劉瑞杰 王鑫霞 王露 趙梓堯 余馳昊 袁舒穎 陳妍雯 張紹興 楊雪靜 孫桂芹

化膿性中耳炎（suppurative otitis media，SOM）是一種臨床常見(jiàn)的中耳疾病，兒童發(fā)病率較高［1-2］，可導(dǎo)致聽(tīng)力下降、耳痛以及流膿等臨床癥狀［3-4］，若不能及時(shí)接受有效的治療，會(huì)加重病情甚至可能威脅患者生命健康。引發(fā)SOM的主要因素是病原微生物感染［5-6］。隨著抗生素的廣泛使用，SOM患者分離到的病原菌對(duì)抗生素耐藥性增強(qiáng)，給臨床診療帶來(lái)較大困擾［7-8］。目前，臨床主要采用分離培養(yǎng)法檢測(cè)SOM患者的病原菌，但該方法不能檢出難培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，而16S rDNA宏基因組技術(shù)能夠?qū)颖局形⒘?、難培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)［9］。該研究將16S rDNA宏基因組測(cè)序與分離培養(yǎng)相結(jié)合，對(duì)SOM患者耳道分泌物進(jìn)行病原菌菌群結(jié)構(gòu)、豐度分析，以提高SOM的診斷效率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年3月至2019年9月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的SOM患者耳道分泌物21例，另收集40例無(wú)耳道疾病健康大學(xué)生的耳道分泌物作為對(duì)照組。

1.2 儀器及試劑 儀器：生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、生物安全柜（NU-425-400S，美國(guó)Nuaire公司）、全自動(dòng)微生物鑒定儀（VITEK-2 COMPACT，法國(guó)生物梅里埃公司）及其配套的細(xì)菌鑒定卡（批號(hào)190213）等。試劑：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培養(yǎng)基（批號(hào)181212）、血瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)190601），青霉素、頭孢呋辛等藥敏紙片（批號(hào)190523），均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑公司。

1.3 樣本采集 參考《臨床檢驗(yàn)標(biāo)本采集手冊(cè)》（2011年）。由臨床醫(yī)護(hù)人員在額鏡照明下，用75%乙醇清潔外耳道皮膚，再用經(jīng)0.9%NaCl溶液濕潤(rùn)的無(wú)菌棉拭子在SOM患者患側(cè)外耳道深部或鼓室內(nèi)采集分泌物，置于無(wú)菌試管中。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定 將樣本接種于血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h~48 h，挑選單菌落制備0.50~0.63麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，采用梅里埃VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀及其配套試劑進(jìn)行菌種鑒定。

1.5 16S rDNA宏基因組測(cè)序分析 利用16S rDNA宏基因組技術(shù)，對(duì)耳道分泌物中可培養(yǎng)、難培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。按照樣本DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等步驟分析樣本菌群，由杭州聯(lián)川生物股份有限公司完成。

1.6 藥物敏感試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法，對(duì)SOM患者耳道分泌物分離的細(xì)菌進(jìn)行藥敏分析。將分離的病原菌制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，均勻涂布于MH平板，將藥敏紙片貼在平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h~24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。結(jié)果判定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（2018）標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 SOM患者和健康人耳道分泌物分離培養(yǎng)結(jié)果 21例SOM患者耳道分泌物，10例培養(yǎng)出病原菌，檢出率為47.6%，共分離得到病原菌16株，其中革蘭陽(yáng)性菌14株（87.5%），主要為金黃色葡萄球菌，革蘭陰性菌1株（6.25%），真菌1株（6.25%）。40例健康人耳道分泌物分離得到77株菌，前3種為頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌。SOM患者和健康人耳道微生物分布有較大差異。見(jiàn)表1。

表1 SOM患者和健康人耳道分泌物病原菌分布［n（%）］

2.2 16S rDNA宏基因組測(cè)序結(jié)果 21例SOM患者耳道分泌物（其中有4例樣本未達(dá)到測(cè)序要求）和2例健康人耳道分泌物的16S rDNA宏基因組分析結(jié)果，見(jiàn)圖1和表2。SOM002、SOM008、SOM010等9例樣本分離培養(yǎng)與16S rDNA測(cè)序均檢出為葡萄球菌；SOM009、SOM016等8例樣本未培養(yǎng)出病原菌，而16S rDNA測(cè)序檢出葡萄球菌和伯克霍爾德菌等。另外，SOM011、SOM019樣本中檢測(cè)到韋榮球菌、普雷沃菌等厭氧菌。16S rDNA測(cè)序與分離培養(yǎng)結(jié)果基本一致，但其微生物的種類和豐度存在一定差異。

圖1 SOM患者（17例）和健康人（2例）耳道分泌物細(xì)菌豐度和物種分布圖

表2 分離培養(yǎng)與16S rDNA測(cè)序結(jié)果比較

2.3 藥物敏感性 SOM患者分離的金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢呋辛、頭孢吡肟、苯唑西林等多種臨床常用抗生素呈現(xiàn)較高的敏感率（＞75.0%），對(duì)青霉素的耐藥率為100%，其中有1株金黃色葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥。SOM患者分離的耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌和健康人分離的頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物敏感性較高，見(jiàn)表3和表4。

表3 SOM患者耳道分泌物主要革蘭陽(yáng)性菌的藥物敏感性結(jié)果［n（%）］

表4 健康人耳道分泌物主要革蘭陽(yáng)性菌的藥物敏感性結(jié)果［n（%）］

2.4 青霉素耐藥株的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果 SOM患者分離的葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥率較高，采用頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè)耐藥株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況，金黃色葡萄球菌青霉素耐藥株的β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性率為50.0%，里昂葡萄球菌、緩慢葡萄球菌均為陰性，見(jiàn)表5。

表5 頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶

3 討論

病原菌感染是引發(fā)SOM的重要因素，可導(dǎo)致患者中耳黏膜化膿病變［10］。研究表明，不同地區(qū)SOM患者的病原菌類別及其耐藥性存在差異［11］。熊素芳等［12］在508例SOM患者耳分泌物中分離到金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等病原菌。UDDéN等［13］在184例SOM患者耳分泌物中分離到變形桿菌、銅綠假單胞菌及腸球菌等。由于抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，致使病原菌對(duì)抗生素的耐藥性增加，給SOM治療帶來(lái)較大困擾［14］。

該研究通過(guò)分離培養(yǎng)方法分析SOM患者耳道分泌物的病原菌種類，其中革蘭陽(yáng)性菌檢出率高于革蘭陰性菌。SOM患者以金黃色葡萄球菌為主，健康人以頭葡萄球菌為主，兩組均分離到耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌，提示其為耳道正常定植菌，但在一定條件下可能成為致病菌。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法是經(jīng)典方法，但對(duì)不易培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物難以檢出，可通過(guò)16S rDNA宏基因組技術(shù)提高樣本的檢出效率［15］，該研究52.9%樣本兩種方法均檢出葡萄球菌，與相關(guān)研究結(jié)果一致［9］。另外，部分樣本培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但是16S rDNA測(cè)序?yàn)殛?yáng)性，考慮是因?yàn)榭裂蹙騾捬蹙炔灰着囵B(yǎng)的微生物、患者經(jīng)過(guò)抗生素治療或樣本采集和送檢過(guò)程中細(xì)菌死亡導(dǎo)致，因此可采用16S rDNA宏基因組技術(shù)彌補(bǔ)分離培養(yǎng)方法的缺陷，豐富SOM病原譜，或者通過(guò)調(diào)整難培養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)條件即培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高陽(yáng)性檢出率。16S rDNA宏基因組技術(shù)具有廣泛的臨床應(yīng)用前景［16］，但易造成假陽(yáng)性，檢測(cè)過(guò)程中要嚴(yán)格避免雜菌污染。

該研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，SOM患者分離的金黃色葡萄球菌對(duì)臨床常用的頭孢菌素類和氨基糖苷類藥物的敏感率＞75.0%，對(duì)青霉素耐藥率為100%，耐藥菌株的β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性率為50.0%，可能由其他耐藥機(jī)制介導(dǎo)，如青霉素結(jié)合蛋白異構(gòu)體（PBP2′）［17］。雖然金黃色葡萄球菌藥物敏感率較高，未檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株，但檢出1株萬(wàn)古霉素耐藥，應(yīng)關(guān)注其耐藥性。

綜上所述，臨床應(yīng)積極開(kāi)展對(duì)SOM的病原菌檢測(cè)及藥敏分析，并依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合理用藥，提高治療效果，可減緩細(xì)菌耐藥的發(fā)生。