陶寶杰，李思崎，景凝浩，沈 月，呂 冰，劉立軍，陳 云*

(1 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2 揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

干旱會(huì)降低土壤水勢(shì)，使細(xì)胞無(wú)法維持膨壓，并伴隨著活性氧爆發(fā)，膜脂和蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生氧化損傷[1]，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)。為抵御氧化損傷，植物進(jìn)化出一套高效的防御機(jī)制：一方面依靠超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧[2]，另一方面積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)抵御水分流失，結(jié)合蛋白質(zhì)等大分子維持其構(gòu)象[1]。目前普遍認(rèn)為通過(guò)分子手段提高抗氧化能力是培育節(jié)水耐旱水稻品種的有效方式[3]。

植物中支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(branched-chain amino acid transaminase，BCAT，EC2.6.1.42)是支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA)代謝的關(guān)鍵酶[4]。研究表明BCAT參與對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[5]、ABA信號(hào)通路[6]、氮饑餓脅迫[7]、病原體免疫[8]等多種生理功能。擬南芥AtBCAT3蛋白在干旱脅迫下表達(dá)量顯著升高，突變體AtBCAT3對(duì)干旱敏感[9]。大麥幼苗Hvbcat-1的轉(zhuǎn)錄水平隨干旱脅迫的增加而上升，其產(chǎn)生的BCAAs可以作為一種儲(chǔ)能物質(zhì)在脅迫條件下降解供能[10]。硬粒小麥TdBCAT-A和TdBCAT-B的啟動(dòng)子序列中存在脫水響應(yīng)元件結(jié)合位點(diǎn)，干旱脅迫特異性誘導(dǎo)TdBCAT-A和TdBCAT-B的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升并導(dǎo)致BCAAs積累[5]。水稻BCAT4是AtBCAT3的同源蛋白，定位在葉綠體，參與合成異亮氨酸和纈氨酸[11]，具有調(diào)控水稻礦質(zhì)元素積累的作用[12]。目前鮮見(jiàn)水稻BCAT蛋白響應(yīng)干旱脅迫的相關(guān)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以野生型水稻‘日本晴’(NIP)及BCAT4缺失突變體bcat4-1為材料。用不同濃度的PEG-6000高滲溶液處理水稻幼苗，測(cè)定BCAT4表達(dá)量的變化及NIP和bcat4-1植株的相關(guān)形態(tài)生理指標(biāo)，以探討B(tài)CAT4參與水稻幼苗響應(yīng)干旱脅迫的生理機(jī)制，為耐旱水稻品種的培育提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料為野生型水稻‘日本晴’(OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare，NIP)及以NIP為背景通過(guò)CRISPR/Cas 9技術(shù)獲得的BCAT4突變體bcat4-1。與NIP相比，突變體bcat4-1中BCAT4基因的cDNA序列第65個(gè)堿基后插入了一個(gè)腺嘌呤而引入了一個(gè)終止密碼子TAG，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)序列在第22個(gè)氨基酸殘基后提前翻譯終止。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

NIP與bcat4-1種子用2%次氯酸鈉消毒20 min，再用清水沖洗后28 ℃浸種1 d，37 ℃催芽1 d，轉(zhuǎn)移至去底的PCR板，置于培養(yǎng)箱中(光照16 h/8 h，溫度28 ℃/26 ℃，濕度70%)用水培營(yíng)養(yǎng)液[13]培養(yǎng)21 d(清水3 d，1/2營(yíng)養(yǎng)液7 d，全營(yíng)養(yǎng)液11 d)后分別置于含質(zhì)量濃度分別為15%、20%和25%的PEG-6000的營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行脅迫處理，以不加PEG為對(duì)照。每處理300株苗，重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 熒光定量PCR在不同濃度PEG處理后第0、1、3、5、7天取NIP幼苗葉片測(cè)定BCAT4表達(dá)量。提取葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照MagicSYBR Mixture試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2 × MagicSYBR Mixture 10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火/延伸60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物為BCAT4-F(5′-TCTTATTATTTCGCCCGGAGG-3′)和BCAT4-R(5′-AGGCACCCATCTCTTGTTTGC-3′)；Actin-F(5′-TCGTGTAGCACCAGAAGA-3′)和Actin-R(5′-TCCTGCTCGTAGAAGA-3′)。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。每處理取3株苗，重復(fù)3次。

1.3.2 葉綠素的相對(duì)含量分別在20% PEG處理后第0、1、3、5、7天，用葉綠素測(cè)定儀(SPAD-502)測(cè)定葉片葉綠素的相對(duì)含量(SPAD值)。每處理測(cè)3張葉片，重復(fù)3次。

1.3.3 形態(tài)生理指標(biāo)在20% PEG處理后第7天取樣測(cè)定苗高、根長(zhǎng)、地上部鮮重、地上部干重、根系鮮重、根系干重、葉片相對(duì)含水量和根系活力。葉片相對(duì)含水量(RWC)測(cè)定采用比重法，取葉片鮮樣稱重記為鮮重(FW)，將其在蒸餾水中浸沒(méi)70 min，擦干稱重記為飽和鮮重(SPW)，再烘干記為干重(DW)，計(jì)算RWC=(FW-DW)/(SPW-FW)×100%。根系活力測(cè)定采用三苯基氯化四氮唑(TTC)還原法，根樣與TTC溶液反應(yīng)后，用乙酸乙酯提取反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定485 nm處吸光度，計(jì)算根系活力[14]。每處理取3株苗進(jìn)行以上指標(biāo)的測(cè)定，重復(fù)3次。在20% PEG處理后第10天復(fù)水，于復(fù)水后第3天以每處理24株苗為基數(shù)計(jì)算存活率，存活率(%)= 存活苗數(shù)/總處理苗數(shù)×100%，重復(fù)3次。

1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、氧化損傷指標(biāo)和抗氧化酶活性在20% PEG處理后第0、1、3、5、7天分別測(cè)定地上部和根系的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性。脯氨酸含量測(cè)定以80%乙醇提取，采用酸性茚三酮法[14]。丙二醛(MDA)含量測(cè)定以10%三氯乙酸提取，采用硫代巴比妥酸顯色法[14]。相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定采用浸泡法[15]，用數(shù)字電導(dǎo)率儀(DDS-12A)測(cè)定電導(dǎo)率?？扇苄蕴呛?、H2O2含量、SOD酶活、POD酶活和CAT酶活測(cè)定試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)方法參照說(shuō)明書(shū)。每批測(cè)定材料均另取一份樣品烘干稱重測(cè)定含水量，各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果以DW計(jì)，以消除不同樣品經(jīng)PEG脅迫后植株鮮重變化差異造成的誤差。每處理取3株苗，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 25.0進(jìn)行獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±SD(n = 3)，使用GraphPad Prism 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗葉片BCAT4表達(dá)的影響

圖1顯示，隨著脅迫天數(shù)增加，在15%PEG處理后野生型NIP葉片中BCAT4基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，在20%和25%PEG處理后則先上升后下降。與對(duì)照(處理后第0天)相比，BCAT4基因相對(duì)表達(dá)量在15% PEG處理后第1天就顯著增加，在處理后第7天達(dá)到最高，比對(duì)照增加了0.9倍；BCAT4基因相對(duì)表達(dá)量在20% PEG處理后第1天即比對(duì)照極顯著增加，處理后第5天達(dá)到最高，比對(duì)照增加了1.9倍，處理后第7天開(kāi)始下降但仍極顯著高于對(duì)照；BCAT4基因相對(duì)表達(dá)量在25% PEG處理后第1天就比對(duì)照增加了1.0倍，并達(dá)到最大值，而在處理后第3天迅速下降，在處理后第5天就顯著低于對(duì)照?？梢?jiàn)，20% PEG處理后NIP葉片BCAT4基因相對(duì)表達(dá)量變化幅度較大且不會(huì)過(guò)早降低。所以，后續(xù)采用該濃度處理進(jìn)一步觀察表型并測(cè)定其他形態(tài)及生理指標(biāo)。

以處理后第0天為對(duì)照，相同PEG濃度下不同天數(shù)對(duì)比，*表示差異顯著(P < 0.05)，**表示差異極顯著(P < 0.01)

2.2 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗表型及生長(zhǎng)的影響

2.2.1 幼苗表型20% PEG處理后，NIP和bcat4-1幼苗的生長(zhǎng)均受到抑制，葉片隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸干枯卷曲；與NIP相比，突變體bcat4-1表現(xiàn)為不耐旱，bcat4-1的葉片卷曲程度在處理后第5天顯著高于NIP(圖2)。

圖2 20% PEG處理后NIP和bcat4-1的表型

2.2.2 幼苗形態(tài)指標(biāo)在不加PEG(對(duì)照)條件下，NIP與bcat4-1幼苗各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。在20% PEG處理后第7天，NIP和bcat4-1幼苗的苗高、地上部鮮重、地上部干重、葉片相對(duì)含水量均比對(duì)照降低，降幅分別為36.2%和51.1%、56.5%和73.6%、25.0%和31.6%、25.5%和64.0%；其中bcat4-1的苗高、鮮重和葉片相對(duì)含水量均顯著低于NIP(表1)。同時(shí)，與對(duì)照相比，20% PEG處理后第7天，NIP與bcat4-1幼苗的主根長(zhǎng)、根鮮重、根干重、根活力均顯著下降，但上述各指標(biāo)在兩材料間均無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明在PEG模擬干旱脅迫下，NIP和bcat4-1幼苗的形態(tài)指標(biāo)均受到顯著抑制；BCAT4突變顯著降低水稻幼苗苗高、地上部鮮重和葉片相對(duì)含水量，降低了水稻幼苗抗旱性，但對(duì)地下部指標(biāo)無(wú)顯著影響。

表1 20% PEG處理后第7天NIP和bcat4-1幼苗形態(tài)生理指標(biāo)的變化(單株)

2.2.3 幼苗復(fù)水后存活率在20% PEG處理后第10天將水稻幼苗復(fù)水，以葉片轉(zhuǎn)為鮮綠色為存活依據(jù)，于復(fù)水后第3天拍攝表型并統(tǒng)計(jì)NIP與bcat4-1的存活情況。bcat4-1和NIP水稻幼苗的復(fù)水后存活率分別為30.6%和61.8%，材料間差異極顯著(P<0.01)(圖3)。表明BCAT4突變后，水稻幼苗從干旱脅迫中恢復(fù)的能力顯著下降，耐旱性明顯減弱。

以NIP為對(duì)照，**表示差異極顯著

2.3 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量與植物的光合速率、生理營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)。20% PEG脅迫處理后，兩水稻材料幼苗葉片的SPAD值均持續(xù)降低，且bcat4-1幼苗的葉片SPAD值始終顯著低于同期NIP幼苗。其中，在處理后第1天，兩材料幼苗葉片的SPAD值差異就達(dá)到顯著水平，在處理后第5天時(shí)差異達(dá)極顯著水平，處理后第7天，bcat4-1的SPAD值比NIP極顯著降低18.04%(圖4)。

以NIP為對(duì)照，*表示差異顯著，**表示差異極顯著，圖5～7同

2.4 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的影響

脯氨酸和可溶性糖是植株響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，二者的積累量與植株抗旱性成正比。隨著20% PEG脅迫處理天數(shù)增加，兩水稻材料葉片和根系中的脯氨酸和可溶性糖含量均呈逐漸上升趨勢(shì)，且bcat4-1在脅迫處理過(guò)程中始終低于同期NIP(圖5)。其中，bcat4-1葉片中脯氨酸含量始終與NIP差異顯著或極顯著，在處理后第7天比NIP極顯著降低35.55%(圖5，A)；兩材料根中脯氨酸含量均低于葉片，且在PEG處理期間差異小于葉片，在處理后第3天差異才達(dá)到顯著水平，bcat4-1在處理后第7天比NIP顯著降低13.39%(圖5，B)。在20% PEG處理后，兩材料中可溶性糖含量的變化趨勢(shì)與脯氨酸含量相似，bcat4-1葉中可溶性糖含量始終與NIP差異極顯著，在處理后第7天比NIP極顯著降低23.23%(圖5，C)；兩材料間根中可溶性糖含量差異也明顯小于葉片，僅在處理后第5天差異達(dá)到顯著水平(圖5，D)。由此可見(jiàn)，2個(gè)水稻材料幼苗葉片和根系的脯氨酸和可溶性糖含量均會(huì)隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而上升，BCAT4缺失后顯著降低了葉片中脯氨酸和可溶性糖含量的上升幅度。

圖5 20% PEG處理后NIP和bcat4-1葉片(A、B)和根系(C、D)中脯氨酸與可溶性糖含量

2.5 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗MDA和H2O2含量及相對(duì)電導(dǎo)率的影響

MDA、H2O2的積累量和相對(duì)電導(dǎo)率可以評(píng)估質(zhì)膜受損程度，間接體現(xiàn)植株抗旱性。隨著PEG模擬干旱脅迫天數(shù)增加，兩水稻材料葉片和根系中的MDA、H2O2含量及相對(duì)電導(dǎo)率均逐漸增加，且bcat4-1的各指標(biāo)始終高于同期NIP(圖6)。其中，兩材料間葉片MDA、H2O2含量及相對(duì)電導(dǎo)率在PEG處理1～7 d差異均達(dá)到顯著水平，bcat4-1葉片上述3個(gè)指標(biāo)在處理后第7天分別比NIP極顯著提高31.1%、17.4%和19.8%(P<0.01)(圖6，A-C)。同時(shí)，20% PEG模擬干旱脅迫對(duì)根細(xì)胞的膜脂損傷在兩材料間差異較小，除了處理后第5天和第7天根中H2O2含量在材料間差異達(dá)顯著水平外，其余指標(biāo)在處理后不同時(shí)間的差異均未達(dá)到顯著水平(圖6，D-F)?？梢?jiàn)，BCAT4缺失顯著加劇干旱脅迫期間水稻幼苗葉片的質(zhì)膜受損程度。

圖6 20% PEG處理后NIP和bcat4-1葉片(A-C)和根系(D-F)中MDA和H2O2含量及相對(duì)電導(dǎo)率

2.6 PEG模擬干旱脅迫對(duì)水稻幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物體內(nèi)抵抗氧化損傷最重要的酶類。隨PEG模擬干旱脅迫天數(shù)增加，兩水稻材料葉片中的SOD、POD、CAT活性均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；NIP葉片中POD活性在處理后第3天達(dá)最大值，SOD和CAT活性在處理后第5天達(dá)最大值，而bcat4-1葉片中上述3種酶活性均在處理后第3天即達(dá)到最大值，并且這3種酶的活性始終顯著低于同期NIP，在處理后第3天分別比NIP極顯著降低17.5%、36.9%和22.3%(圖7，A-C)。同時(shí)，兩材料根中3種抗氧化酶活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)一直保持上升趨勢(shì)。其中，根系SOD和POD活性在品種間差異分別在處理后第7天和第5天達(dá)到顯著水平，品種間CAT活性差異在各處理時(shí)間均不顯著(圖7，D-F)。因此，缺失BCAT4后顯著降低了干旱脅迫后水稻幼苗葉片中抗氧化酶活性，使得抗氧化酶活性上升幅度降低，下降時(shí)期提前。

圖7 20% PEG處理后NIP和bcat4-1葉片(A-C)和根系(D-F)中SOD、POD和CAT活性

3 討 論

PEG-6000具備較大的分子量，無(wú)法通過(guò)植物細(xì)胞壁且化學(xué)性質(zhì)不活潑，是較為理想的滲透調(diào)節(jié)劑[16]。本試驗(yàn)設(shè)置3種不同濃度的PEG模擬干旱脅迫處理，分析野生型NIP的BCAT4表達(dá)情況，確定了20% PEG為最佳處理?xiàng)l件，該P(yáng)EG濃度下水稻幼苗BCAT4表達(dá)量上升幅度最大，又不會(huì)因過(guò)早脫水而抑制生理活動(dòng)。在20% PEG-6000模擬干旱脅迫下，bcat4-1幼苗的復(fù)水存活率顯著低于NIP，且處理后bcat4-1的葉綠素含量下降幅度顯著大于NIP，耐旱性明顯減弱。

抗氧化酶系統(tǒng)在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[17]。在20% PEG模擬干旱脅迫下，本研究中NIP與bcat4-1葉片中的SOD、POD和CAT活性均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果相一致[18-20]，說(shuō)明在脅迫前期植株可以依靠保護(hù)酶系統(tǒng)抵御氧化損傷，在脅迫后期蛋白質(zhì)大量分解使得抗氧化酶的活性下降[18]。同時(shí)，本研究的bcat4-1葉片中上述3種抗氧化酶的活性始終低于NIP，抗氧化能力減弱；在干旱脅迫后期(處理后第7天)，水稻幼苗根中抗氧化酶的活性仍維持較高的水平，這是干旱脅迫下植物保護(hù)根系的重要抗旱策略[21]。另外，脯氨酸和可溶性糖具有滲透調(diào)節(jié)作用，可以緩解干旱脅迫對(duì)植株的傷害[20]。本研究中bcat4-1葉片的脯氨酸和可溶性糖含量在模擬干旱脅迫開(kāi)始后上升幅度顯著低于NIP，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力下降。H2O2是活性氧代謝的重要中間產(chǎn)物，MDA含量體現(xiàn)了膜脂過(guò)氧化程度，而相對(duì)電導(dǎo)率可以評(píng)估質(zhì)膜的透性，本試驗(yàn)中bcat4-1葉片的上述3個(gè)指標(biāo)的上升幅度均顯著高于NIP，說(shuō)明BCAT4突變后幼苗地上部更易受到活性氧的傷害。活性氧的過(guò)度積累可引發(fā)葉綠素的降解[22]，導(dǎo)致bcat4-1的SPAD值下降幅度顯著高于NIP。另外，本研究中兩個(gè)水稻材料幼苗以上各項(xiàng)指標(biāo)在根中的差異均小于在葉片中的差異。單因素方差分析結(jié)果表明BCAT4突變主要影響幼苗地上部的生長(zhǎng)，而對(duì)根系的影響不顯著。結(jié)合已有報(bào)道稱BCAT4定位在葉綠體中[7]，本研究認(rèn)為BCAT4主要參與水稻地上部對(duì)干旱的響應(yīng)過(guò)程。

BCAT4在擬南芥中的同源蛋白AtBCAT3合成的BCAAs可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)或以供能物質(zhì)的方式協(xié)助植物抵御干旱脅迫[10, 23-24]，其T-DNA插入突變體在干旱脅迫下表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩和種子產(chǎn)量顯著降低[9]。Jin等[12]報(bào)道了水稻BCAT4參與合成異亮氨酸和纈氨酸，本研究觀察到其缺失后表現(xiàn)的耐旱性下降可能與BCAAs合成減少有關(guān)。擬南芥和西蘭花中BCAT參與合成蛋氨酸衍生物[25-26]，孫陽(yáng)陽(yáng)認(rèn)為水稻BCAT4也參與合成S-腺苷L-蛋氨酸[7]，經(jīng)脫羧反應(yīng)為多胺的生物合成提供氨丙基供體[27]。植物體內(nèi)多胺的積累可以激活抗氧化酶系統(tǒng)，也可以直接發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除作用，協(xié)助植物響應(yīng)干旱脅迫[28-29]。因此，BCAT4還可能參與調(diào)節(jié)多胺類物質(zhì)的生物合成來(lái)協(xié)助植物響應(yīng)干旱脅迫。

綜上所述，BCAT4突變抑制了水稻幼苗在PEG-6000模擬干旱脅迫下地上部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶活性，導(dǎo)致葉綠素含量降低，MDA和H2O2積累增加，細(xì)胞膜受損加劇，相對(duì)電導(dǎo)率上升，最終降低了水稻的耐旱性。本研究探討了BCAT4參與水稻干旱響應(yīng)的可能機(jī)制，為水稻抗旱育種提供了一定的理論參考，但只從突變體材料出發(fā)具有一定的片面性，未來(lái)應(yīng)構(gòu)建BCAT4過(guò)表達(dá)材料以進(jìn)一步驗(yàn)證已有結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：陶寶杰：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，完成論文撰寫與修改；李思崎：協(xié)助完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析；景凝浩：參與形態(tài)與生理指標(biāo)測(cè)定；沈月：參與植物材料處理；呂冰：提出修改意見(jiàn)；劉立軍：提出修改意見(jiàn)；陳云：提出研究思路，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和論文寫作并提出修改意見(jiàn)。