王碩，樸大勛，任碩

【提要】 本文旨在研究CPNE1的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)作用，CPNE1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子生物學(xué)機(jī)制，以及CPNE1在腫瘤治療、預(yù)后中的作用等。CPNE1是一種高度保守的鈣依賴型磷脂結(jié)合蛋白，屬于Copines家族。CPNE1在N端有一對C2結(jié)構(gòu)域，在C端有一個(gè)A結(jié)構(gòu)域。CPNE能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白招募到磷脂表面，調(diào)節(jié)它們的活性和細(xì)胞內(nèi)的定位，還可能提供信號通路之間的串?dāng)_機(jī)制。CPNE1在多種腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象，通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，CPNE1基因被確定為癌基因。

腫瘤是威脅全球人類身體健康的一類重大疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。盡管近年來腫瘤治療方法的開發(fā)取得了顯著進(jìn)展，但發(fā)病率和死亡率仍居高不下且大多數(shù)晚期腫瘤患者的預(yù)后并沒有得到顯著改善。在全身治療過程中，化療耐藥的發(fā)生是大多數(shù)惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的一個(gè)主要原因。此外，現(xiàn)存的生物學(xué)標(biāo)記物對于腫瘤診斷篩查、預(yù)后評估的敏感性和特異性均不理想。因此，研究腫瘤的分子機(jī)制，尋找新的高敏感性和特異性的生物標(biāo)志物及分子靶標(biāo)對腫瘤的診療和預(yù)后都極為重要。CPNE1是一種高度保守的鈣依賴型磷脂結(jié)合蛋白，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。CPNE1在正常組織中多呈低表達(dá)，但CPNE1在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、三陰性乳腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中均有高表達(dá)，且其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這表明了CPNE1在正常組織和惡性腫瘤中存在表達(dá)差異。有研究證實(shí)，CPNE1可與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)相互作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。此外，CPNE1可與Micro RNA相互作用調(diào)節(jié)腫瘤的增殖和侵襲能力[2]。但CPNE1作用腫瘤的分子機(jī)制仍不太明確，因此需要進(jìn)一步探究CPNE1作用腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、信號通路及作用靶點(diǎn)。這對腫瘤的預(yù)防、診療和預(yù)后評估具有極為重要的意義。

1 CPNE1概述

1.1 CPNE1結(jié)構(gòu)

CPNE1 蛋白是 Copines 家族中第一個(gè)被研究者發(fā)現(xiàn)的成員，是由 Creutz 在進(jìn)行研究分離草履蟲偶聯(lián)蛋時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的[3]，其位于人第 20 號染色體上，可編碼 537 個(gè)氨基酸[4]。CPNE1蛋白由CPNE1基因編碼，主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，CPNE1是一種高度保守的鈣依賴型磷脂結(jié)合蛋白。CPNE1在N端有一對C2結(jié)構(gòu)域(C2a和C2b)[5]，C2結(jié)構(gòu)域是一個(gè)鈣依賴的磷脂結(jié)合基序，最初發(fā)現(xiàn)于蛋白激酶C，C2結(jié)構(gòu)域中包含有對鈣和磷脂結(jié)合非常重要的天冬氨酸殘基[6]，C2結(jié)構(gòu)域還具有鈣依賴的磷脂結(jié)合活性，這些殘基很可能會直接影響到CPNE蛋白對Ca2+刺激的亞細(xì)胞定位[7]，CPNE1的C2結(jié)構(gòu)域可能參與細(xì)胞信號和或膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[4]。在C端有一個(gè)A結(jié)構(gòu)域，A結(jié)構(gòu)域是從血管性血友病因子中得知的，血管性血友病因子是一種血漿和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[8]，A結(jié)構(gòu)域促進(jìn)CPNE1與多種細(xì)胞內(nèi)蛋白的結(jié)合[9]。研究表明，CPNE1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

1.2 CPNE1生物學(xué)作用

目前已有20多種蛋白質(zhì)被確定為CPNE靶標(biāo)，其中許多是參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)，如有絲分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MEK1)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)、蛋白磷酸酶5、CDC42調(diào)節(jié)的蛋白激酶以及NEDD8結(jié)合酶泛素C12[4,9]，CPNE能夠?qū)⑦@些目標(biāo)蛋白招募到磷脂表面，這表明它們可能會調(diào)節(jié)它們的活性和細(xì)胞內(nèi)的定位，以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的變化。有研究表明，CPNE1C2結(jié)構(gòu)域在海馬前體HiB5細(xì)胞的神經(jīng)元分化中具有關(guān)鍵的鈣非依賴性作用，可能與激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號有關(guān)。AKT已被發(fā)現(xiàn)參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞遷移、侵襲和存活[10]。有報(bào)道稱CPNE1可通過磷酸化殘基473上的AKT促進(jìn)神經(jīng)元分化[11]。并證明了這些事件與細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平或和CPNE1定位沒有強(qiáng)相關(guān)性[12]。有研究證實(shí)，C-Jun激活區(qū)結(jié)合蛋白1(C-Jun activation region binding protein 1,JAB1)通過CPNE1中的C2A結(jié)構(gòu)域與JAB1中的MPN結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來激活CPNE1的神經(jīng)元分化能力[13]，14-3-3γ通過與HIB5細(xì)胞中CPNE1C2a結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來激活CPNE1的神經(jīng)元分化能力[14]。此外，CPNE1介導(dǎo)的神經(jīng)元分化可以被HiB5細(xì)胞中的HCLS1 相關(guān)蛋白 X-1 表達(dá)抑制[15]。CPNE1被證實(shí)是體外肌肉發(fā)生的修飾基因。原發(fā)性干燥綜合征患者淚液分析顯示CPNE1過表達(dá)。CPNE1和RBM12在人、小鼠和斑馬魚中均存在啟動子和5′UTR共享。

1.3 CPNE1對信號通路調(diào)節(jié)作用

由于CPNE在細(xì)胞中有多個(gè)靶點(diǎn)，它們的表達(dá)可能會受到信號通路激活的調(diào)節(jié)，因此這一蛋白家族通常可能提供信號通路之間的串?dāng)_機(jī)制。在人胚胎腎293細(xì)胞中，來自腫瘤壞死因子-α受體的信號通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)以Ca2+依賴的方式受到CPNE1的調(diào)節(jié)。CPNE和NF-κB信號通路之間可能存在的直接聯(lián)系表現(xiàn)為NEDD8結(jié)合酶泛素C12和CPNE1A結(jié)構(gòu)域之間的相互作用[4]，NEDD8結(jié)合酶UBC12通過泛素連接酶復(fù)合物SCFβTrCP促進(jìn)核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)的降解[16-17]，CPNE可能通過激活泛素C12而促進(jìn)I-κB的降解，從而增強(qiáng)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CPNE顯性-陰性結(jié)構(gòu)可降低NF-κB被腫瘤壞死因子-α激活的能力，該結(jié)構(gòu)可能通過泛素C12的失調(diào)或錯(cuò)位來抑制腫瘤壞死因子-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過激活M膽堿能受體或應(yīng)用離子載體A23187將鈣引入人胚腎293細(xì)胞，可增強(qiáng)腫瘤壞死因子-α依賴的NF-κB的激活。鈣的這種作用完全被CPNE顯性-陰性結(jié)構(gòu)所阻斷。所有顯性-負(fù)性結(jié)構(gòu)的作用均可被全長CPNE1的過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，提示該結(jié)構(gòu)通過競爭性抑制CPNE發(fā)揮特異性作用[10]。

2 CPNE1在幾種常見腫瘤中表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，CPNE1在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、三陰性乳腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)方法檢測CPNE1蛋白的表達(dá)，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)檢測 CPNE1 mRNA 的表達(dá)。以下總結(jié)了幾種常見腫瘤中的表達(dá)情況，分析其臨床意義。

2.1 CPNE1與非小細(xì)胞肺癌

肺癌是人類癌癥死亡的主要原因[18]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的85%[19]，其主要分為鱗狀細(xì)胞肺癌、肺腺癌和大細(xì)胞癌[20]。非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后極差，5年生存率僅為15%[21]。所以，闡明非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制及發(fā)生發(fā)展過程，尋找新的治療靶點(diǎn)極為重要。研究證實(shí)CPNE1蛋白在正常肺組織表達(dá)量顯著低于非小細(xì)胞肺癌組織，且CPNE1的表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)，與腫瘤大小和腫瘤分化程度等無關(guān)。此外，CPNE1基因敲除可抑制NSCLC細(xì)胞的生長、細(xì)胞周期進(jìn)程和遷移[22]。另有研究表明CPNE1在非小細(xì)胞肺癌亞型間存在差異表達(dá)，與肺腺癌相比，鱗癌患者的CPNE1表達(dá)水平較高，但鱗癌患者miR-195-5p的表達(dá)水平較低，而生存率明顯較低。功能分析證明miR-195-5p的過表達(dá)直接靶向CPNE1通過調(diào)節(jié)EGFR信號通路來抑制了NSCLC來源的細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23]。轉(zhuǎn)染miR-195-5p模擬物之后，CPNE1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)均下調(diào)，通路分析表明，p-AKT、p-Erk和Snail在肺腺癌和鱗狀細(xì)胞系中的表達(dá)均降低。這表明miR-195-5p調(diào)控可能是非小細(xì)胞肺癌各亞型CPNE1表達(dá)差異的原因之一[23]。此外，CPNE1也可激活非小細(xì)胞肺癌中的c-MET來促進(jìn)癌癥發(fā)展[24]。以上證明，CPNE1是非小細(xì)胞肺癌中的癌基因，CPNE1蛋白高表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，有可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的分子靶點(diǎn)和非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評估的重要指標(biāo)。

2.2 CPNE1與前列腺癌

前列腺癌是老年男性最常見的癌癥類型之一,其亞洲發(fā)病率持續(xù)上升[25]。研究表明，CPNE1在正常前列腺組織的表達(dá)水平顯著低于前列腺癌，且發(fā)現(xiàn)與去勢抵抗性前列腺癌相比，非去勢抵抗性前列腺癌的CPNE1表達(dá)水平低下[26]。此外，發(fā)現(xiàn)CPNE1的表達(dá)水平與前列腺癌患者的腫瘤分期，格里森評分和生存率顯著相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)的共表達(dá)分析表明CPNE1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)表達(dá)顯著相關(guān)。通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析確定，CPNE1的過表達(dá)可以上調(diào)前列腺癌DU-145細(xì)胞中的TRAF2表達(dá)[26]。這表明CPNE1是預(yù)測前列腺癌生化無復(fù)發(fā)生存率的預(yù)后因子，而且與前列腺癌中TRAF2的表達(dá)量呈明顯正相關(guān)。CPNE1可能通過其C2結(jié)構(gòu)域來促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，其發(fā)生機(jī)制及分子通路還需進(jìn)一步探索研究。以上表明CPNE1可能影響前列腺癌的發(fā)展和進(jìn)展，至少部分是通過上調(diào)TRAF2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

2.3 CPNE1與三陰性乳腺癌

乳腺癌是女性癌癥死亡主要原因。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)中雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體均為陰性，對人表皮生長因子受體靶向治療和內(nèi)分泌治療無效[27]。且與放射治療后局部復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[28]。因此，急需尋找新的生物標(biāo)志物并闡明其作用機(jī)制。研究表明，CPNE1在TNBC組織表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織，并與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存率有關(guān)[29]。CPNE1在體外可抑制細(xì)胞凋亡及TNBC的放射敏感性，且沉默AKT信號抑制了CPNE1介導(dǎo)的TNBC發(fā)生發(fā)展和放射抗性，此外，體內(nèi)研究也證實(shí)，CPNE1基因敲除可抑制腫瘤增殖[29]。總之，CPNE1通過激活A(yù)KT來促進(jìn)TNBC發(fā)生和放射抗性。結(jié)果表明CPNE1可以被認(rèn)為是TNBC患者的一個(gè)預(yù)后因素。此外，靶向CPNE1有望成為TNBC潛在的新治療方案，有助于預(yù)測特定TNBC患者的放射敏感性，并有助于腫瘤細(xì)胞的增敏，從而改善TNBC患者的放射治療結(jié)果。

2.4 CPNE1與骨肉瘤

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一[30]。雖然骨肉瘤在各方面治療上獲得了較大進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的預(yù)后依舊很差[31]。研究骨肉瘤的分子機(jī)制，尋找新的標(biāo)志物對骨肉瘤的診斷、治療和預(yù)后都極為重要。CPNE1沉默能抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖。CPNE1在骨肉瘤組織中表達(dá)量明顯高于正常骨組織。功能研究證實(shí)，CPNE1基因敲除可顯著抑制Saos-2和HOS細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。CPNE1基因敲除導(dǎo)致Saos-2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期和G0/G1期。有分析表明，CPNE1沉默下調(diào)了許多與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的蛋白的表達(dá)，包括RAS、MEK1/2、WNT1、β-catenin、cyclin A1、IRAK2和CIAP2[3]。此外，CPNE1下調(diào)增強(qiáng)了Saos-2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性。

2.5 CPNE1與結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌(colorectalcancer，CRC)是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一。結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素包括消化道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、大腸腺瘤、直腸息肉)、家族性腺瘤性息肉病、結(jié)直腸癌家族史、血吸蟲病、心理情緒緊張、缺乏體育活動、肥胖、亞硝胺及其化合物、吸煙、低纖維飲食[32]。雖然結(jié)直腸癌患者的新治療方法的開發(fā)取得了重大進(jìn)展，但接受根治性切除的患者的整體預(yù)后并沒有顯著改善[33]。因此，闡明潛在的病理過程以確定結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)是很重要的。采用定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化染色法檢測CRC細(xì)胞中CPNE1的表達(dá)，結(jié)果顯示CRC細(xì)胞中CPNE1的mRNA和蛋白上調(diào)。研究證明CPNE1通過激活A(yù)KT信號來促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增加線粒體呼吸，增強(qiáng)需氧糖酵解，上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和己糖激酶并下調(diào)裂解的Caspase-3的產(chǎn)量[34]。CPNE1也有助于CRC細(xì)胞的化學(xué)耐藥性。CPNE1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中被敲除會抑制腫瘤生長并增加腫瘤對奧沙利鉑的敏感性[34]。CPNE1與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的其他機(jī)制及對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響有待進(jìn)一步研究。

2.6 CPNE1與胃癌

CPNE1在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胃組織,但CPNE8在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著更為重要的作用，CPNE8高表達(dá)與胃癌的發(fā)生呈明顯正相關(guān),CPNE8低表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖[35]。

3 CPNE1在治療中的應(yīng)用

CPNE1蛋白能夠延緩冬凌草甲素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及凋亡，其延緩作用與CPNE1調(diào)控泛素化結(jié)合蛋白p62蛋白的表達(dá)有關(guān)，并該延緩作用增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞對冬凌草甲素的耐藥性。此外，研究表明淫羊藿苷能夠呈濃度和時(shí)間依賴性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖，阻滯細(xì)胞由G0/G1期向S期的發(fā)展，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲和遷移。淫羊藿苷干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞后,CPNE1蛋白顯著上調(diào), 這提示淫羊藿苷抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移, 誘導(dǎo)凋亡可能與CPNE1蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)[36]。

4 結(jié)語

CPNE1是一種高度保守的鈣依賴型磷脂結(jié)合蛋白。CPNE1在N端有一對C2結(jié)構(gòu)域,C2結(jié)構(gòu)域可能參與細(xì)胞信號和或膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,在C端有一個(gè)A結(jié)構(gòu)域,A結(jié)構(gòu)域促進(jìn)CPNE1與多種細(xì)胞內(nèi)蛋白的結(jié)合。正常組織與腫瘤組織間的差異蛋白表達(dá)存在顯著差異并會隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展而改變。在非小細(xì)胞肺癌中，CPNE1通過調(diào)節(jié)EGFR和c-MET信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。有研究證實(shí)，CPNE1可能是通過上調(diào)TRAF2的表達(dá)來促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展和進(jìn)展。此外，CPNE1通過激活A(yù)KT來促進(jìn)TNBC發(fā)生和放射抗性。CPNE1沉默能抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，此外，CPNE1下調(diào)增強(qiáng)了Saos-2細(xì)胞對順鉑和阿霉素的敏感性。CPNE1通過調(diào)節(jié)AKT-GLUT1/HK2途徑增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)糖酵解和增加耐藥性。綜上所述，CPNE1在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、三陰性乳腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有高表達(dá)，其高表達(dá)促進(jìn)以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是CPNE1作用以上腫瘤的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)仍不太明確，需要進(jìn)一步探究CPNE1 作用腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、信號通路，這為認(rèn)識腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程、發(fā)病機(jī)制，尋找高度敏感性、特異性的腫瘤標(biāo)志物及新藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，對腫瘤的預(yù)防、診斷、治療、預(yù)后評估具有極為重要的意義。有研究顯示，CPNE1可以與MEK在蛋白水平結(jié)合[4]，且我們基因檢測發(fā)現(xiàn)CPNE1基因可以與MAP2K1基因相結(jié)合。MAPK信號通路激活為一種經(jīng)典途徑促進(jìn)癌變，這使得該通路為抗癌靶向藥物設(shè)計(jì)提供了一個(gè)有吸引力的平臺。盡管在腫瘤診療方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但臨床耐藥性仍是個(gè)很大挑戰(zhàn)[37]。腫瘤標(biāo)志物的生成或在血液中的變化可提示腫瘤性質(zhì)[38]，所以研究新的靶點(diǎn)及作用機(jī)制就顯得尤為重要。因此我們猜測CPNE1可以通過MEK/ERK通路促進(jìn)腫瘤增殖。EMT賦予細(xì)胞遷移和侵襲特性，細(xì)胞間黏附喪失和上皮標(biāo)志物表達(dá)減少是其特征表現(xiàn)。那么CPNE1是否可以促進(jìn)EMT有待研究。所以我們下一步將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)去探究CPNE1是否通過MEK/ERK通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及CPNE1與EMT的關(guān)系。我們可以使用腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫和癌癥基因組圖譜(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)對CPNE1表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)染色測量各個(gè)腫瘤組織中CPNE1表達(dá)情況。通過轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒使CPNE1沉默或過表達(dá)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8評估細(xì)胞的增殖。通過transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過以上方法來進(jìn)一步探究CPNE1在腫瘤增殖和侵襲方面的作用，這為提升癌癥診療水平和提高癌癥患者生存質(zhì)量提供新思路。