呂望 王勝男 潘克躍 朱鵬 姜盈盈 葉淵文

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺，以持續(xù)性氣流受限為特征。隨著病情惡化，COPD可發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD），表現(xiàn)為呼吸困難加重、咳嗽加劇、痰量增多，此時(shí)患者需要改變用藥方案并增加治療措施［1］。COPD患者每年約發(fā)生0.5~3.5次急性加重，是COPD患者死亡的重要因素［2］。有研究顯示，AECOPD患者存在外周血淋巴細(xì)胞功能紊亂，NK細(xì)胞也參與炎癥反應(yīng)［3］。CD8+淋巴細(xì)胞和活化的NK細(xì)胞在吸煙的COPD患者中比例明顯增高［4-5］，但是NK細(xì)胞在COPD的病理過(guò)程中的作用仍不清晰［6］。本研究分析AECOPD患者外周血中NK細(xì)胞激活受體基因（NKG2D）和抑制受體基因（NKG2A）的表達(dá)，探討NK細(xì)胞活化狀態(tài)的臨床相關(guān)性，以期為病情的研判提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 外周血標(biāo)本收集于本院2020年1月至2021年12月急診住院患者，研究病例符合《AECOPD診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2017年更新版）》［2］診斷標(biāo)準(zhǔn)，AECOPD患者30例，中位年齡57歲，其中男18例，女12例。COPD患者30例，中位年齡55歲，其中男17例，女13例。選擇健康志愿者20人，中位年齡54歲，其中男12例，女8例。本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書(shū)。RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購(gòu)于上海翌圣公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)BioRad公司。

1.2 檢測(cè)方法 （1）單個(gè)核細(xì)胞中NKG2D和NKG2A基因mRNA的表達(dá)量檢測(cè)：淋巴細(xì)胞分離液收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS清洗后加入TRizol試劑和三氯甲烷，高速離心后取上清液；加入同體積異丙醇高速離心后去上清液，加入無(wú)水乙醇清洗，自然晾干；加入RNase水溶解，測(cè)定RNA濃度和純度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，各組加入相同含量的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；按照SYBR Green試劑說(shuō)明書(shū)，熒光定量PCR擴(kuò)增NKG2D和NKG2A基因，用2-△△Ct計(jì)算各基因的相對(duì)定量表達(dá)水平。擴(kuò)增引物序列如下：β-actin-F：5'-GCATCCTCACCCTGAAGTA-3'，β-actin-R ：5'-GAGGTAGTCAGTCAGGTCC-3'，NKG2D-F ：5'-TTGATGGGGTGGATTCGTGG-'3，NKG2D-R：5'-TGCTTTTGCCATCGTGTTGA-3'，NKG2A-F ：5'-AGAAAGCACGTCATTGTGGC-3'，NKG2A-R：5'-GCCAGCAAACTCTCTTCCCA-3'。（2）肺功能檢測(cè)：所有患者入院后均檢測(cè)第1秒用力呼氣容積（FEV1）、第1秒用力肺活量占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、用力肺活量（FVC）和第1秒用力呼氣容積/用力肺活量比值（FEV1/FVC）肺功能指標(biāo)，患者檢查前避免劇烈運(yùn)動(dòng)。（3）動(dòng)脈血?dú)夥治觯夯颊呷朐褐委熐?，于橈?dòng)脈或股動(dòng)脈處抽取2 mL動(dòng)脈血，肝素抗凝，應(yīng)用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x分別檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism9統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血NKG2D基因和NKG2A基因的表達(dá)水平比較 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AECOPD組中NKG2D基因表達(dá)水平高于對(duì)照組和COPD組，COPD組中的表達(dá)水平也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AECOPD組和COPD組中NKG2A基因的表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AECOPD組中NKG2A基因的表達(dá)水平低于COPD組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組外周血NKG2D基因和NKG2A基因的表達(dá)水平比較（）

表1 三組外周血NKG2D基因和NKG2A基因的表達(dá)水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，與AECOPD組比較，#P＜0.05

組別 n NKG2D基因 NKG2A基因COPD 組 30 0.92±0.31*# 1.05±0.47*AECOPD 組 30 1.30±0.63* 0.90±0.30*對(duì)照組 20 0.65±0.29 1.55±0.70

2.2 兩組患者肺功能和動(dòng)脈血?dú)獾谋容^ 對(duì)兩組患者的肺功能和動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，AECOPD組中的FEV1%、FEV1/FVC和PaO2明顯低于COPD組（P＜0.001），而PaCO2高于COPD組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者肺功能和動(dòng)脈血?dú)獾谋容^（）

表2 兩組患者肺功能和動(dòng)脈血?dú)獾谋容^（）

組別 n FEV1% FEV1/FVC PaO2（mmHg） PaCO2（mmHg）COPD 組 30 50.14±3.23 52.37±3.31 56.75±2.18 59.34±1.25 AECOPD 組 30 38.87±2.79 41.62±2.84 52.15±1.33 60.24±1.79 t值 14.21 13.28 9.73 2.21 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.031

2.3 NKG2D和NKG2A基因的表達(dá)與肺功能的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，COPD和AECOPD組患者外周血NKG2D基因的表達(dá)水平與FEV1%和FEV1/FVC均呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；NKG2A基因的表達(dá)水平與FEV1%和FEV1/FVC均呈明顯正相關(guān)（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 COPD和AECOPD患者外周血中NKG2D和NKG2A基因與肺功能的相關(guān)性分析

2.4 NKG2D和NKG2A基因的表達(dá)與動(dòng)脈血?dú)獾南嚓P(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，COPD和AECOPD組患者外周血NKG2D基因的表達(dá)水平與PaO2均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），NKG2A基因的表達(dá)水平與PaO2均呈正相關(guān)，但是與PaCO2均不具有相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 COPD和AECOPD患者外周血中NKG2D和NKG2A基因與動(dòng)脈血?dú)獾南嚓P(guān)性分析

3 討論

COPD是一種常見(jiàn)的慢性氣道疾病，發(fā)病率很高。AECOPD是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，可能導(dǎo)致病情惡化，肺功能顯著降低，部分原因是氣道和全身炎癥增加［7］。AECOPD患者常出現(xiàn)呼吸急促、咳嗽加劇、黏液分泌過(guò)多等急性惡化癥狀。AECOPD的誘因，可能是細(xì)菌或病毒感染，或吸入環(huán)境顆粒物引起氣道黏膜水腫、平滑肌痙攣和分泌物增加所致［8］。

NK細(xì)胞的功能是由激活受體和抑制受體緊密控制的。在激活受體中，NKG2D（Klrk1）幾乎在所有的NK細(xì)胞上表達(dá)，可識(shí)別應(yīng)激和感染相關(guān)配體，并能克服抑制信號(hào)，激發(fā)細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子的釋放［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，病毒和細(xì)菌感染、慢性炎癥和香煙煙霧暴露均可誘導(dǎo)受損上皮細(xì)胞迅速表達(dá)NKG2D配體，作為NKG2D配體調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素［11］。在本研究中，COPD組和AECOPD組中NKG2D表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，AECOPD組表達(dá)水平高于COPD組，提示NKG2D表達(dá)與COPD疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，抑制受體NKG2A基因的表達(dá)在COPD和AECOPD組中均表達(dá)下調(diào)，而且AECOPD組低于COPD組。有文獻(xiàn)報(bào)道COPD組的NKG2A+細(xì)胞比例低于對(duì)照組，但是與疾病的嚴(yán)重程度、吸煙情況和加重頻率無(wú)相關(guān)性［12］。也有文獻(xiàn)報(bào)道NK細(xì)胞抑制受體CD158a+和CD158b+在吸煙和COPD加重患者中表達(dá)下調(diào)，而且CD158b+NK細(xì)胞比例與FEV1%和FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)性［13］。但是本研究結(jié)果顯示NKG2A基因的表達(dá)水平與FEV1%、FEV1/FVC和PaO2均呈正相關(guān)。FREEMAN等［14］的研究結(jié)果顯示，COPD患者肺上皮細(xì)胞中NKG2D配體MICA和MICB的表達(dá)上調(diào)，并且與FEV1%呈負(fù)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示NKG2D基因的表達(dá)水平與FEV1%、FEV1/FVC和PaO2均呈明顯負(fù)相關(guān)，提示NKG2D基因的表達(dá)與患者肺功能下降有關(guān)。楊東升等［3］研究表明COPD急性加重期患者存在明顯的淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，患者呼吸衰竭時(shí)CD3-CD56+NK細(xì)胞比例升高，并且參與了COPD的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

作為天然免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞被認(rèn)為是人體抵抗感染和腫瘤的第一道防線。盡管現(xiàn)有研究表明NK細(xì)胞可能在COPD及其惡化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但在NK細(xì)胞數(shù)量、激活和抑制受體表達(dá)、細(xì)胞功能等方面的報(bào)道仍存在差異，這可能與不同疾病進(jìn)展階段有關(guān)［15］。本研究結(jié)果提示NK細(xì)胞激活受體NKG2D基因的表達(dá)與COPD疾病進(jìn)展以及患者肺功能相關(guān)，可能是活化的NK細(xì)胞參與了肺部組織損傷的病理過(guò)程。盡管到目前為止，NK細(xì)胞在AECOPD中的作用仍然沒(méi)有得到充分認(rèn)識(shí)，深入研究有望更好理解與感染相關(guān)的急性加重和疾病惡化的免疫機(jī)制，以期為COPD和AECOPD的臨床治療提供新的思路。