施金榮,申璦琳,鄧濤,潘俊杰,劉青,程小玲,羅敏,段凱
1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司,湖北 武漢 430207;2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430207
新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的呼吸道傳染病,嚴重影響公共健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定,接種疫苗是預(yù)防控制COVID-19的有效措施之一。滅活疫苗具有生產(chǎn)工藝成熟、安全性良好、免疫原性穩(wěn)定等優(yōu)點,目前,已有多款新型冠狀病毒滅活疫苗獲得緊急使用或批準附條件上市[1]。國家藥品監(jiān)督管理局于2021年2月25日批準武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司(簡稱武漢生物)生產(chǎn)的新型冠狀病毒滅活疫苗附條件上市申請。該疫苗系將SARS-CoV-2接種于Vero細胞,收集上清液,經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后進行澄清、超濾,再經(jīng)第2次β-丙內(nèi)酯滅活、凝膠層析、離子交換層析、除菌過濾后,吸附鋁佐劑制備而成[2-3]。鋁佐劑是應(yīng)用于人類疫苗最廣泛的佐劑,具有良好的安全性和有效性[4-6],可顯著提高疫苗的免疫原性,但其形成的佐劑-抗原復(fù)合物可導(dǎo)致大多數(shù)抗原表位隱藏于鋁佐劑顆粒沉淀中,致使無法直接采用ELISA法檢測抗原含量[7-8]。
國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心針對新型冠狀病毒滅活疫苗發(fā)布的最新技術(shù)指導(dǎo)原則提出,該滅活疫苗需要進行體外效價檢測,一般是檢測疫苗抗原含量[9],此項指標對新型冠狀病毒滅活疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。目前已上市的新型冠狀病毒滅活疫苗均使用了鋁佐劑[1-2,10-13],檢測抗原含量過程中需加入解離液,將抗原從鋁佐劑中解離下來,從而準確定量檢測抗原含量。本實驗對新型冠狀病毒滅活疫苗的解離液及解離條件進行優(yōu)化,并按《中國藥典》四部(2020版)[14]規(guī)定進行驗證,以期為該滅活疫苗的質(zhì)量控制提供可靠的檢測方法。
1.1 疫苗及疫苗參考品 新型冠狀病毒滅活疫苗成品(已吸附氫氧化鋁佐劑,批號:202106110A、2021-06110A、202106111A、202106201、202106202)、新型冠狀病毒滅活疫苗原液(未吸附氫氧化鋁佐劑,批號:202105Y097)及新型冠狀病毒滅活疫苗參考品(已吸附氫氧化鋁佐劑,理論抗原含量為400 WU/mL,批號:202101001)均由武漢生物提供。
1.2 主要試劑SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒由武漢生物提供;EDTA(貨號:10009617)、二乙醇胺(貨號:20210413)、檸檬酸鈉(貨號:39476466)及尿素(貨號:A12360)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;TritonX-100(貨號:BB16BA0001)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Tween20(貨號:WXBD4332V)購自美國SIGMA-ALORICH公司。
1.3 解離液配制 采用純化水配制6種解離液。解離液1:0.05 mol/L EDTA;解離液2:0.3%(v/v)二乙醇胺、1%(v/v)TritonX-100、10%(m/v)檸檬酸鈉、1 mol/L尿素、0.1 mol/L EDTA,定容至100 mL;解離液3:0.3%(v/v)二乙醇胺、1%(v/v)TritonX-100、10%(m/v)檸檬酸鈉、1 mol/L尿素、0.05 mol/L EDTA,定容至100 mL;解離液4:0.1 mol/L EDTA;解離液5:0.1%(v/v)TritonX-100、0.1 mol/L EDTA、0.05%(v/v)Tween20,定容至100 mL;解離液6:0.1mol/LEDTA、0.05%(v/v)Tween20,定容至100mL。
1.4 解離液的優(yōu)化 以新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A)作為供試品,與6種解離液分別按1∶1或1∶2的體積比混合,振蕩混勻,于37℃解離20 h,以新型冠狀病毒滅活疫苗參考品作為對照。采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測抗原含量,并按下式計算解離率。
1.5 解離條件的優(yōu)化 以新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A)為供試品,用最佳解離液按1∶1的體積比混合,于室溫或37℃分別解離2、10和20 h,每個樣品設(shè)2個復(fù)孔,經(jīng)純化水進行2倍系列稀釋(1∶1~1∶128),采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測A450。
1.6 最佳解離液及解離條件的驗證
1.6.1 干擾試驗 以未吸附鋁佐劑的新型冠狀病毒滅活疫苗原液作為供試品,經(jīng)純化水稀釋10倍,用最佳解離液進行2倍稀釋;將未吸附鋁佐劑的新型冠狀病毒滅活疫苗原液用純化水進行20倍稀釋,以其作為對照。最佳條件解離后,采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測抗原含量,試驗重復(fù)5次。
1.6.2 準確性 將新型冠狀病毒滅活疫苗參考品用純化水稀釋至320 WU/mL,與最佳解離液按1∶1的體積比混合,最佳條件解離后,采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測抗原含量,并按下式計算回收率。試驗重復(fù)6次。
1.6.3 精密性
1.6.3.1 重復(fù)性 以新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A)為供試品,新型冠狀病毒滅活疫苗參考品作為對照,分別與最佳解離液按1∶1的體積比混合,經(jīng)最佳條件解離后,采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測體外相對效力。由同一實驗員于3個不同日期(2022-02-05、2022-02-06、2022-02-07)重復(fù)6次試驗,計算變異系數(shù)(CV)。
1.6.3.2 中間精密性 由3名實驗員(A、B、C)于同一時間按1.6.3.1項方法檢測新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A)的體外相對效力,計算CV。
1.6.4 耐用性 以新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A)為供試品,新型冠狀病毒滅活疫苗參考品作為對照,分別與最佳解離液按1∶1的體積比混合,于37℃解離16、20、24 h,采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測體外相對效力,并計算CV;另將供試品與最佳解離液按體積比1∶1混合,37℃解離20 h,在SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測體外相對效力過程中,加入TMB顯色液終止反應(yīng),放置0、10、20 min,再用酶標儀檢測,計算CV。試驗均重復(fù)3次。
1.6.5 適用性 以4批新型冠狀病毒滅活疫苗成品(批號:202106110A、202106111A、202106201、2021-06202)為供試品,新型冠狀病毒滅活疫苗參考品為對照,分別與最佳解離液按1∶1的體積比混合,經(jīng)最佳條件解離后,采用SARA-CoV-2抗原ELISA檢測試劑盒檢測體外相對效力,試驗重復(fù)6次,計算CV。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS V21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均值±標準差()表示,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 最佳解離液6種解離液中,解離液5的解離率最高,達70%以上;供試品與解離液體積比為1∶1時的解離效果更好。見表1。因此確定最佳解離液為解離液5,最佳體積比為1∶1。
2.2 最佳解離條件 于室溫解離的供試品A450均低于37℃,其中37℃解離20 h時,不同稀釋倍數(shù)的供試品A450最高,解離效果最好,見圖1。因此確定37℃解離20 h作為最佳解離條件。
2.3 最佳解離液及解離條件的驗證
2.3.1 干擾試驗 供試品及對照品的抗原含量均值分別為7 114和7 226 WU/mL,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.963,P>0.05)。表明解離液5對疫苗抗原含量檢測不存在干擾。
2.3.2 準確性 重復(fù)檢測6次新型冠狀病毒滅活疫苗參考品的抗原含量分別為321、314、320、327、322、318 WU/mL,回收率在98.13%~100.63%之間,見表2。表明該方法具有良好的準確性。
圖1 不同解離條件的解離效果Fig.1 Dissociation results under various dissociation conditions
表1 不同解離液的解離效果Tab.1 Dissociation effects of various dissociation buffers
表2 準確性驗證結(jié)果Tab.2 Verification for accuracy
2.3.3 精密性
2.3.3.1 重復(fù)性 同一實驗員于3個不同日期(2022-02-05、2022-02-06、2022-02-07)重復(fù)檢測6次供試品的體外相對效力均值分別為(0.95±0.02)、(0.97±0.06)、(0.94±0.03),CV分別為2.08%、6.12%、3.32%,均<10%,見表3。表明該方法具有良好的重復(fù)性。
2.3.3.2 中間精密性3名實驗員(A、B、C)重復(fù)檢測6次供試品的體外相對效力均值分別為(0.95±0.02)、(0.94±0.03)、(0.95±0.02),CV分別為2.08%、6.12%和3.32%,均<10%,見表4。表明該方法具有良好的中間精密性。
2.3.4 耐用性 供試品解離16、20、24 h重復(fù)3次檢測體外相對效力的均值分別為(0.97±0.04)、(0.95±0.03)、(0.97±0.03),CV分別為3.72%、2.64%、3.57%,均<10%,見表5。表明適當延長或縮短解離時間不影響檢測結(jié)果。ELISA檢測過程中終止反應(yīng)后放置0、10、20 min的供試品,重復(fù)檢測3次體外相對效力的均值分別為(0.93±0.01)、(0.94±0.00)、(0.92±0.01),CV分別為0.62%、0.00%、0.63%,均<1%,見表6。表明適當延長或縮短終止反應(yīng)后放置時間不會影響檢測結(jié)果。
2.3.5 適用性 批號為202106110A、202106111A、202106201、202106202的4批供試品,重復(fù)6次檢測體外相對效力的均值分別為(0.94±0.06)、(0.96±0.06)、(0.99±0.07)、(1.00±0.05),CV分別為6.66%、6.56%、6.69%、5.18%,均<10%,見表7。表明最佳解離液及解離條件適用于不同批次供試品的解離。
表3 重復(fù)性驗證結(jié)果Tab.3 Verification for reproducibility
表4 中間精密性驗證結(jié)果Tab.4 Verification for intermediate precision
表5 不同解離時間的檢測結(jié)果Tab.5 Determination results of samples dissociated for various hours
表6 終止反應(yīng)后放置不同時間的檢測結(jié)果Tab.6 Determination results of samples stored for various minutes after termination of reaction
表7 適用性驗證結(jié)果Tab.7 Verification for applicability
目前,全球范圍內(nèi)至少已有4款新型冠狀病毒滅活疫苗獲批上市[1],生產(chǎn)廠家包括武漢生物、北京生物制品研究所有限責(zé)任公司、北京科興中維生物有限公司、印度Bharat Biotech公司,這4款疫苗均使用了鋁佐劑[2,11-13]。武漢生物研發(fā)的新型冠狀病毒滅活疫苗在阿聯(lián)酋等國家進行了國際多中心、隨機、雙盲、安慰劑平行對照的Ⅲ期臨床試驗,結(jié)果表明,2針免疫程序接種后,中和抗體陽轉(zhuǎn)率超過99%,總體保護效力超過70%[15],達到世界衛(wèi)生組織(WHO)及國家藥品監(jiān)督管理局相關(guān)標準要求[16]。滅活疫苗的關(guān)鍵成分在產(chǎn)品質(zhì)量控制中應(yīng)得到準確定量,才能有效評價產(chǎn)品質(zhì)量屬性。新型冠狀病毒滅活疫苗的有效抗原主要包括S、M和N蛋白,目前多采用ELISA法進行抗原含量檢測。
有研究表明,位于SARS-CoV-2囊膜上的疫苗關(guān)鍵抗原易受到溶液酸堿度、離子強度、流體力學(xué)和儲存條件等因素的影響,抗原蛋白結(jié)構(gòu)在強解離過程中可能會發(fā)生變性,從而影響抗原含量的準確定量檢測[7-8]。因此,解離液配方和解離條件的選擇需綜合考慮解離率以及對抗原蛋白結(jié)構(gòu)的影響,選擇能夠穩(wěn)定溶液體系,使抗原從鋁佐劑上快速解離,同時保護抗原表位結(jié)構(gòu),不影響抗原免疫活性的解離液和解離條件顯得尤為重要[7]。本研究共配制了6種解離液,其中解離液5[0.1%(v/v)TritonX-100,0.1 mol/L EDTA,0.05%(v/v)Tween20]的解離率最高。解離液與供試品按1∶1的體積比混合,于37℃放置20 h,是最佳解離條件。為排除解離液5的成分對抗原定量檢測的干擾,本研究選擇未吸附鋁佐劑的新型冠狀病毒滅活疫苗原液作為供試品,檢測加入解離液5與不加解離液5的區(qū)別,結(jié)果表明,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明解離液5的成分不干擾抗原檢測結(jié)果。同時,對最佳解離液和解離條件進行了準確性、精密性、耐用性和適用性驗證,準確性驗證結(jié)果表明,樣品回收率在98.13%~100.63%之間;精密性驗證結(jié)果表明,不同日期及不同實驗員重復(fù)檢測結(jié)果的CV均<10%;耐用性驗證結(jié)果表明,供試品解離16、20、24 h后檢測結(jié)果的CV均<10%,ELISA檢測中終止反應(yīng)后放置0、10、20 min檢測的CV均<1%;適用性驗證結(jié)果表明,4批新型冠狀病毒滅活疫苗成品檢測結(jié)果的CV均<10%。上述結(jié)果表明,解離液5及最佳解離條件在新型冠狀病毒滅活疫苗抗原ELISA檢測試劑盒中的應(yīng)用具有良好的準確性、精密性、耐用性和適用性。
綜上所述,本研究選擇的最佳解離液和解離條件效果好,干擾小、重復(fù)性和適用性好,為新型冠狀病毒滅活疫苗體外效力的檢測提供了可靠的檢測方法。