端覆蓋1.5 mL RPMI1640培養(yǎng)液。上述溶液4℃，800×g離心20 min后吸出淋巴細(xì)胞層，加入10 mL RPMI1640培養(yǎng)基洗滌、離心，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，37℃保溫備用。

1.14.2.2.2 HPIV-3特異性ASC應(yīng)答檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme linked immunospot assay，ELIspot）。將濃度為5×105個(gè)／mL的MA104細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200μL／孔，37℃培養(yǎng)72 h；用1∶2 000稀釋的HPIV-3LZ1728C19病毒培養(yǎng)液感染細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72 h后用80%丙酮固定，-20℃保存?zhèn)溆?。將脾、肺、外周血中提取的淋巴?xì)胞分別稀釋為5×106、5×105、5×104個(gè)／mL，加入制備的96孔板中，每個(gè)濃度均設(shè)復(fù)孔，500×g離心5 min，37℃，5%CO2條件下孵育12 h；用PBST（PBS-tween 20）緩沖液洗板6次，分別加入抗鼠IgA和IgG抗體，50μL／孔，37℃，5% CO2條件下孵育2 h；用PBST緩沖液洗板6次，加入TrueBlueTMPeroxidase Substrate顯色劑，50μL／孔，37℃，5%CO2條件下孵育2 h；ELIspot／FluoroSpot Reader System讀取每孔藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)。

1.14.3 細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定在PID3、PID40以及PCD3，小鼠肺、脾和外周血淋巴細(xì)胞中HPIV-3特異性IFNγ-CD4+T、IFNγ-CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。使用野毒株HPIV-3LZ1728C19制備刺激抗原，抗原的制備和純化方法同1.7項(xiàng)。淋巴細(xì)胞刺激及染色：將1.14.2.2.1項(xiàng)分離的淋巴細(xì)胞稀釋至1×107個(gè)／mL，加入V底96孔板中，100μL／孔，試驗(yàn)組每孔加入12μg淋巴細(xì)胞刺激用抗原，37℃，5%CO2條件下孵育14 h；每孔加入1μL BFA，繼續(xù)孵育至17 h，離心收集細(xì)胞。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（不使用抗原刺激）和陽(yáng)性對(duì)照（加入PMA+離子霉素以及BFA），37℃，5%CO2條件下孵育6 h，離心收集細(xì)胞。用抗小鼠CD4、CD8ɑ、CD3、IFNγ、IL-4抗體分別染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。分別設(shè)置CD3、CD8、CD4、IFNγ、IL-4單染色對(duì)照管，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。

另采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)攻毒后小鼠外周血中IFNγ-CD4+T和IL-4-CD4+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，分析CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠Th細(xì)胞應(yīng)答類(lèi)型。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad prism 7.0軟件，采用Unpaired t test with Welch's correction方法進(jìn)行差異分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPIV-3 Ca和Ts株的篩選 在35～27℃的50代Ca傳代培養(yǎng)過(guò)程中，病毒的平均滴度下降了1 lg；繼續(xù)在25℃?zhèn)?5代，所有克隆培養(yǎng)孔病毒滴度均下降，最高下降4 lg；繼續(xù)傳代，隨著25℃?zhèn)鞔螖?shù)的增加，有2個(gè)克隆株的滴度經(jīng)過(guò)降低之后緩慢升高，最終在25℃?zhèn)?0代后，病毒滴度達(dá)106拷貝／mL，將其中1個(gè)毒株命名為CPW3，將CPW3的親本野毒株命名為L(zhǎng)Z1501W3。見(jiàn)圖1。

圖1 HPIV-3 Ca和Ts株的篩選Fig.1 Screening of HPIV-3 strain with Ca and Ts

2.2 Ca和Ts特性鑒定

2.2.1 CPW3在細(xì)胞培養(yǎng)中的Ca和Ts特性 顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)，CPW3在25℃培養(yǎng)至第7天，WI-38細(xì)胞出現(xiàn)攣縮、變短變圓，大量死亡脫落并懸浮在病毒培養(yǎng)液中，該細(xì)胞病變明顯強(qiáng)于CPW3在37和40℃培養(yǎng)條件下的細(xì)胞病變，而LZ1501W3在37℃培養(yǎng)條件下所致WI-38細(xì)胞病變最為顯著，見(jiàn)圖2。

與LZ1501W3相比，CPW3在25℃培養(yǎng)的病毒滴度提高了3.59 lg（t=28.38，P＜0.000 1），表明CPW3具有了Ca的特點(diǎn)；在40℃培養(yǎng)的病毒滴度降低了4.86 lg（t=59.62，P＜0.000 1），在37℃培養(yǎng)的病毒滴度下降了2.55 lg（t=32.49，P＜0.000 1），表明CPW3在細(xì)胞培養(yǎng)中具有了Ts的特性。見(jiàn)圖3。

2.2.2 CPW3在小鼠模型上的Ts特性CPW3和LZ-1501W3在小鼠肺組織的病毒載量分別為5.58和7.67 lg，在小鼠鼻腔洗液中的病毒載量分別為4.78和4.27 lg。與LZ1501W3相比，CPW3在小鼠肺組織的病毒載量顯著下降了2.09 lg（t=7.346，P＜0.000 1），在小鼠鼻腔洗液中的病毒載量顯著增加了0.51 lg（t=2.62，P＜0.01）。見(jiàn)圖4。表明CPW3在小鼠的上下呼吸道也具有Ts特性。

圖2 CPW3及其親本野毒株LZ1501W3在不同培養(yǎng)溫度下的致細(xì)胞病變觀(guān)察（×100）Fig.2 Microscopy of CPE caused by CPW3 and its parent wild strain LZ1501W3 cultured at various temperatures（×100）

圖3 CPW3及其親本野毒株LZ1501W3在不同培養(yǎng)溫度下的滴度Fig.3 Titers of CPW3 and its parent wild strain LZ1501W3 cultured at various temperatures

圖4 CPW3及其親本野毒株LZ1501W3在小鼠鼻腔洗液（A）和肺組織（B）的病毒載量Fig.4 Virus loads of CPW3 and its parent wild strain LZ15-01W3 in nasal washes（A）and lung tissues（B）of mice

2.3 CPW3病毒Ca和Ts株的電鏡觀(guān)察 純化的CPW3病毒在電鏡下可觀(guān)察到150 nm左右的病毒顆粒，且在病毒外周可見(jiàn)清晰的脂質(zhì)外膜，見(jiàn)圖5。

2.4 CPW3病毒外殼HN和F蛋白的Western blot鑒定 超速離心純化的CPW3病毒與兔抗重組HPIV-3 HN蛋白抗體在預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量約64 000處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，與兔抗重組F蛋白抗體在預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量約60 000處出現(xiàn)較弱的F0條帶，同時(shí)在相對(duì)分子質(zhì)量約50 000處也出現(xiàn)更強(qiáng)的反應(yīng)條帶，與F0蛋白的Furin酶切產(chǎn)物F1的大小一致，見(jiàn)圖6。表明CPW3毒株具有HPIV-3的HN和F蛋白。

圖5 純化CPW3病毒的電鏡觀(guān)察Fig.5 Electron microscopy of purified CPW3 virus

圖6 純化CPW3病毒的Western blot鑒定Fig.6 Western blotting of purified CPW3 virus

2.5 Ca和Ts株的遺傳特征分析 測(cè)序結(jié)果表明，CPW3毒株的全基因序列含15 404個(gè)核苷酸，通過(guò)核苷酸序列分析可知，CPW3與GenBank上HPIV-3分離株HPIV3／UK／ref／MK9（登錄號(hào)：MH678682.1）的同源性為99.84%。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，CPW3處于單獨(dú)的進(jìn)化分支，且位于進(jìn)化分支的上游，見(jiàn)圖7。核苷酸序列分析可知，CPW3株基因核苷酸序列符合副黏病毒科基因組“6堿基原則”，按照5'-NP（111-1 658）-PP／C（1 784-3 592）-M（3 753-4 814）-F（5 072-6 691）-HN（6 806-8 524）-L（8 571-15 347）-3'的順序編碼6種蛋白，基因結(jié)構(gòu)與已知序列HPIV-3分離株相同。表明CPW3毒株是PIV-3。與親本野毒株LZ501W3比較發(fā)現(xiàn)，CPW3共存在17個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，見(jiàn)表1。其中NP基因上有2個(gè)，PP基因上有1個(gè)，M基因上有2個(gè)，F(xiàn)基因上有4個(gè)，HN基因上有2個(gè)，L基因上有6個(gè)。其中12個(gè)位于NP、PP、M、F、L基因中的核苷酸突變導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生替換，見(jiàn)表2。

圖7 CPW3全基因組遺傳進(jìn)化分析Fig.7 Genetic evolution analysis of whole genome of CPW3

表1 CPW3基因突變位點(diǎn)Tab.1 Gene mutation sites in CPW3

表2 CPW3氨基酸變化Tab.2 Amino acid changes of CPW3

2.6 CPW3對(duì)小鼠體溫及體質(zhì)量的影響 感染后30 d內(nèi)，小鼠體溫均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，第9組試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分 別為1.022和1.786，P分 別 為0.315 6和0.085 3）。感染后30 d內(nèi)，試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量的增加與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.909，P＞0.05）；而陽(yáng)性對(duì)照組體重增加從感染后第3天開(kāi)始顯著滯后于陰性對(duì)照組（t=8.558，P＜0.000 1），隨后體重差異逐漸縮小，直至感染后24 d達(dá)到一致，該現(xiàn)象與HPIV-3野毒株在小鼠肺內(nèi)病毒清除相關(guān)。見(jiàn)圖8。而且CPW3免疫后，所有小鼠均未出現(xiàn)腹瀉、體態(tài)和精神異常以及死亡的情況。

圖8 CPW3免疫后小鼠的體溫（A）和體質(zhì)量（B）Fig.8 Body temperature（A）and body mass（B）of mice immunized with CPW3

2.7 CPW3免疫小鼠對(duì)HPIV-3感染的保護(hù)效力qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CPW3免疫對(duì)小鼠肺部HPIV-3感染具有顯著性保護(hù)效力，與對(duì)照組相比，2劑接種后，小鼠肺部病毒載量降低了0.81 lg（t=2.653，P=0.011 4）；3劑免疫后，小鼠肺部病毒載量降低了1.85 lg（t=2.836，P=0.007 1）。見(jiàn)圖9。

病理切片觀(guān)察顯示，與正常小鼠相比，CPW3親本株LZ1501W3感染小鼠肺部炎癥病變較為明顯，包括肺組織血管擴(kuò)張充血，肺泡壁增寬，支氣管黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，肺泡腔及支氣管內(nèi)出現(xiàn)以紅細(xì)胞、少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維素滲出為主的慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理反應(yīng)；而CPW3免疫小鼠其肺泡間隔清晰，肺泡腔可見(jiàn)少量漿液和纖維素滲出，且攻毒后，小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)相關(guān)嚴(yán)重的病理反應(yīng)。見(jiàn)圖10。

圖9 CPW3免疫對(duì)小鼠下呼吸道HPIV-3感染的保護(hù)效力Fig.9 Protective efficacy of CPW3 immunization against HPIV-3 infection in lower respiratory tract of mice

圖10 小鼠肺部病理變化（HE染色）Fig.10 Pathological changes in lung tissue of mice（HE staining）

2.8 HPIV-3減毒活疫苗候選株的免疫原性

2.8.1 CPW3在小鼠上、下呼吸道的增殖 每劑接種后，CPW3均可在小鼠上、下呼吸道顯著增殖，與陰性對(duì)照組相比，1劑免疫后第3天，CPW3在小鼠肺組織的病毒載量提高了2.7 lg（t=6.993，P＜0.000 1），在鼻腔的病毒載量提高了3.1 lg（t=6.132，P＜0.000 1）；與1劑免疫后第3天相比，第3劑免疫后第3天，CPW3在小鼠肺組織的病毒載量降低了0.5 lg（t=5.324，P＜0.000 1），而在鼻腔中，每劑接種均可導(dǎo)致病毒載量逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為5.502和5.624，P均＜0.000 1）。見(jiàn)圖11。

圖11 CPW3在小鼠鼻腔（A）和肺組織（B）的增殖Fig.11 Proliferation of CPW3 in nasal cavity（A）and lung tissue（B）of mice

2.8.2 體液免疫應(yīng)答

2.8.2.1 CPW3免疫小鼠血清HPIV-3特異性中和抗體應(yīng)答CPW3免疫可誘導(dǎo)小鼠顯著的血清HPIV-3特異性中和抗體應(yīng)答，且具有劑次效應(yīng)，與陰性對(duì)照組相比，2劑接種后小鼠中和抗體幾何平均滴度升高了120倍（t=9.784，P＜0.000 1），3劑免疫后則提高了1 387倍（t=7.296，P＜0.000 1）。見(jiàn)圖12。

2.8.2.2 CPW3免疫小鼠HPIV-3特異性IgA、IgG ASC的免疫應(yīng)答ELIspot法檢測(cè)結(jié)果表明，在肺部，CPW3免疫不僅能夠顯著誘導(dǎo)免疫后反應(yīng)性（PID3）IgA（t=3.296，P=0.007 6）和IgG（t=2.884，P=0.0215）ASC應(yīng)答，還可誘導(dǎo)顯著的攻毒后記憶性（PCD3）IgA（2劑攻毒：t=2.396，P=0.036；3劑攻毒：t=10.76，P＜0.000 1）和IgG（2劑攻毒：t=4.772，P=0.000 76；3劑攻毒：t=6.45，P＜0.000 1）ASC免疫應(yīng)答；在脾臟中，CPW3只誘導(dǎo)免疫后顯著反應(yīng)性（PID3）（t=6.311，P＜0.000 1）和攻毒后的記憶性（PCD3）IgG ASC免疫應(yīng)答（2劑攻毒：t=5.067，P＜0.001；3劑攻毒：t=2.733，P＜0.05）；在外周血中則均無(wú)顯著應(yīng)答。而且免疫后無(wú)論是反應(yīng)性還是記憶性免疫應(yīng)答，IgG ASC在脾臟中的應(yīng)答均高于肺臟。見(jiàn)圖13和圖14。

2.8.3 細(xì)胞免疫應(yīng)答 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在PID3，CPW3可顯著誘導(dǎo)小鼠肺（t=4.114，P=0.004 3）、脾（t=6.258，P=0.002 2）和外周血（t=2.241，P=0.044 7）中定植反應(yīng)性IFNγ-CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，且具有劑次效應(yīng)；而且，肺和脾中IFNγ-CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答高于外周血，而反應(yīng)性IFNγ-CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在3種組織中均無(wú)顯著增加。見(jiàn)圖15。攻毒試驗(yàn)顯示，在PCD3，CPW3免疫可顯著誘導(dǎo)小鼠肺（1劑攻毒：t=3.58，P=0.001 5；2劑攻毒：t=4.62，P=0.000 1；3劑攻毒：t=4.005，P=0.000 5）、脾（2劑攻毒：t=7.024，P=0.002 2；3劑攻毒：t=3.879，P=0.018）和外周血（2劑攻毒：t=3.75，P=0.02；3劑攻毒：t=8.309，P＜0.001）中記憶性IFNγ-CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，且具有劑次效應(yīng)；同時(shí)還可誘導(dǎo)肺（2劑攻毒：t=2.927，P=0.043；3劑攻毒：t=4.941，P=0.038）、脾（3劑攻毒：t=6.589，P=0.002 7）和外周血（2劑攻毒：t=3.618，P=0.02；3劑攻毒：t=4.594，P＜0.01）中記憶性IFNγ-CD4+T細(xì)胞顯著應(yīng)答，也具有劑次效應(yīng)。見(jiàn)圖16。

CPW3可誘導(dǎo)Th1／Th2混合型但稍偏向于Th1的免疫應(yīng)答，見(jiàn)圖17。

圖12 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠血清中和抗體應(yīng)答Fig.12 Serum neutralizing antibody response in mice immunized with CPW3

圖13 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠反應(yīng)性HPIV-3特異性IgA、IgG ASC免疫應(yīng)答Fig.13 HPIV-3 specific reactive IgA and IgG ASC responses in mice immunized with CPW3

圖14 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠記憶性HPIV-3特異性IgA、IgG ASC免疫應(yīng)答Fig.14 HPIV-3 specific memory IgG and IgA ASC responses in mice immunized with CPW3

圖15 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠反應(yīng)性HPIV-3特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.15 HPIV-3 specific reactive T cell response in mice immunized with CPW3

圖16 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠記憶性HPIV-3特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.16 HPIV-3 specific memory T cell response in mice immunized with CPW3

圖17 CPW3免疫誘導(dǎo)的小鼠免疫應(yīng)答類(lèi)型Fig.17Immune response types in mice immunized withCPW3

3 討論

HPIV-3是引起3歲以?xún)?nèi)嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體，HPIV-3疫苗的研制對(duì)嬰幼兒下呼吸道感染疾病的預(yù)防具有重要意義。在HPIV-3疫苗研發(fā)中，滅活疫苗由于存在免疫接種后的疾病增強(qiáng)作用［11-13］，已被放棄。由于新生兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，免疫功能還不夠完善，不能引起足夠有效的免疫應(yīng)答和保護(hù)效力，亞單位疫苗的目標(biāo)人群主要是老年人以及孕婦。孕婦接種亞單位疫苗，可通過(guò)母?jìng)骺贵w對(duì)新生兒進(jìn)行保護(hù)［14-15］。對(duì)于嬰幼兒，鼻腔黏膜接種HPIV-3減毒活疫苗是最佳選擇［2，13，16-17］。首先，鼻內(nèi)接種簡(jiǎn)單方便；其次，經(jīng)黏膜免疫，疫苗可在呼吸道上皮細(xì)胞中復(fù)制，誘導(dǎo)MHC-Ⅰ型免疫應(yīng)答，不僅誘導(dǎo)呼吸道局部黏膜抗體分泌B細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可誘導(dǎo)具有CTL功能的黏膜CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，將病毒從感染細(xì)胞中清除；最后，經(jīng)鼻腔接種后，疫苗在嬰兒中的復(fù)制不受被動(dòng)獲得的病毒特異性母體抗體的限制［18］。目前，有兩種HPIV-3減毒活疫苗進(jìn)入臨床研究，一個(gè)是基于異源相關(guān)病毒的交叉保護(hù)，牛3型副流感病毒（bovin parainfluenza virus type-3，BPIV-3）被認(rèn)為是一個(gè)有希望的候選疫苗［19］，二期臨床結(jié)果顯示，BPIV-3減毒活疫苗在嬰兒中具有很好的安全性和耐受性，而且可誘導(dǎo)BPIV-3血清抗體應(yīng)答，并對(duì)HPIV-3感染具有交叉保護(hù)效力；另一個(gè)疫苗候選株是由HPIV-3經(jīng)Ca傳代得到的具有Ts特性的HPIV-3減毒株CP45，研究顯示，CP45比BPIV-3具有更強(qiáng)的免疫原性［20-21］，二期臨床結(jié)果表明，在血清HPIV-3抗體陰性嬰幼兒中，CP45具有很好的安全性和耐受性，且能誘導(dǎo)較高的中和抗體應(yīng)答和保護(hù)效力。因此，HPIV-3 Ca和Ts減毒疫苗的研發(fā)對(duì)嬰幼兒HPIV-3感染的保護(hù)具有重要意義。

本研究將從臨床標(biāo)本分離純化的高滴度病毒株LZ1501以化學(xué)誘變及連續(xù)降溫傳代的方法進(jìn)行Ca培養(yǎng)，篩選出兩株具有Ca和Ts特性的HPIV-3毒株CPW3、CPW5。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPW5免疫接種可導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增加顯著滯后于正常小鼠，提示該病毒株存在安全性問(wèn)題，因此在本文不做討論（未發(fā)表）。與親本野毒株LZ1501W3相比，CPW3在25℃時(shí)所致細(xì)胞病變明顯強(qiáng)于37和40℃，且25℃時(shí)CPW3滴度顯著高于其親本野毒株LZ1501W3，而在37和40℃時(shí)，其滴度顯著低于親本野毒株；小鼠模型驗(yàn)證可見(jiàn)，CPW3在小鼠較溫暖的肺部環(huán)境比在較涼的鼻環(huán)境復(fù)制更受限制，表明CPW3具有了Ca和Ts的特性。通過(guò)連續(xù)30 d的觀(guān)察，與親本株野毒株相比，在CPW3感染期間，小鼠并未出現(xiàn)包括體重增長(zhǎng)遲緩、發(fā)熱、腹瀉、體態(tài)和精神異常及死亡的臨床體征，肺部病理觀(guān)察結(jié)果表明，CPW3免疫小鼠及3劑免疫后攻毒小鼠肺部結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)與親本株及野毒株感染小鼠后相同的炎癥性病理特征，包括支氣管黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，肺泡腔及支氣管內(nèi)出現(xiàn)以紅細(xì)胞、少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和纖維素滲出為主的慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理反應(yīng)，表明CPW3毒株的安全性良好。

核苷酸測(cè)序結(jié)果表明，CPW3的全基因序列含15 404個(gè)核苷酸，與GenBank中HPIV-3分離株HPIV3／UK／ref／MK9（登錄號(hào)：MH678682.1）的同源性為99.84%。與親本野毒株LZ501W3核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在N、PP、M、F、HN、L基因上共有17個(gè)突變位點(diǎn)，其中12個(gè)突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生替換，氨基酸的替換是否與Ts和減毒特性相關(guān)，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。另外，CPW3與GenBank上HPIV-3減毒株CP45（登錄號(hào)：U51116.1）的同源性為96.08%，通過(guò)核苷酸及氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CPW3與CP45中氨基酸突變有所不同，可在今后的研究中對(duì)兩者減毒特性與氨基酸突變的相關(guān)性進(jìn)行分析。

以往對(duì)嬰幼兒接種減毒活疫苗研究表明，可能需接種1劑以上才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答［2］，因此，本研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和之前的研究結(jié)果（未發(fā)表）制定了間隔28 d接種3劑的免疫程序，并在2劑、3劑接種后第40天進(jìn)行攻毒，通過(guò)檢測(cè)上下呼吸道攻毒毒株病毒載量來(lái)研究CPW3的保護(hù)效力。通過(guò)對(duì)CPW3每劑接種后3 d在上、下呼吸道增殖情況的研究發(fā)現(xiàn)，隨著劑次的增加，CPW3在小鼠上、下呼吸道增殖能力逐漸下降，表明前一劑免疫所產(chǎn)生的應(yīng)答在一定程度上抑制了CPW3在小鼠體內(nèi)的增殖。選取CPW3接種后40 d攻毒的原因是此時(shí)CPW3在上、下呼吸道的病毒載量已下降到低值（未發(fā)表）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，接種2劑和3劑CPW3后攻毒，小鼠肺部病毒載量均顯著下降，且有劑次效應(yīng)。

中和抗體是疫苗保護(hù)效力和疫苗成功的關(guān)鍵指標(biāo)［22］。對(duì)CPW3免疫后小鼠血清HPIV-3特異性中和抗體的應(yīng)答研究顯示，鼻腔接種3劑可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的血清中和抗體應(yīng)答。中和抗體可與病毒結(jié)合，抑制病毒對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵入，是免疫保護(hù)的重要成分［22］。而且呼吸道黏膜由單層柱狀細(xì)胞構(gòu)成，屬于Ⅰ型黏膜上皮，血液中的中和抗體無(wú)論是IgA還是IgG，均可跨黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)至呼吸道內(nèi)腔，阻止病毒對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的侵染［23］。

許多研究證明，體液免疫應(yīng)答不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，而且在黏膜組織存在局部定植的抗體分泌B淋巴細(xì)胞（ASC）［24-27］，這種ASC對(duì)呼吸道、消化道以及生殖道病毒感染的保護(hù)作用至關(guān)重要［17］。對(duì)HIV的疫苗研究顯示［28］，含有virosome的gp41艾滋病疫苗經(jīng)鼻腔免疫非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，不僅可誘導(dǎo)循環(huán)抗體應(yīng)答，還可誘導(dǎo)生殖道黏膜局部定植ASC應(yīng)答，對(duì)HIV感染具有良好的保護(hù)作用，但肌肉注射的gp41疫苗對(duì)HIV感染的保護(hù)效力則遠(yuǎn)低于前者，原因是肌肉注射只產(chǎn)生循環(huán)抗體應(yīng)答，而無(wú)黏膜局部定植ASC應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPW3減毒活疫苗鼻內(nèi)3劑免疫，可顯著誘導(dǎo)小鼠肺部局部記憶性IgA和IgG ASC的免疫應(yīng)答，且具有劑次效應(yīng)。這種局部定植的記憶性ASC應(yīng)答可為HPIV-3感染提供長(zhǎng)期的保護(hù)［29］。

研究顯示［30-31］，與流感裂解疫苗相比，流感減毒活疫苗具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其不僅可誘導(dǎo)呼吸道局部黏膜抗體應(yīng)答的產(chǎn)生，同時(shí)可誘導(dǎo)黏膜T細(xì)胞免疫應(yīng)答，兩者協(xié)同，在呼吸道局部發(fā)揮更強(qiáng)的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，接種后T細(xì)胞免疫應(yīng)答研究結(jié)果顯示，CPW3不僅可誘導(dǎo)小鼠外周血中記憶性IFNγ-CD4+T和IFNγ-CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，還可誘導(dǎo)顯著的肺部定植記憶性IFNγ-CD8+T和IFNγ-CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，前者發(fā)揮CTL的功能，可清除細(xì)胞內(nèi)感染病毒［30-33］，后者發(fā)揮Th細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)肺部特異性抗體和細(xì)胞因子的分泌，與肺部定殖的IgG／IgA ASC共同作用，對(duì)HPIV-3感染提供保護(hù)［34］。

由于HPIV-3的感染主要存在于嬰幼兒，該類(lèi)人群主要特點(diǎn)是免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠完全，免疫應(yīng)答偏向于Th2型，過(guò)量的Th2免疫應(yīng)答可造成疾病增強(qiáng)效應(yīng)，導(dǎo)致肺部炎癥的增加［35-36］。因此，有效的疫苗不僅要能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的系統(tǒng)和黏膜免疫應(yīng)答，以保護(hù)上、下呼吸道感染，更重要的是能夠誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，通過(guò)產(chǎn)生IFNγ以及TNF和IL-2，發(fā)揮抗病毒作用。本研究中CPW3免疫可誘導(dǎo)小鼠肺、脾、外周血中記憶性IL-4-CD4+T細(xì)胞的顯著應(yīng)答，但應(yīng)答水平均低于IFNγ-CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，表明CPW3免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1和Th2混合型CD4+T免疫應(yīng)答，但稍偏向于Th1型，不會(huì)引起疾病增強(qiáng)作用［37-40］。

綜上所述，本研究篩選出的1株具有Ca和Ts特性的HPIV-3病毒株CPW3，鼻腔免疫接種小鼠顯示，CPW3對(duì)小鼠體重增加和體溫?zé)o顯著影響，具有安全性；CPW3可顯著誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HPIV-3特異性肺部定植體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及血清中和抗體應(yīng)答，具有良好的免疫原性；攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，間隔28 d 3劑免疫CPW3，對(duì)小鼠肺部HPIV-3感染具有顯著的保護(hù)效力。CPW3是一株有希望的HPIV-3減毒活疫苗候選株，值得開(kāi)展進(jìn)一步的研究。