吳 晗，孫奮勇

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心檢驗科，上海 200127；2.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072)

在真核細胞中，各種有膜細胞器通過磷脂雙分子層將細胞分隔成具有不同結構和功能的區(qū)室，多種生化反應在區(qū)室內(nèi)有序進行。此外，細胞內(nèi)的生物大分子可通過發(fā)生相分離形成無膜細胞器，保證了區(qū)室內(nèi)反應的高效性、獨立性、精密性。目前已發(fā)現(xiàn)的無膜細胞器包括核仁、Cajal小體、P小體、應激顆粒[1]等，在真核生物細胞內(nèi)的多種生命活動中均發(fā)揮著重要作用。相分離形成的生物分子凝聚物形同液滴，并具有液體樣的性質。

蛋白質聚集是神經(jīng)退行性疾病的主要標志，目前已在病理包涵體中發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質，如TDP-43蛋白[2]、FUS蛋白[3]、α-突觸核蛋白[4]和tau蛋白等[5]都會聚集并顯示出相分離，其異常相分離行為可能是神經(jīng)變性中蛋白質聚集的觸發(fā)因素。

相分離和癌癥進展之間也存在一定聯(lián)系，多種凝聚物已被報道在癌癥中發(fā)揮作用，如DNA修復灶、轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ、超級增強子等[6]。調節(jié)細胞中相分離動力學的治療策略，可能是治療具有異常生物分子凝聚物的神經(jīng)退行性疾病和癌癥的潛在手段。由于相分離是一個高度復雜的過程，許多類型的藥劑，如小分子、抗體和人工合成肽，可以控制相分離過程并最終有效地治療疾病。

1 相分離的概念、性質與研究歷史

在工程學、物理學、化學領域，相分離是指當二元或多元系統(tǒng)穩(wěn)定而均勻的單相狀態(tài)被打破時，不同成分之間發(fā)生相互融合、相互阻隔，分離成具有不同結構和組成的幾個相。在生物學中，相分離是溶液中互溶組分的可逆分離，產(chǎn)生兩種不斷相互交換的獨立相：稀釋相和包含其中的凝聚相[7-8]，如同油水相混，在靜置狀態(tài)下，最終分散在水面上的小油滴聚集在一起，形成大油滴浮在水面上，與水互不相溶。

相分離的凝聚物表現(xiàn)出類似液體的液滴行為，凝聚物可以相互融合，也可以發(fā)生裂變[9]。凝聚物具有選擇性，一些大分子被并入凝聚物，另一些則無法進入凝聚物，被排除在凝聚物之外。且這一過程具有可逆性，凝聚物可能會溶解為游離的大分子[8-9]。相對于固體或類固體結構中的大分子，相分離凝聚物中的大分子通常具有更快的擴散和內(nèi)部重排速度，這可以通過光漂白恢復試驗證明[9]。相分離凝聚物中的大分子與游離溶液中的大分子具有更快的交換速率。相分離的凝聚物還會經(jīng)歷“老化”，老化的凝聚物可以由液體變?yōu)楣腆w狀或凝膠狀[10-11]，且其內(nèi)部重排動力學減慢，融合能力降低[3]，有時會形成網(wǎng)絡和淀粉樣聚集體[12]。

18世紀30年代，在神經(jīng)元細胞核內(nèi)觀察到了第一個無膜區(qū)室，后來被稱為核仁[13]。從那時起，在幾乎所有真核細胞的細胞核、細胞質和細胞膜上都發(fā)現(xiàn)了許多這樣的隔室。它們可以相互融合，并且在光漂白恢復試驗中可以與周圍介質發(fā)生交換。2009年，Brangwynne等[14]在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，P小體像熔巖燈里的液滴一樣相互碰撞、聚集、融合，劇烈搖晃后會分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴。這開創(chuàng)了相分離研究的先河，為無膜細胞器如何形成并在細胞內(nèi)行使功能提供了新的思路。兩年后，他們發(fā)現(xiàn)核仁也表現(xiàn)出類似液滴的行為[15]。2012年，研究在試管中發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質分子間也可以通過弱相互作用力發(fā)生液滴樣融合，這證明了相分離可以在體外以生化反應的簡單方式重現(xiàn)[16-17]。到2015年，相分離研究熱潮興起。Patel等[3]在肌萎縮性側索硬化患者的神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)US蛋白發(fā)生異常相分離并形成蛋白質團塊，這提供了凝聚物固相化的異常相分離可能導致疾病的首批具體證據(jù)。截至目前，已有多項研究證明相分離與眾多生理過程及神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、病毒感染等的發(fā)生密切關系。

2 相分離的生理功能

相分離參與調節(jié)基因轉錄。研究提出轉錄共激活因子BRD4和MED1可以在超級增強子處發(fā)生相分離并形成液滴，將轉錄裝置聚集在超級增強子附近，實現(xiàn)轉錄過程的區(qū)室化反應，可促進基因轉錄[18]。OCT4是胚胎干細胞特異性的轉錄因子，由轉錄激活結構域和DNA結合結構域構成。OCT4可以通過轉錄激活結構域與轉錄中介體復合物亞基MED1相互作用，在胚胎干細胞超級增強子處形成相分離凝聚物，從而激活基因表達[19]。

相分離參與調節(jié)信號轉導。在腎足細胞的膜信號轉導過程中，pNephrin-Nck-N-WASP通過多價相互作用發(fā)生相分離，而相分離的程度受分子間相對濃度調節(jié)。相分離通過增加N-WASP的膜上駐留時間，顯著上調N-WASP的活性，增強其通過Arp2/3復合物促進肌動蛋白成絲的能力[20]。

相分離參與調節(jié)DNA損傷修復。53BP1蛋白是將DNA損傷信號轉導至p53及其他腫瘤抑制蛋白途徑中的一個重要傳感器，在保持基因組穩(wěn)定性和預防癌癥的發(fā)生方面起重要作用。在有53BP1蛋白參與的DNA損傷修復過程中，53BP1蛋白存在液滴樣的相分離現(xiàn)象[21]，這種相分離作用可能有助協(xié)調局部DNA損傷識別和全局基因激活。

相分離參與調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)。蛋白酶體是一種主要的蛋白水解機器，通過選擇性地降解泛素化蛋白來調節(jié)細胞中的蛋白穩(wěn)態(tài)。RAD23B，作為蛋白酶體的底物穿梭因子，是誘導泛素化蛋白和蛋白酶體相分離的關鍵分子。RAD23B具有兩個典型的泛素結合域(UBA)和一個蛋白酶體結合域(UBL)，通過UBA結構域收集細胞泛素化蛋白形成相分離液滴，然后通過UBL結構域招募蛋白酶體[22]。此外，由相分離驅動形成的無膜隔室對衰老相關疾病非常敏感，衰老及相關疾病的發(fā)生可能與細胞逐漸失去對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)也即相分離的控制有關。

相分離參與調節(jié)X染色體失活。X染色體失活是調節(jié)失活X染色體基因沉默的重要生物學過程，而基因沉默又與癌癥有著一定的聯(lián)系。引發(fā)X染色體沉默的長鏈非編碼RNA Xist是重要參與者之一，其通過多價E重復元件結合多種蛋白質，如PTBP1、MATR3、TDP-43和CELF1，然后通過自聚集和異型蛋白質-蛋白質相互作用在無活性X區(qū)室中形成相分離凝聚物[23]，其形成對強制執(zhí)行X連鎖基因沉默和錨定Xist至關重要。

3 相分離與疾病

異常相分離和凝聚物的形成與多種疾病的發(fā)生相關，如癌癥與神經(jīng)退行性疾病等。其致病原因大致分為3種[24]：凝聚物組裝的異常、相分離調節(jié)劑的異常和細胞內(nèi)物理化學條件的異常。

3.1 相分離與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病的特點是認知或運動功能逐漸喪失，如在阿爾茨海默病和額顳葉癡呆中出現(xiàn)的認知缺陷及在肌萎縮側索硬化、亨廷頓病和帕金森病中出現(xiàn)的運動缺陷。

異常相分離形成的胞質或胞核病理性蛋白的區(qū)域聚集[25]已被證明與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關。異常相分離可能會導致生物分子凝聚物喪失其動態(tài)特性，從可逆的動態(tài)相分離轉變?yōu)椴豢赡鏍顟B(tài)[3,26-29]，稱為“老化”，最終導致固態(tài)蛋白質聚集體的形成[30]。具有這種性質的相關蛋白包括TDP-43蛋白、FUS蛋白、α-突觸核蛋白和tau蛋白等，它們所形成的異常凝聚物呈纖維樣聚集在神經(jīng)退行性疾病患者的受影響神經(jīng)元中，導致神經(jīng)元功能障礙并最終導致神經(jīng)元細胞死亡。

在神經(jīng)退行性疾病中，基因突變或重復擴增、異常翻譯后修飾、亞細胞定位改變和蛋白質質量控制受損都可促進異位凝聚物的形成以及從類液體狀態(tài)向固體狀態(tài)的改變，導致病理性蛋白質聚集。以肌萎縮性側索硬化和額顳葉癡呆為例，疾病相關的RNA結合蛋白(如FUS蛋白和TDP-43蛋白)突變促進其積聚在應激顆粒的相分離凝聚物中，加速凝聚物的“老化”，進而損害神經(jīng)元核糖核蛋白顆粒的活性和功能。除了基因突變以外，異常的翻譯后修飾也與疾病的發(fā)生相關，如FUS蛋白的精氨酸甲基化過程。在正常人腦中，F(xiàn)US蛋白IDR區(qū)的精氨酸殘基發(fā)生甲基化；在額顳葉癡呆的人腦中，F(xiàn)US蛋白精氨酸甲基化的缺失促進了相分離的發(fā)生并降低了FUS蛋白凝聚物在細胞中的活力。此外，亞細胞定位的改變也可以通過影響相分離來導致疾病的發(fā)生。如FUS蛋白核定位信號的突變，降低了FUS蛋白與核輸入受體轉運蛋白的結合，導致核輸入受阻，使得FUS蛋白聚積于細胞質中，促進了其相分離及“老化”[24]。

3.2 相分離與腫瘤

相分離提供了一個理解和解釋突變?nèi)绾螌е履[瘤發(fā)生的新研究模型。在腫瘤細胞中，異?；驍U增、錯義突變、染色體易位、定位改變和/或降解不當[31]，使得細胞環(huán)境和外部信號被錯誤調節(jié)，可能導致腫瘤中的相分離處于異常激活或抑制狀態(tài)。腫瘤通常具有正常凝聚物破壞或異常凝聚物形成的特征。在某些腫瘤中，異常凝聚物與細胞轉化(如癌基因的表達)有關；在另一些腫瘤中，異常凝聚物會促進癌癥進展(如癌細胞的存活和轉移)。其他與癌癥相關的過程，如細胞代謝改變或上皮-間質轉化，也受凝聚物功能障礙的介導。

致癌突變與特定的相分離缺陷有關。如腫瘤抑制因子SPOP，作為泛素連接酶的底物接頭，可靶向各種原癌蛋白進行泛素化和蛋白酶體降解。由于SPOP的相分離需要其與底物結合，其致癌突變會破壞SPOP與底物的相互作用，從而破壞SPOP的相分離，也破壞了底物定位到相分離凝聚物中，導致細胞中SPOP底物原癌蛋白積累，促進細胞增殖[32]。轉錄失調同樣與異常相分離相關。以轉錄共激活子TAZ為例，在腫瘤細胞中，Hippo信號的失活使得TAZ通過參與超級增強子與多個關鍵輔助因子形成相分離凝聚物來促進基因轉錄，促進腫瘤的發(fā)生。相反，Hippo信號的激活會誘導TAZ中卷曲螺旋結構域的磷酸化，抑制其發(fā)生相分離[33]。染色體易位也會破壞相分離，以早幼粒細胞白血病核小體(PML NBs)為例，其表現(xiàn)出相分離特性，具有調節(jié)衰老和維持端粒的功能。而PML和RAR之間的染色體易位會破壞PML NBs相分離凝聚物的形成，導致急性早幼粒細胞白血病的發(fā)生[33]。

越來越多的研究表明，腫瘤相關蛋白的相分離參與表觀遺傳、轉錄翻譯調控、信號轉導和蛋白質降解，在腫瘤發(fā)展中具有關鍵作用。以相分離調控信號轉導為例，當免疫細胞中的T細胞受體(TCR)信號通路被激活時，下游效應蛋白自發(fā)地相分離形成動態(tài)的膜相關信號簇，使得ZAP70等激酶可以進入簇，而CD45等磷酸酶則不能。這種能力使信號簇能夠放大輸入的信號。致癌突變促進了異常TCR相關信號簇的形成，從而激活致癌下游信號[34]。

基于相分離在腫瘤病理生理過程中的作用，目前已有一些通過調控相分離而靶向治療腫瘤的策略和方向，如調節(jié)相分離核心蛋白的濃度和翻譯后修飾調控[35-36]；干擾相分離相關的結合分子，包括RNA和分子伴侶[19,37-38]；控制相分離的環(huán)境條件[39-41]；干擾相分離所需的外部介質，如膜表面等[42-43]。

4 相分離與藥物研發(fā)

對于腫瘤的靶向治療，傳統(tǒng)的靶標大部分是具有明確活性位點的蛋白，并主要通過使用小分子占據(jù)驅動的藥理學作用模式來控制蛋白功能。然而，有許多腫瘤的靶標，例如K-RAS、MYC和p53蛋白等，由于缺乏可被小分子靶向的蛋白質口袋，被認為是不可成藥的[44]。鑒于已有研究發(fā)現(xiàn)一些不可成藥的靶點受到相分離的調控，針對廣闊的不可成藥的相分離靶點設計藥物，有望成為治療相關疾病的新型策略。

由于相分離生物過程的高度復雜性，調節(jié)相分離過程進而治療疾病的分子種類也很多樣，包括小分子、抗體和人工合成肽等，可以通過靶向無序區(qū)、結構域或調節(jié)變構等途徑來調節(jié)相分離。Girdhar等[45]發(fā)現(xiàn)，小分子吖啶衍生物AIM4具有很強的抗TDP-43聚集作用，并進一步證明AIM4與TDP-43無序區(qū)的殘基結合以抑制其相分離。Zhu等[46]在SHP2突變體異常相分離現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)SHP2變構抑制劑ET070，可將SHP2突變體鎖定在特定構象以抑制其相分離。Wang等[47]通過對SAS-CoV-2病毒核衣殼蛋白的二聚化結構域進行研究，設計出了一種特異靶向二聚化結構域的干擾肽以破壞其相分離，進而抑制病毒復制，恢復先天免疫。研究發(fā)現(xiàn)5種小分子化療藥物表現(xiàn)出選擇性分配入凝聚物的性質，且可能可以用芳香環(huán)結構解釋這種行為，這提供了相分離動力學角度的新治療策略，為分子設計定制藥物進入特定凝聚體提供了新的可能性[48]。

此外，新技術亦不斷涌現(xiàn)。超分辨率顯微鏡(super-resolution microscopy,SRM)的出現(xiàn)為生物大分子凝聚物的表征提供了接近單分子的分辨率，并可用以直接定量成像。以BIN1為例，它是遲發(fā)性阿爾茨海默病的風險因素，De Rossi等[49]應用SRM發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元中BIN1在突觸前的位點和重要調節(jié)作用，及其缺失所導致的空間記憶鞏固受損。有研究在體外建立了生物大分子的互作檢測及高通量篩選互作調控物(phase-separated condensate-aided enrichment of biomolecular interactions in test tubes,CEBIT)的技術體系，其可用于觀察化合物對蛋白質相互作用的影響[50]。

總的來說，相分離相關藥物的設計和開發(fā)還處于起步階段，而基于相分離蛋白結構的藥物設計以及高通量篩選是相分離調節(jié)劑開發(fā)的可能途徑。

5 總結與展望

相分離液滴具有隨時間而發(fā)生“老化”的特點，并與疾病的發(fā)生相關。多價相互作用是決定相分離發(fā)生的必要條件，具有模塊化結構域和/或內(nèi)在無序區(qū)的蛋白質，可以通過多價相互作用的機制發(fā)生相分離。此外，凝聚物的形成與解離還受到環(huán)境因素的影響，如酸堿度、溫度、ATP含量都可能影響相分離的發(fā)生。

異常相分離與疾病發(fā)生有著密切的聯(lián)系。神經(jīng)退行性疾病的特點是形成纖維狀不溶性蛋白聚集體，其致病機制與治療手段目前尚不明朗，相分離提供了闡釋和治療神經(jīng)變性的新思路；腫瘤相關蛋白的相分離涉及表觀遺傳、轉錄翻譯、信號轉導和蛋白質定位與降解等多個生理過程的異常?？筛鶕?jù)發(fā)生相分離的腫瘤相關蛋白致病機制進行藥物研發(fā)。通過靶向無序區(qū)或結構域、調節(jié)變構等策略來設計抗體、小分子化合物及合成肽是藥物研發(fā)的潛在策略。

隨著相分離領域的萌生、發(fā)展和推進，越來越多的生物學功能和疾病發(fā)病機制都可以用相分離進行解釋和闡明，為靶向治療和藥物研發(fā)提供了新的角度和無限的空間，而在相分離研究如火如荼的當下，也需要一些理性的思考。例如，相分離與生命過程的本質聯(lián)系不明確，一些研究尚不能明確區(qū)分相分離與生命過程的因果關系，而只是簡單證明其相關性；相分離的鑒定手段不完善，不能區(qū)分相分離和其他生命機制之間的區(qū)別，而只是現(xiàn)象性的描述；相分離的體外特性與細胞內(nèi)性質的差別限制了研究成果的普適性等。相分離研究在生命過程、病理過程、藥物研發(fā)領域仍有著很大的發(fā)展空間。