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        伯氏嗜木螨線粒體基因組全序列測定研究

        2018-10-16 06:34:10孫恩濤楊邦和陶香林葉長江李朝品
        皖南醫(yī)學院學報 2018年5期
        關鍵詞:線粒體基因組測序

        孫恩濤,楊邦和,陶香林,葉長江,李朝品

        (皖南醫(yī)學院 檢驗學院,安徽 蕪湖 241002)

        伯氏嗜木螨(Caloglyphusberlesei)屬無氣門亞目(Astigmata)、粉螨科(Acaridae)。該螨性喜高溫潮濕,常孳生于潮濕發(fā)霉的儲藏物,也可侵害中華真地鱉、美洲大蠊等資源昆蟲的卵和幼蟲,造成相當大的經濟損失。在適宜的溫、濕度條件下,伯氏嗜木螨大量孳生,可對人們的生活環(huán)境造成污染,引起哮喘等變態(tài)反應性疾病,甚至可通過某種途徑進入人體,導致人體內螨病[1]。本研究測定并分析了伯氏嗜木螨的線粒體基因組全序列。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集、飼養(yǎng)和鑒定 伯氏嗜木螨采自中華真地鱉培養(yǎng)床上的培養(yǎng)料,挑取單個雌螨在實驗室(25±1)℃、85%RH、無光照的條件下進行“克隆”培養(yǎng)。經過7~8周的培養(yǎng)后,在解剖鏡下直接分離出成螨,一部分制作成玻片標本以作形態(tài)鑒定[1],一部分饑餓24 h后用70% 酒精固定保存,存放于-80℃超低溫冰箱。

        1.2 方法

        1.2.1 基因組DNA的提取 采用傳統的酚氯仿提取基因組DNA。同時,利用DNeasy Tissue Kit(Qiagen,Hilden,Germany)試劑盒進行10個單個雌螨基因組DNA的提取。

        1.2.2 引物設計、長片段PCR擴增及測序 用節(jié)肢動物線粒體基因的通用引物[2-4],擴增出線粒體cox1、cob、rrnS和nad4-nad5基因序列,設計上述4個基因片段區(qū)間的長片段擴增引物(表1),反應總體積為50 μL,含LA-PCR BufferⅡ (Mg2+plus) 5 μL,dNTPs 8 μL,引物各1 μL,模板DNA濃度約為100 ng,LA Taq酶0.5 μL (5 U/μL),加無菌水補足。反應條件為:94℃預變性60 s;98℃變性10 s,退火與延伸在同一溫度下進行,55~60℃ 5 min,34個循環(huán),72℃終延伸10 min。通過Long-PCR擴增出大片段后,對純化后的PCR產物進行步移法測序。

        1.2.3 數據處理及分析 用DNAStar 軟件包的Editseq和Seqman軟件進行序列拼接和組裝,得到線粒體基因組全序列。采用Clustal X 2.0軟件,參考已測定的橢圓食粉螨線粒體基因組全序列(序列號KC700022)[5],查找蛋白質編碼基因、rRNA和tRNA在線粒體基因組全序列中的位置;用tRNAscan-SE1.23和ARWEN構建tRNA的二級結構進行鑒定[6-7]。假定控制區(qū)的二級結構用Mfold Server在線軟件構建[8]。

        表1 伯氏嗜木螨線粒體基因組擴增所用的PCR引物

        2 結果

        2.1 線粒體基因組結構和基因排布 伯氏嗜木螨mtDNA為閉合環(huán)狀分子,其長度為14 273bp(序列號KF499016),由13個蛋白質編碼基因,22個tRNA和2個rRNA基因構成,見表2。

        2.2 tRNA基因 伯氏嗜木螨tRNA基因長度為47~63 bp,平均長度為(53.6±3.49)bp。在所預測的二級結構中,僅trnK能形成三葉草結構,trnD等15個基因呈TV-loop結構,trnR等6個基因缺少D-臂,缺失可變臂和配對的莖。

        2.3 非編碼區(qū) 伯氏嗜木螨mtDNA最大的非編碼區(qū)(LNR)長341 bp,位于trnF和trnS1之間,AT含量為89.4%,高于其他區(qū)域。二級結構分析顯示,LNR存在類似微衛(wèi)星的“(AT)n”序列,且存在個體異質性(44~50 bp)。在AT重復序列的下游,是1個富含AT的區(qū)域,其AT含量可達94.29%,形成1個莖環(huán)結構。緊接AT富集區(qū)下游,形成1個含有短的回文序列(5′-ATGTA和TACAT-3′)的莖環(huán)結構。同時,在靠近LNR的3′端,還發(fā)現了一個穩(wěn)定的莖環(huán)結構,即由一個的連接環(huán)(GTTAAAAA)將28 bp的莖和發(fā)夾結構連接起來。此外,還預測有3個能穩(wěn)定形成莖環(huán)的二級結構。

        表2 伯氏嗜木螨線粒體基因組的結構

        inta:間隔區(qū),負值為相鄰基因重疊;LNR:最大的非編碼區(qū);在次要鏈上編碼的基因用下劃線表示。

        3 討論

        隨著分子生物學技術的發(fā)展,越來越多的蜱螨線粒體基因組提交到數據庫中,并廣泛地應用于蜱螨各個階元的系統學研究中。本研究獲得了伯氏嗜木螨線粒體基因組全序列,長度為14 273 bp,所編碼的37個基因,其相對位置與已釋放的無氣門亞目中橢圓食粉螨、屋塵螨和粉塵螨相一致[9]。

        伯氏嗜木螨線粒體tRNA基因具有缺乏T-臂或D-臂的非典型結構,這與真螨總目螨類線粒體tRNA基因的長度顯著縮短一致,其是否具有正常的功能,尚需進一步的線粒體轉錄組學研究。

        節(jié)肢動物線粒體控制區(qū)一般有較高的AT含量,作為復制起點的識別信號poly-T/A和形成潛在的莖環(huán)結構等[10]。伯氏嗜木螨LNR的AT含量高,且形成多個潛在的莖環(huán)結構。因此,我們推測伯氏嗜木螨線粒體LNR為其線粒體基因組的控制區(qū)。本研究測序獲得伯氏嗜木螨線粒體基因組全序列,為推動蜱螨分子系統學的研究提供了基礎信息。

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