耿俊紅 凌云 張青 王寶輝 侯群 蔣艷

癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重組，因此尋找一種能阻止癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的治療手段阻止癲癇的進(jìn)一步形成或癥狀的惡化，具有重要意義。β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHB）是生酮飲食（ketogenic diet，KD）的主要代謝產(chǎn)物，具有抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，BHB能夠通過(guò)抑制活性氧簇和神經(jīng)元凋亡對(duì)腦部相關(guān)疾病起作用，但是否對(duì)SE所致的海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，尚未完全清晰。本研究采用體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，通過(guò)無(wú)鎂灌流構(gòu)建SE模型，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞死亡，采用流式儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），以期為BHB的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 出生24 h內(nèi)的SPF級(jí)新生SD大鼠90只，雌雄不限，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK（滬）2012-0002】提供，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。β- 羥丁酸（BHB）、MgCl2、NaCl、KCl、HEPES、CaCl2、葡萄糖、甘氨酸、多聚L賴氨酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Neurobasal培養(yǎng)基、B27、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基、谷氨酰胺（Gln）、0.25%胰酶＆0.02%EDTA購(gòu)于浙江森瑞科技有限公司。ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PE Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)方法［1］將新生大鼠采用75%酒精清洗后，置于消毒的冰板上。斷頸取大腦，分離海馬組織，置入事先準(zhǔn)備的DMEM/F12+胰酶=1∶1溶液中用槍頭充分吹打至無(wú)明顯團(tuán)塊，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，消化20 min后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，1,000rpm/min離心后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸并過(guò)200目篩，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，差速貼壁1.5 h，收獲貼壁速度慢的神經(jīng)元，以2.5×104個(gè)/cm2的密度種植于事先用0.1 mg/mL多聚L賴氨酸包被的24孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后全量換液，更換為Neurobasal+2% B27+1% Gln培養(yǎng)基，以后每周2~3次半量換液。隔天在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況。海馬神經(jīng)元的鑒定按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 無(wú)鎂灌流離體癲癇模型及分組 無(wú)鎂灌流造模方法［2］：神經(jīng)元維持培養(yǎng)2周后，將維持培養(yǎng)基更換為含不同濃度BHB，但不含1 mmol/L MgCl2的生理記錄溶液（physiological recording solution，pBRS），由145 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L葡萄糖和0.002 mmol/L甘氨酸組成，pH 7.3，用蔗糖將滲透壓調(diào)節(jié)至（290±10）mOsm。在不含MgCl2（無(wú)Mg2+）的情況下將培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露于pBRS會(huì)誘導(dǎo)高頻癲癇樣爆發(fā)（SE）。實(shí)驗(yàn)總共分5組，包括對(duì)照組（含有1 mmol/L MgCl2的pBRS）、無(wú)Mg2+處理組（不添加MgCl2的pBRS處理），無(wú)Mg2+處理+BHB 2 mmol/L組，無(wú)Mg2+處理+BHB 4 mmol/L組，無(wú)Mg2+處理+BHB 8 mmol/L組。持續(xù)6 h后，將含有1 mmol/L MgCl2的pBRS添加回培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法測(cè)定神經(jīng)元活性 所有組別培養(yǎng)細(xì)胞均予以MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。將差速貼壁后取得原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為2×105/cm3，種植于96孔板，每孔100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔。維持培養(yǎng)14 d，分別給予無(wú)Mg2+和不同濃度BHB處理6 h后，給予含有1 mmol/L MgCl2的pBRS維持培養(yǎng)4 h，各孔加入2 mg/mL MTT 50 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩至藍(lán)色顆粒全部溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。目標(biāo)組細(xì)胞活力（%）=目標(biāo)值OD值/正常對(duì)照組OD值×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡及ROS測(cè)定 原代大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞維持培養(yǎng)14 d后，分別給予無(wú)Mg2+和不同濃度BHB處理6 h，每組2個(gè)復(fù)孔，再給予含有1 mmol/L MgCl2的pBRS維持培養(yǎng)4 h。之后將細(xì)胞于6孔板中消化，制成細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行流式凋亡和ROS測(cè)定的制備。流式凋亡檢測(cè)的制備：PBS清洗兩次后，加入1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/mL，取100 μL溶液（含1×105個(gè)細(xì)胞）置于5 mL培養(yǎng)管，加入5 μL PE Annexin V和5 μL 7-ADD，25℃避光孵育15 min，繼續(xù)加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻后于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀完成測(cè)試。流式ROS檢測(cè)的制備：用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液按1∶1,000稀釋DCFHDA至終濃度為10 μmol/L。將細(xì)胞用PBS清洗后離心，分別用稀釋的DCFH-DA和Rosup（試劑盒自帶陽(yáng)性試劑）重懸，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min。再用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，以不加染料組作為陰性對(duì)照，Rosup處理組作為陽(yáng)性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 使用熒光倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元，隨時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)元形態(tài)變大，突起逐漸增多，互相接觸，可以看到清晰的軸突和樹突等典型的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，見圖1。

圖1 神經(jīng)元培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)學(xué)改變（×200）

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞死亡 與對(duì)照組比較，無(wú)鎂處理后神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），給予BHB 2 mmol/L組（P＜0.05），4 mmol/L 組（P＜0.01）神經(jīng)元力仍較對(duì)照組減低，而BHB 8 mmol/L組和對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。BHB不同濃度組間比較顯示高濃度組（8 mmol/L）較0 mmol/L組，2 mmol/L組，4 mmol/L組細(xì)胞活力高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。見圖2。

圖2 各組神經(jīng)元細(xì)胞活力（n=5）*P＜0.05，與對(duì)照組比較，**P＜0.01，組間比較，##P＜0.01

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 神經(jīng)元在無(wú)鎂環(huán)境下早期凋亡（P＜0.05）、晚期凋亡（P＜0.01）及凋亡總數(shù)（P＜0.01）均增加。加入8 mmol/L的BHB后，早期凋亡及凋亡總數(shù)較不加入BHB組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖 3。

圖3 BHB影響神經(jīng)元凋亡

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS ROS水平在無(wú)鎂BHB 0 mmol/L組較含鎂對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），無(wú)鎂BHB 8 mmol/L組較無(wú)鎂BHB 0 mmol/L組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4。

圖4 各組ROS陽(yáng)性計(jì)數(shù)

3 討論

癲癇是一種不可預(yù)測(cè)的、反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害人類身心健康［3］。KD是一種高脂肪、低碳水化物的飲食，長(zhǎng)期以來(lái)一直被用作治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦缺血缺氧、難治性癲癇的非藥物治療方法［4］，但它的作用機(jī)制仍不完全清楚。本研究團(tuán)隊(duì)既往的研究顯示KD具有明確抗癲癇及減輕認(rèn)知功能損傷［5］的作用。

BHB是最重要的酮體之一，它被認(rèn)為很可能是KD的有效作用形式［4］。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性研究認(rèn)為BHB具有明確的抗癲癇作用［6-7］和神經(jīng)保護(hù)作用。BHB能減少膠質(zhì)細(xì)胞凋亡［8］，它能改變神經(jīng)元GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，對(duì)抗谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［9］，對(duì)AMPK和PPARα存在激活作用［10］，還能通過(guò)刺激ATP及減少ROS以對(duì)抗低血糖導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷［11］，此外，在慢性退行性疾病的HT22海馬細(xì)胞系中，BHB還通過(guò)減少氧化應(yīng)激、改善線粒體功能實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用［12］。這些可能的作用機(jī)制和KD的神經(jīng)保護(hù)作用存在重要關(guān)聯(lián)。在急性癲癇模型中，BHB能減少匹羅卡品致癇小鼠模型中神經(jīng)元丟失，促進(jìn)凋亡通路的主要蛋白表達(dá)［10］。在癲癇模型的神經(jīng)保護(hù)方面，BHB減輕癲癇小鼠的神經(jīng)元損傷［10］，減少學(xué)習(xí)功能缺損［13］。本研究證實(shí)在葡萄糖供應(yīng)正常的情況下，高濃度BHB增加癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞模型細(xì)胞的活力，具有保護(hù)神經(jīng)元作用。流式檢測(cè)結(jié)果直接顯示BHB影響無(wú)鎂灌流模型中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，且8 mmol/L的BHB預(yù)處理能降低無(wú)鎂灌流所致的ROS升高，提示在SE模型中，BHB能影響氧化應(yīng)激過(guò)程。發(fā)作后缺氧是癲癇發(fā)作后的重要病理生理改變［13］，尤其在SE模型中更為明顯。升高的ROS水平被認(rèn)為是癲癇神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵致病因素。BHB可能通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生，繼而減少細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，高濃度BHB能增加神經(jīng)元活力，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)SE模型中體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元活性有保護(hù)作用，并可能通過(guò)影響ROS途徑起作用。