崔偉波 徐張凱 王錦浩 陳程昊 周玉林 程東慶

急性胃腸炎是全球公共衛(wèi)生問題之一，其臨床表現(xiàn)主要為腹瀉和嘔吐，影響各個年齡段人群，在兒童中尤為嚴(yán)重［1-2］。嬰幼兒腹瀉病因復(fù)雜，臨床常見相關(guān)病原主要為沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌等細(xì)菌［3-4］，及輪狀病毒（rotavirus，RoV）、諾如病毒（norovirus，NoV），腸道腺病毒（adenovirus，AdV）和甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）等病毒［5］。病原性急性胃腸炎的傳播和暴發(fā)極大威脅社會公共衛(wèi)生安全，影響社會穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 選取2020至2021年冬春季臺州市仙居縣人民醫(yī)院5歲以下急性胃腸炎患兒糞便樣本78例，收集到的樣本部分做常規(guī)檢查，部分與醫(yī)用甘油1∶1混合后于-70℃保存?zhèn)溆?。? h內(nèi)直接留取樣本為準(zhǔn)入原則，排除與尿不濕、紙巾及地面等接觸后留取的樣本；同時以靜脈采血法盡可能留取患者血常規(guī)樣本，1 h內(nèi)完成檢測。

1.2 細(xì)菌病原學(xué)檢查 所有樣本開展沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌檢測，方法如下：取糞便樣本分區(qū)劃線接種于血平板、SS平板、4號平板等相應(yīng)培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃下培養(yǎng)24 h，取純培養(yǎng)物做革蘭染色和氧化酶等實驗，并采用VITEK2 Compact微生物鑒定儀（梅里埃股份有限公司）VITEK2，用GN卡鑒定病原菌。

1.3 病毒病原學(xué)檢查 （1）病毒核酸提取：取100 μL糞便樣本置于1.5 mL EP管，加入無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成10%糞便懸液，旋渦振蕩2 min或樣本成均一狀態(tài)，將10%糞便懸液于3,000 rpm離心10 min，小心吸取200 μL上清液用于后續(xù)病毒核酸提取。病毒核酸提取按照柱式病毒抽提純化試劑盒說明書（上海生工生物）操作，病毒核酸提取后于-80℃保存，以備后續(xù)檢測。（2）急性胃腸炎病毒的檢測用多重PCR對樣本中RoV、NoV GI型、NoV GII型、AdV和HAV進(jìn)行檢測，NoV GI型、NoV GII型、RoV和AdV引物、探針序列參考HAMZA等［6］人研究，HAV引物、探針序列參考COSTAFREDA等［7］人研究，引物和探針均由上海生工生物公司合成，見表1。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考One Step PrimescriptTM RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）說明書并做修改。反應(yīng)體系如下：2×One Step RNA PCR buffer 12.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，上下游引物各0.6 μL（20 μM），病毒探針各0.3 μL（20 μM），核酸模板5 μL，用無RNA酶水補(bǔ)總體積至25 μL。NoV GI型、NoV GII型和HAV反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，55℃退火延伸35 s，共40個循環(huán)。RoV和AdV反應(yīng)條件：42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性2 min；95℃變性5 s，60℃退火延伸35 s，共40個循環(huán)。

表1 多重RT-qPCR檢測5種急性胃腸炎病毒引物探針序列

1.4 樣本常規(guī)檢查 （1）糞常規(guī)檢查：采集后的糞便樣本采用KF-F10糞便常規(guī)自動分析儀（珠?？朴蛏锛夹g(shù)有限公司）進(jìn)行檢測，所有操作均按照儀器說明書進(jìn)行。（2）血常規(guī)及HS-CRP檢查：血常規(guī)樣本采用邁瑞B(yǎng)C5180血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)及HS-CRP聯(lián)合分析。所有操作均按照儀器說明書進(jìn)行，質(zhì)控品選擇原廠配發(fā)樣品。

1.5 病例分組情況 將患兒分為不同月齡組與糞便病毒學(xué)檢出情況進(jìn)行比較分析；并根據(jù)病例細(xì)菌與病毒檢出情況分為病毒感染腹瀉組（n=24）與非細(xì)菌非病毒感染組（n=54）與糞常規(guī)中的隱血、鏡下白細(xì)胞檢出（＞3個/每視野）情況和血常規(guī)中的白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、HS-CRP值做差異性分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉患者及樣本基本情況 共收集到78例符合標(biāo)準(zhǔn)糞便樣本，其中水樣便1例，糊狀便66例，軟便1例，稀便10例，主要以糊狀便為主。男患兒43例，女患兒35例，男女比為1.23/1。其中，患兒年齡最大為5歲，最小為1個月。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 通過臨床細(xì)菌學(xué)檢查，未檢出沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌等腹瀉相關(guān)病原菌。

2.3 病毒學(xué)檢測結(jié)果 在78份大便樣本中檢出感染病毒樣本24例，總陽性率為30.77%。其中檢出AdV樣本13例，檢出率最高，為16.67%，24月齡以下病例占84.63%，在不同月齡段AdV檢出結(jié)果不存在統(tǒng)計學(xué)差異，見表2；其次檢出RoV樣本11例，檢出率為14.10%，24月齡以下病例占63.64%，在不同月齡段RoV檢出結(jié)果不存在統(tǒng)計學(xué)差異，見表2；NoV檢出率為6.41%，5例均為GII型，未檢出NoV GI型、HAV感染。同時檢出2種病毒樣本5例，其中1例為NoV GII型和RoV，3例為RoV和AdV，1例為NoV GII型和AdV。

表2 不同月齡組急性胃腸炎患兒糞便樣本病毒檢測結(jié)果（n）

2.4 糞便常規(guī)檢查結(jié)果分析 在78例樣本中共檢出糞便隱血陽性27例，陽性率為34.61%，高倍鏡（40×10）下檢出白細(xì)胞陽性（＞3個/每視野）28例，檢出率為35.90%，根據(jù)病原學(xué)檢測結(jié)果分為病毒感染腹瀉組和非細(xì)菌非病毒腹瀉組，比較兩組間糞便隱血實驗和白細(xì)胞鏡檢結(jié)果，發(fā)現(xiàn)病毒感染腹瀉組患兒鏡檢白細(xì)胞情況顯著低于非細(xì)菌非病毒腹瀉組患兒，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），隱血實驗未見統(tǒng)計學(xué)差異，見表3、表4。

表3 病毒感染腹瀉與非細(xì)菌非病毒腹瀉患兒隱血陽性率比較

表4 病毒感染腹瀉與非細(xì)菌非病毒腹瀉患兒糞便鏡檢白細(xì)胞情況比較

2.5 血常規(guī)檢查結(jié)果分析 78例患者中有40例進(jìn)行血常規(guī)分析，根據(jù)病原學(xué)檢測結(jié)果分為病毒感染腹瀉組16例和非細(xì)菌非病毒腹瀉組24例，比較兩組之間白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、HS-CRP水平，發(fā)現(xiàn)均不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05），見表5。

表5 病毒感染腹瀉與非細(xì)菌非病毒腹瀉患兒血常規(guī)部分指標(biāo)比較（）

表5 病毒感染腹瀉與非細(xì)菌非病毒腹瀉患兒血常規(guī)部分指標(biāo)比較（）

組別 總例數(shù) WBC（×109） LYN（%） HS-CRP（mg/L）病毒感染腹瀉組 16 10.73±3.97 34.88±16.40 20.61±27.00非細(xì)菌非病毒腹瀉組 24 11.47±4.38 32.08±19.21 10.47±13.50 t值 0.536 0.523 1.297 P值 0.595 0.604 0.202

3 討論

急性腹瀉被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為全球嬰幼兒死亡的第二大原因，而多數(shù)急性胃腸炎患者都會出現(xiàn)腹瀉的癥狀［1］。在本研究收集到的78例糞便樣本中，未檢出沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌等急性胃腸炎相關(guān)病原菌；其中共24例樣本檢出NoV GII、RoV、AdV等急性胃腸炎相關(guān)病毒，這表明在2020年至2021年冬春季，仙居縣醫(yī)院5歲以下嬰幼兒急性胃腸炎主要由病毒引起。

基于患兒糞便樣本急性胃腸炎病毒檢測結(jié)果，分為病毒感染腹瀉組和非細(xì)菌非病毒腹瀉組，比較分析患兒糞常規(guī)隱血實驗和白細(xì)胞鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染腹瀉組和非細(xì)菌非病毒腹瀉組鏡檢白細(xì)胞陽性率分別為5.13%和30.77%，在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異（P＜0.05），糞便白細(xì)胞鏡檢對病毒性急性胃腸炎的診斷起到指導(dǎo)作用；病毒感染腹瀉組與非細(xì)菌非病毒腹瀉組隱血陽性率分別為10.26%和24.36%，無統(tǒng)計學(xué)差異。由此推斷病毒感染腹瀉所引起的腸道炎癥反應(yīng)不明顯，而非細(xì)菌非病毒腹瀉具有較大的胃腸道炎癥反應(yīng)。

白細(xì)胞和HS-CRP一直是臨床上重要的炎癥指標(biāo)，但在本研究中兩組數(shù)據(jù)均無統(tǒng)計學(xué)差異。就淋巴細(xì)胞百分比而言，可能與嬰幼兒患者個體因素相關(guān)，嬰幼兒時期淋巴細(xì)胞百分比本身相對較高，或因腹瀉引起脫水無法及時調(diào)節(jié)，使非細(xì)菌非病毒腹瀉組患兒淋巴細(xì)胞百分比升高；而HS-CRP就數(shù)值而言，兩者存在不小差異，但在統(tǒng)計學(xué)分析上無顯著差異，可能與整體的樣本數(shù)量偏少有關(guān)，有待收集更多樣本進(jìn)行分析。

在78例糞便樣本中，24例樣本至少檢出一種病毒，總陽性率為30.77%，與彭華等［8］報道的病毒性腹瀉監(jiān)測的陽性率32.29%較為接近。在本次研究中，RoV、NoV和AdV是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體，與邵偉芳等［9］研究結(jié)果相近。在本次研究，不同年齡段之間病毒的檢出率沒有顯著差異，這可能與本研究中收集到樣本數(shù)較少有關(guān)。不過，檢出病毒陽性的患者主要分布主要集中在6~24月齡之間，與任海燕等［10］、吳坤等［11］研究結(jié)果相近。這可能也是急性胃腸炎在發(fā)展中國家能夠引起重大醫(yī)療壓力和疾病負(fù)擔(dān)的原因之一。相對于上述三種病毒，NoV GI型和HAV感染人群中發(fā)病率較低［12-13］，在本次研究中也未檢出NoV GI型和HAV的感染。

在我國病毒性急性胃腸炎的防控形勢較為復(fù)雜，NoV、RoV、AdV等常見的胃腸炎病毒不斷有零散病例發(fā)生乃至暴發(fā)疫情，扎如病毒、星狀病毒等病毒也逐漸流行起來。基于此，我國應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)病原性急性胃腸炎監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)平臺的構(gòu)建，更好監(jiān)測病原性急性胃腸炎的流行情況，為疫苗研發(fā)等預(yù)防控制措施提供有效的數(shù)據(jù)支持。