劉一霆，邱濤，周江橋（武漢大學(xué)人民醫(yī)院器官移植科，湖北 武漢 430060）

肝移植是目前終末期肝病治療的最佳選擇［1］，但器官短缺導(dǎo)致超過11%的患者因肝臟失代償和死亡而失去移植機會［2］。因此人們嘗試使用邊緣供肝、活體供肝、劈離肝或通過改善邊緣供肝進行移植，從而增加可用的肝移植數(shù)量［2-3］。肝缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是肝移植過程中固有的一部分，在邊緣供肝中表現(xiàn)更為嚴重［4］。IRI 通過損傷肝細胞、內(nèi)皮細胞和膽管細胞等肝實質(zhì)細胞從而引起微循環(huán)衰竭和炎癥免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致移植物功能障礙和缺血性膽道病變［5-6］。由于邊緣器官的大量使用，近年來細胞治療聯(lián)合常溫機械灌注應(yīng)用于肝移植研究中，成為目前研究熱點，本文將介紹此領(lǐng)域的最新進展。

1 常溫機械灌注的介紹

Starzl 等［7］率先將機械灌注應(yīng)用于肝移植。機械灌注（machine perfusion，MP）能夠持續(xù)地給器官灌注，為細胞代謝提供足夠的底物和氧氣，并在灌注期間持續(xù)監(jiān)測器官活力，限制缺血/再灌注損傷，并可能改善移植術(shù)后的預(yù)后，有益于保護邊緣供肝［8-10］。 常 溫 機 械 灌 注（normothermic machine perfusion，NMP）在37℃的條件下可以提供更多的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，更有利于保護邊緣供肝。2018 年，Nasralla 等［11］以NMP 作為保肝方法進行220 例肝臟移植，進行了首項國際性、多中心、隨機對照試驗，比較肝移植中的NMP 和靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）。研究表明，與SCS 相比，NMP 具有明顯的益處，既可以改善肝移植的結(jié)果，又可以降低器官丟棄率。這表明了NMP 更有利于邊緣供肝的保護，已經(jīng)成為替代SCS 的一種方法［12］。此外NMP 的應(yīng)用還可以降低風(fēng)險，此前未使用的高危肝應(yīng)用于臨床成為可能［13］。

NMP 還可以用于動態(tài)給藥或基因治療，進一步改善移植結(jié)果，治療藥物包括間充質(zhì)干細胞、血管擴張劑、抗炎藥、抗感染藥、siRNA 以及脫脂藥等［14］。最新的研究證明，利用原位常溫肝機械灌注，肝移植保存的安全時間可延長至1 周，保存時間的延長可能將增加細胞治療的機會，擴大治療的范圍，促進邊緣供肝的再生修復(fù)［15］。近年來，將細胞療法遞送至靶位點可降低不良反應(yīng)的風(fēng)險，聯(lián)合細胞治療來減輕移植物損傷和免疫排斥反應(yīng)逐漸成為新的研究熱點， 調(diào)節(jié)性樹突狀細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、多能成體干細胞（multipotent adult progenitor cells，MAPCs）等被用于誘導(dǎo)免疫耐受的研究并取得了良好的結(jié)果，這些細胞亞群具有抗炎和促再生活性，有助于減少IRI［16-17］。 目前在肝移植中引起較大關(guān)注的有MSCs、MAPCs 等。

2 間充質(zhì)干細胞與多能成體祖細胞的介紹

1968 年，F(xiàn)riedenstein 等［18］最先在骨髓中分離出MSCs。此后人們在脂肪組織和臍帶血等人體的其他組織細胞中相繼分離出了MSCs。根據(jù)來源不同，MSCs 可以命名為骨髓間充質(zhì)干細胞（bone-marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）、脂 肪 間 充 質(zhì) 干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞等。不同來源的MSCs 在分化能力和增殖速度方面有差異， 但它們表達的細胞膜表面抗原卻基本一致。根據(jù)國際細胞治療學(xué)會（International Society for Cellular Therapy，ISCT） 的鑒定標準， 人MSC 具備多種特征：① 在標準培養(yǎng)條件下具有塑料表面黏附性；② 表達特定細胞表面標志物CD105、CD73、CD90， 同時不表達CD45、CD34、CD14 或CD11b 、CD79α 或CD19 以及HLA-DR；③ 能夠在體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞［19］。

MAPCs 也屬于MSC 家族，并且顯示出更高的增殖能力和更大的分化潛能。MAPCs 首先由Balkrishna 等［20］于2002 年從小鼠骨髓中分離出來。研究表明MAPCs 不僅可以減弱 CD8 +細胞毒性 T 淋巴細胞功能的誘導(dǎo)和抑制性 T 淋巴細胞的增殖，而且可能抑制正在進行的免疫反應(yīng)，以及其具有非免疫原性，可以減弱IRI，這些都為MAPCs 用于移植物抗宿主模型中并且進行抗炎治療提供依據(jù)［21］。

3 細胞治療在肝臟常溫機械灌注中的應(yīng)用

MSCs 由于具有促肝細胞再生、抗炎、抗纖維化以及免疫調(diào)節(jié)等能力，目前已用于各種肝病治療。鑒于 MSCs 的自我更新能力及其在組織工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的治療潛力，MSCs 被認為是理想的移植細胞來源［22］。目前的證據(jù)表明，基于 MSC 的療法及其促再生作用主要依賴于MSCs 的旁分泌作用。趨化因子過表達能夠促進MSCs 增殖并遷移到受損組織，而旁分泌因子（包括趨化因子、細胞因子和生長因子）的大量分泌會刺激附近的細胞進行組織修復(fù)，從而發(fā)揮MSCs 的抗凋亡、抗炎、抗纖維化和血管生成作用［23］。最近Monique 等［24］首次實現(xiàn)了通過30 min 體外低溫充氧機灌注將旁分泌活性人間充質(zhì)干細胞（paracrine active human mesenchymal stem cells，hMSC）遞送至肝移植物，在組織學(xué)和RNA 表達分析中證實了hMSC 在整個肝移植物中的傳遞，且在輸注后的4 h 常溫機械灌注過程中能夠保留旁分泌功能，人類特異性白細胞介素-6 和白細胞介素-8 的水平增加。這是第一份報告顯示 hMSC 在肝機械灌注模型中可以有效傳遞，也證明hMSC 在常溫灌注過程中具有再生和免疫調(diào)節(jié)作用。

3.1 BMMSCs 聯(lián)合NMP 減少肝組織損傷：研究顯示， 大鼠熱缺血時間超過45 min 時， 術(shù)后受體的生存時間大幅縮短， 而熱缺血60 min 時， 供肝已經(jīng)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)損傷［25］。研究者利用熱缺血45 min 的邊緣供肝，將NMP 與BMMSCs 相結(jié)合，得到較好的結(jié)果［26］。最近Yang 等［27］使用IAR20 細胞氧化應(yīng)激損傷模型進行對照實驗，實驗表明與SCS 相比，NMP （P）組和NMP 結(jié)合BMMSCs（BP）組，肝功能和肝組織損傷明顯改善，肝細胞凋亡和氧化應(yīng)激得到了降低，并且改善了肝細胞線粒體損傷，且BP組明顯優(yōu)于P 組。進一步研究結(jié)果顯示NMP 聯(lián)合BMMSCs 的保護作用可能是通過抑制JNK-NF-κB通路降低氧化應(yīng)激，促進AMPK 活化，從而減少線粒體損傷，提高線粒體功能，進而更好的改善供肝質(zhì)量。此外該研究者的另一個實驗中，在大鼠胸主動脈取心臟死亡器官捐獻（donation after circulatory death，DCD）供肝，建立大鼠NMP 系統(tǒng)并進行對照實驗，與NMP （P） 組相比，BMMSCs 結(jié)合NMP （BP）組能顯著抑制肝內(nèi)巨噬細胞活化和細胞間黏附，改善內(nèi)皮損傷，顯著改善內(nèi)皮素1-一氧化氮平衡和微循環(huán)灌注［28］。Cao 等［29］的最近一項實驗表明，NMP 聯(lián)合BMMSCs 可以通過下調(diào)細胞內(nèi)活性氧和游離Fe2﹢的水平，從而實現(xiàn)對大鼠DCD 供肝的保護作用。這些無疑證明了BMMSCs 聯(lián)合NMP 的可行性，更好的降低氧化應(yīng)激，保護線粒體功能，改善供肝的微循環(huán)。研究表明，MSC 具有分化為肝細胞樣細胞的潛力［30］。在肝損傷的情況下，BMMSCs 可定向分化為肝細胞，HGF 和半乳糖聚集素-3 均能夠更好地促進這一過程。最近，研究者將二者相結(jié)合，在大鼠模型中獲得理想的結(jié)果［31］。是否可將它們聯(lián)合機械灌注應(yīng)用到邊緣供肝的再生修復(fù)，這可能為未來細胞治療在肝臟機械灌注的研究提供了一些新思路。

3.2 血 紅 素 加 氧 酶（heme oxygenase，HO-1）/BMMSCs 聯(lián)合NMP 減少肝組織損傷：HO-1 是一種有效的細胞保護酶，可以抗氧化和抗凋亡，有助于減少細胞損傷，調(diào)節(jié)免疫力，延長BMMSCs 的存活時間并增強其活性［32］。此前的研究表明MSC 衍生的白介素-6 和肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）抑制單核細胞成熟為樹突狀細胞，并將活化的 CD4 T 細胞從 Th1 轉(zhuǎn)變?yōu)?Th2 表型。MSC還通過分泌HO-1 和吲哚胺 2，3-雙加氧酶來抑制CD8 T 細胞的增殖，并提高CD4 T 細胞從 Th1 轉(zhuǎn)變?yōu)?Th2 的表型［22，33］。 HO-1 表達上調(diào)已被報道在促進肝細胞增殖中起關(guān)鍵作用，He 等［34］的研究證明了抑制HO-1 可以通過下調(diào)HGF-Akt 軸來減弱低溫機器灌注（hypothermic machine perfusion， HMP）誘導(dǎo)的與增殖相關(guān)的肝臟恢復(fù)效應(yīng)，來減弱肝臟的再生功能。

由于了解了HO-1 的作用，科學(xué)家們嘗試將HO-1 同BMMSCs 和NMP 相結(jié)合，以期待更好的改善供肝質(zhì)量。最近Cao 等［35］就利用轉(zhuǎn)染HO-1 基因，建立了NMP 體系并進行對照實驗，實驗結(jié)果顯 示HO-1 修 飾 的BMMSCs（HO-1/BMMSCs）聯(lián)合NMP 組轉(zhuǎn)氨酶水平降低，減少肝組織損傷，并且發(fā)現(xiàn)肝臟形態(tài)完整，生存時間延長，血清和肝臟促炎細胞因子水平降低。與BMMSCs 聯(lián)合NMP 組、NMP 組以及SCS 組相比，HBP 組可以更有效地降低HMGB1 在肝組織中的水平，并且降低TLR4 通路相關(guān)分子的表達。因此HO-1 可以通過HMGB1 表達和TLR4 通路來抑制炎癥反應(yīng)并減少肝臟損害，從而加強了BMMSCs 聯(lián)合NMP 對DCD 供肝的保護作用。

Cao 等［36］的 最 新 一 項 研 究 探 討 了HO-1/BMMSCs 聯(lián)合NMP 對DCD 肝移植后膽管損傷的修復(fù)作用。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，HBP 組的肝功能和膽管組織學(xué)得到改善，細胞凋亡減少，同時細胞增殖活躍。損傷部位出現(xiàn)大量再生細胞，缺損膽管上皮得到修復(fù)。膽道周圍腺（peribiliary glands，PBGs）擴張，PBG 細胞增殖，血管內(nèi)皮生長因子高表達，具有干/祖細胞生物標志物的膽道祖細胞比例增加。而阻斷Wnt 信號通路可顯著抑制HO-1/BMMSCs 對膽管損傷的修復(fù)作用。因此HO-1/BMMSCs 聯(lián)合NMP 可以促進PBGs 中膽道祖細胞的激活，從而通過Wnt 信號通路修復(fù)DCD 肝移植膽道損傷。HO-1/BMMSCs 和NMP 的結(jié)合有利于更好地減少肝組織損傷，克服了BMMSCs 的短生存時間，提高了供體肝臟的質(zhì)量和術(shù)后存活率，HO-1 的應(yīng)用為未來臨床中緩解肝臟移植前的IRI 以及修復(fù)移植后的膽道損傷提供了新思路。

3.3 細胞外囊泡（extracellular vesicles ，EVs）聯(lián)合NMP 減少肝組織損傷：近年來，間充質(zhì)干細胞衍生的細胞外囊泡作為基于MSC 療法的替代療法引起了人們的關(guān)注。EVs 是源于肝臟不同細胞的膜性囊泡。EVs 包括外泌體和微泡，含有mRNA、 miRNA和生長因子等，具有抗原呈遞作用，在肝臟不同細胞類型之間傳遞信息方面具有關(guān)鍵作用。EVs 可以改變受體細胞的功能并激活不同的通路，從而促進不同肝臟疾病的發(fā)生、進展和發(fā)病機制，可用于肝臟疾病修飾或肝臟再生，通過EVs 將核酸和其他藥物輸送到肝臟細胞進行相應(yīng)治療可能會得到較好療效［37-38］。Carlson 等［17］應(yīng)用了肝IRI 和動物同種異體肝移植模型，證明了從間充質(zhì)干細胞、未成熟樹突狀細胞和肝細胞中分離的EVs 可以通過增強線粒體自噬、抑制免疫反應(yīng)和促進組織再生等機制減少移植物損傷。研究表明，EVs 聯(lián)合機械灌注的肝臟也可顯示出較低的肝損傷標志物，例如血清AST、ALT 和乳酸脫氫酶等。同時標志物缺氧誘導(dǎo)因子1和轉(zhuǎn)化生長因子β1 的表達較低。EVs 作為一種新療法，能夠緩解肝臟 IRI 和同種異體移植模型中的移植物損傷。這些表明EVs 的應(yīng)用可能有助于 NMP所需的修復(fù)過程。

Rigo 等［39］首次將NMP 與EVs 相結(jié)合起來在移植前修復(fù)受損供體肝臟。研究者使用NMP 的離體小鼠模型并植入人肝干細胞來源的細胞外囊泡（human liver stem cell derived extracellular vesicles，HLSC-EV），研究顯示灌注HLSC-EV 的治療組較僅使用NMP 的對照組而言，灌注過程中AST 和乳酸脫氫酶顯著降低，最終EV 治療顯著降低了組織損傷、細胞凋亡和缺氧誘導(dǎo)因子1-α 的RNA 過表達和轉(zhuǎn)化生長因子β1。NMP 結(jié)束時，HLSC-EV 已被肝細胞攝取。這些結(jié)果提供了證明，即EVs 可以有效地減少了缺氧NMP 期間的肝損傷。此研究在動物模型中證明了NMP 期間輸注EVs 減少肝組織損傷的可行性，今后值得進一步研究這種策略以提高邊緣供肝的利用率。

最近Ohara 等［40］的 一項研究表明，羊膜間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡（amniotic mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles ，AMSC-EVs）可能通過抑制造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSCs）和庫普弗細胞的活性來減輕非酒精性脂肪肝及肝纖維化的進程。而在肝移植再灌注的過程中，庫普弗細胞的激活引起微循環(huán)障礙、缺氧和內(nèi)皮細胞損傷是導(dǎo)致移植功能障礙的關(guān)鍵機制之一［41-42］。今后是否可以通過AMSC-EVs 與NMP 相結(jié)合更好地減輕供體肝臟纖維化的進展？這可能需要更為廣泛的實驗研究和臨床試驗來解決這個問題從而造?；颊摺?/p>

3.4 MAPCs 聯(lián)合NMP 首次應(yīng)用于人類供肝：由于此前肝臟常溫機器灌注（normothermic machine perfusion-liver，NMP-L）對人體供體肝臟進行細胞治療尚未有文獻報道。Laing 等［43］最近的一次研究使用NMP-L 將MAPCs 提供給人類供體肝臟，利用6 個廢棄的人類肝臟，將導(dǎo)管通過肝動脈和門靜脈輸注MAPCs 直接注入肝右葉。證明了可以在暴露宿主免疫細胞之前將細胞直接遞送至靶器官，并且不會損害灌注。研究發(fā)現(xiàn)，MAPCs 處理過的肝臟細胞因子譜發(fā)生了變化，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)MAPCs 可能分泌一些可溶性因子，這些因子在人類肝移植模型中具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。這些表明了MAPCs 在肝臟機械灌注中的可行性。研究者同樣也指出了一項確保細胞輸注的新技術(shù)，該技術(shù)采用動脈輸注的方法，克服了全身輸注的缺點，使得細胞輸注更加高效。但是研究仍存在一定的局限性，使用的肝臟數(shù)量較少且為廢棄肝臟以及治療組之間細胞輸注的時間不同，可能無法得到有效的統(tǒng)計學(xué)結(jié)論。對整體器官“生存力”的影響以及MAPCs 對于目前認為不可移植器官的作用是無法評估的。

3.5 其他：Cailah 等［44］創(chuàng)新性地開發(fā)了一種基于細胞的傳感器，利用機械灌注將生物傳感器細胞移植入供體肝臟，在肝移植后早期就能夠檢測出急性或慢性排斥反應(yīng)，作為監(jiān)測和治療組織移植的廣泛方法。也正是因為細胞的植入不會損害器官，因此細胞傳感器還可以提供一種監(jiān)測器官質(zhì)量的方法，作為移植之前用于邊緣供體器官復(fù)蘇的釋放標準。這項技術(shù)的開發(fā)無疑將細胞治療在肝臟機械灌注中應(yīng)用推向新的高度，更加有利于邊緣供肝的保護。

4 未來發(fā)展方向

研究發(fā)現(xiàn)不同的機械灌注聯(lián)合更有利于供肝保存。Boteon 等［45］通過實驗對比發(fā)現(xiàn)將低溫氧合灌注（hypothermic oxygenated perfusion ，HOPE）和NMP 相結(jié)合，可能比NMP 更好地減輕肝臟的氧化應(yīng)激和組織炎癥反應(yīng)以及更好地改善肝臟的代謝恢復(fù)。最近的一項研究顯示，相較于單純肝臟機械灌注，肝腎聯(lián)合低溫機器灌注不僅顯示出更加穩(wěn)定的pH 和K+值，而且天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的水平更低。肝腎聯(lián)合低溫機器灌注通過上調(diào)IL-6/Stat3 信號通路更好地增強肝臟增殖能力，然而肝腎聯(lián)合灌注的樣本量很小，需要更多的研究來確定其在肝移植中的長期作用［46］。因此聯(lián)合灌注和細胞治療相結(jié)合可能為未來的研究提供一些方向。

近幾年器官生物工程發(fā)展迅速，而再細胞化肝支架由于缺乏完整的血管網(wǎng)絡(luò)可導(dǎo)致移植后出血和血栓形成，成為限制其發(fā)展的主要障礙。Watanabe 等［47］證實了4.7 ml/min 灌注培養(yǎng)可促進竇級微血管的形成，利用灌注培養(yǎng)和表面涂層相結(jié)合，成功構(gòu)建了去細胞肝支架中的竇級微血管，解決了移植后再細胞化肝支架的局限性。Kim 等［48］使用抗 CD31 適配體來重建血管化生物工程肝臟結(jié)構(gòu)，降低移植后血管血栓形成的風(fēng)險，證明了在組織工程中使用抗 CD31 適配體的可行性。這些進展可能推動細胞治療與肝臟機械灌注的發(fā)展，由于微血管的重建可降低了一系列移植后的不良反應(yīng)，今后有望在機械灌注中提前清除邊緣供肝細胞，將再細胞化肝支架與細胞治療相結(jié)合，利用血管構(gòu)建更好地保護邊緣供肝，這需要更為廣泛的實驗研究和臨床試驗。

5 結(jié) 論

過去的幾年里，利用廢棄人體器官的臨床前模型和大量動物模型進行了大量實驗，細胞治療應(yīng)用于肝臟機械灌注來更好的保護邊緣供肝已經(jīng)進行了深入研究， 但迄今為止還沒有在 NMP 期間進行細胞治療的臨床移植。動脈灌注MAPCs 這項新技術(shù)的開發(fā)確保了細胞準確輸注，細胞傳感器的開發(fā)更加有助于在移植后監(jiān)測供肝，再細胞化肝支架的最新進展有望推動細胞治療更進一步。MSCs/MAPCs 聯(lián)合常溫機械灌注在抗免疫、減少IRI 以及促進供肝的再生修復(fù)等方面顯示出了希望。隨著細胞治療在肝臟機械灌注的發(fā)展，今后高危肝臟成為供肝將成為可能。研究工作者應(yīng)當(dāng)進一步挖掘細胞治療聯(lián)合機械灌注在供肝上的巨大臨床潛力，為終末期肝病患者帶來希望。