孟益德，王 琦，劉攀峰，杜紅巖，杜慶鑫*

1中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所；2經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3國(guó)家林業(yè)草原杜仲工程技術(shù)研究中心，鄭州 450003

杜仲(EucommiaulmoideOliv.)，是第四紀(jì)冰川侵襲后留存于我國(guó)的單種屬孑遺樹種，也是我國(guó)重要的林源藥用樹種，自古以取皮入藥而著稱[1]。杜仲皮富含木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮等化合物，例如，京尼平苷酸具有降血壓和調(diào)節(jié)血壓的功效，京尼平苷具有抗腫瘤活性和抗補(bǔ)體性，桃葉珊瑚苷具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗菌消炎作用[2]。而木脂素類松脂醇二葡萄糖苷則是杜仲皮中已知的、具有降血壓功效的活性成分，因此，杜仲皮作為中藥在醫(yī)療保健等方面起著十分重要的作用[3,4]。

隨著杜仲全樹綜合開發(fā)利用理念的提出，杜仲的栽培模式也由傳統(tǒng)的藥用栽培模式發(fā)展至果用杜仲栽培模式、雄花用栽培模式、材藥兼用栽培模式以及葉用栽培模式等多種經(jīng)營(yíng)模式[5]。杜仲葉用林栽培模式利用杜仲萌芽能力強(qiáng)的特性，使經(jīng)營(yíng)周期縮短，極大提高了杜仲葉、皮的產(chǎn)量和質(zhì)量，經(jīng)濟(jì)效益顯著[6]。有研究對(duì)傳統(tǒng)喬林和葉用林模式杜仲葉中化學(xué)成分進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)次生代謝物可有效區(qū)分喬林與葉林[7]。此外，葉用林相較于喬林模式的杜仲葉及皮中綠原酸含量更高，確定了葉用林栽培為最佳栽培模式[8]。另有研究認(rèn)為施用外源激素可顯著提高短周期葉林杜仲葉及皮的膠含量[9]。但是對(duì)葉用林栽培模式下不同杜仲無(wú)性系間枝皮化學(xué)成分研究尚未開展，限制了葉用林栽培模式下枝皮資源開發(fā)利用。

頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集萃取、濃縮和解吸于一體的樣品預(yù)處理技術(shù)，該方法操作簡(jiǎn)便、用樣量少、無(wú)繁雜的前處理過程，同時(shí)可以避免樣品中不穩(wěn)定成分的氧化和分解[10]。近年來(lái)與氣相質(zhì)譜(GC-MS)相結(jié)合，已被廣泛應(yīng)用于植物揮發(fā)性成分的研究[11,12]。研究表明，很多揮發(fā)性物質(zhì)成分不僅可直接抗蟲、入藥，或作為有機(jī)合成的先導(dǎo)成分，而且又是植物各代謝途徑的重要中間體，對(duì)分析植物代謝網(wǎng)絡(luò)和研究植物自身防御反應(yīng)等具有一定的指導(dǎo)作用[13]。傅里葉變換紅外光譜(FTTR)也是質(zhì)量評(píng)價(jià)中常用的分析方法，可對(duì)樣品進(jìn)行整體上定性分析，具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)損的特點(diǎn)[14]。因此，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)短周期葉用林栽培模式下8個(gè)杜仲無(wú)性系枝皮7種主要活性成分的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)分析其揮發(fā)性成分，找出不同無(wú)性系杜仲枝皮中差異性揮發(fā)物質(zhì)，并利用紅外光譜進(jìn)行比較分析。初步判定各無(wú)性系的化學(xué)特征，以期為杜仲短周期葉用林模式下枝皮的質(zhì)量控制、定向培育以及資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以短周期葉用林栽培模式下2年生8個(gè)杜仲無(wú)性系為實(shí)驗(yàn)材料，2020年10月對(duì)萌發(fā)的枝條進(jìn)行平茬處理，收集平茬后的枝條剝皮，低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室烘干至恒重，經(jīng)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所孫志強(qiáng)研究員鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoideOliv.的干燥枝皮。所有枝皮均采自河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所原陽(yáng)試驗(yàn)基地(34°55′N，113°36′E)，試驗(yàn)地所屬氣候類型為暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，年均日照時(shí)數(shù)2 324.5 h，年平均氣溫14.4 ℃，年溫差27.6 ℃，平均年降水量571.7 mm，栽培條件以及管理方式基本一致。8個(gè)杜仲無(wú)性系編號(hào)分別為EU1、EU2、EU3、EU4、EU5、EU6、EU7、EU8。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY Arc型高效液相色譜儀，配置2998 PDA型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；Trace 1310型氣相色譜聯(lián)用ISQ QD型單四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；65 μm PDMS/DVBSPME固相微萃取針(美國(guó)Supelco公司)；XS204萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒?托利多上海儀器有限公司)；HT-300 BQ超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)；5430 R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-Q Integral超純水機(jī)(美國(guó)Merck Millipore公司)。

兒茶素(批號(hào)：CDZE-B21722)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)；桃葉珊瑚苷(批號(hào)：CDAA-280431)、綠原酸(批號(hào)：CDAA-280804)、京尼平苷(批號(hào)：CDAA-280017)、正構(gòu)烷烴混標(biāo)C10～C25(CDAA-M-690035-HD)購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司(純度≥98%)；京尼平苷酸(批號(hào)：MUST-21062003)、松脂醇二葡萄糖苷(批號(hào)：MUST-21032510)、紫云英苷(批號(hào)：MUST-21022410)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司(純度≥98%)；乙腈和甲醇為色譜純(湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司)，甲酸為分析純(上海麥克林生化科技有限公司)，水為超純水。

1.3 主要活性成分測(cè)定

1.3.1 樣品制備

分別精密稱取干燥粉碎后的杜仲枝皮樣品粉500 mg，每份樣品中加入60%甲醇水溶液，混勻超聲提取30 min，樣品和提取液比例為1∶20，于4 ℃冰箱靜置過夜。12 000 r/min離心10 min，取上清液，過微孔濾膜(0.22 μm)，置于液相進(jìn)樣瓶中待測(cè)，每個(gè)樣品制備3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 HPLC色譜條件

色譜測(cè)定條件參考孫佳等[15]的方法并稍做修改。色譜柱：賽默飛Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%→17% A；10～25 min，17%→20% A；25～30 min，20%→30% A；30～50 min，30%→50% A；50～55 min，50%→70% A；55～57 min，70%→5% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～9 min于204 nm處測(cè)定桃葉珊瑚苷，9～11 min于239 nm處測(cè)定京尼平苷酸，11～15.4 min于325 nm處測(cè)定綠原酸，15.4～16 min于276 nm處測(cè)定兒茶素，16～17 min于239 nm處測(cè)定京尼平苷，17～18 min于276 nm處測(cè)定松脂醇二葡萄糖苷，18～50 min于364 nm處測(cè)定紫云英苷；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液(A)及杜仲葉片樣品溶液(B)的HPLC色譜圖見圖1。

精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、兒茶素、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、紫云英苷的標(biāo)準(zhǔn)品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.5、1、0.08、0.1、0.08、0.1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2、4、5、6、7、8 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定其峰面積。以各待測(cè)成分進(jìn)樣量(x，μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到以下回歸方程。桃葉珊瑚苷：y=3.0×106x+14 903(R2=0.999 1)，京尼平苷酸：y=1.0×107x-55 546(R2=0.999 4)，綠原酸：y=2.0×107x+2.0×106(R2=0.998 3)，兒茶素：y=2.0×107x-7 632(R2=0.999 8)，京尼平苷：y=1.0×107x+11 429(R2=0.998 4)，松脂醇二葡萄糖苷：y=4.0×106x+8 766.7(R2=0.998 8)，紫云英苷：y=1.0×107x-61 050(R2=0.999 1)[16]。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)及樣品溶液(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard solution (A) and sample solution (B)注：1.桃葉珊瑚苷；2.京尼平苷酸；3.綠原酸；4.兒茶素；5.京尼平苷；6.松脂醇二葡萄糖苷；7.紫云英苷。Note:1.Aucubin;2.Geniposidic acid;3.Chlorogenic acid;4.Catechin;5.Geniposide;6.Pinoresinol diglucoside;7.Astragaline.

1.4 揮發(fā)性成分的測(cè)定

1.4.1 樣品處理

將粉碎后枝皮樣品粉0.7 g、飽和氯化鈉3.6 g以及12 mL水置于頂空瓶中，頂空萃取瓶置于70 ℃下平衡20 min后，插入在GC進(jìn)樣口250 ℃溫度下老化1 h的萃取頭，磁力攪拌吸附萃取40 min。然后將萃取頭轉(zhuǎn)移至220 ℃的氣相色譜進(jìn)樣口中以無(wú)分流方式熱解析3 min，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱型號(hào)為TG-WAXMS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。色譜條件：升溫程序：起始溫度50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/min升至160 ℃，最后以3 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1 mL/min，傳輸線溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，解吸溫度為220 ℃。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，燈絲延遲180 s，離子源溫度280 ℃。質(zhì)量掃描范圍：m/z40～500，掃描方式為全掃描。

1.4.3 定性定量分析

將GC-MS測(cè)定后未知化合物質(zhì)譜圖經(jīng)AnalysisBaseFileConverter軟件轉(zhuǎn)換為分析基本文件abf格式，之后導(dǎo)入MS-DIAL軟件對(duì)原始圖譜進(jìn)行峰檢測(cè)、峰識(shí)別、解卷積、定性、峰對(duì)齊、濾波、保留時(shí)間校正等處理，代謝物注釋基于氣相色譜保留指數(shù)(retention index，RI)以及專用代謝MoNA volatile數(shù)據(jù)庫(kù)，采用譜庫(kù)結(jié)合線性保留指數(shù)對(duì)各組分進(jìn)行定性，篩選出匹配度在80%以上的化合物[17]。根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算各物質(zhì)的保留指數(shù)，正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)為C10～C25，保留指數(shù)(RI)=100n+(RTX-RTn)/(RTn+1-RTn)×100，式中n為該化合物前一正構(gòu)烷烴所含碳原子數(shù)；RTX表示該物質(zhì)的保留時(shí)間；RTn表示該物質(zhì)前一正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；RTn+1表示該物質(zhì)后一正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。得到原始數(shù)據(jù)矩陣后導(dǎo)出于Excel表中，采用峰面積歸一化法，以各揮發(fā)組分的峰面積占總峰面積之比值表示組分相對(duì)含量，結(jié)果取3次重復(fù)的平均值表示。

1.5 紅外光譜測(cè)定

取8個(gè)杜仲無(wú)性系枝皮各約2 mg與KBr 200 mg混合研磨均勻，手動(dòng)壓片機(jī)壓成均勻透明薄片后掃描獲得紅外光譜圖，同一樣品測(cè)定3次重復(fù)，掃描光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用SIMCA-P軟件進(jìn)行聚類分析(HCA)和主成分分析(PCA)，偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)模型計(jì)算變量重要性投影VIP值[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同杜仲無(wú)性系枝皮主要活性成分含量比較

短周期葉用林模式下不同杜仲無(wú)性系枝皮的主要活性成分含量如表1所示。環(huán)烯醚萜類物質(zhì)桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷在杜仲枝皮中含量較高，平均含量分別為24 807、11 524、6 252 μg/g，兒茶素含量較低為66 μg/g。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸在無(wú)性系EU5中含量最高，京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷在EU4中含量最高，而苯丙素類物質(zhì)綠原酸和兒茶素在EU7中含量最高，無(wú)性系EU2中黃酮類物質(zhì)紫云英苷含量較高。上述結(jié)果表明，不同無(wú)性系杜仲枝皮各活性成分之間存在顯著差異。

表1 不同杜仲無(wú)性系枝皮的活性成分含量Table 1 Content of active components in the branch bark of different E.ulmoides clones(μg/g)

2.2 不同杜仲無(wú)性系枝皮揮發(fā)性成分分析

2.2.1 揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖

短周期葉用林模式下不同杜仲無(wú)性系枝皮揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖如圖2所示，TIC圖提供了在不同時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜中所有離子強(qiáng)度之和的連續(xù)描述，宏觀反映所有揮發(fā)性物質(zhì)在氣相色譜分離情況。從圖2可以直觀地看出，8個(gè)無(wú)性系之間揮發(fā)性物質(zhì)峰高、峰面積存在較大的差異。

圖2 不同杜仲無(wú)性系枝皮揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in branch bark of different E.ulmoides clones

2.2.2 揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量

不同杜仲無(wú)性系枝皮的主要揮發(fā)性成分見表2，共在8個(gè)無(wú)性系中分離鑒定出70種揮發(fā)性成分，包括酯類(24種)，醇類(16種)，醛類(12種)，萜類(7種)，酮類(5種)，內(nèi)酯(3種)，烯類(3種)。無(wú)性系EU1相對(duì)含量在1%以上的化合物共檢測(cè)出34種揮發(fā)成分，包括8種醇、11種醛、7種酯、3種萜、2種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，EU2檢測(cè)出33種揮發(fā)成分，包括7種醇、9種醛、7種酯、4種萜、3種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，無(wú)性系EU3和EU4均檢測(cè)出32種揮發(fā)成分，EU3包括9種醇、9種醛、6種酯、4種萜、1種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，EU4包括7種醇、10種醛、7種酯、3種萜、2種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，EU5檢測(cè)出33種揮發(fā)成分，包括8種醇、10種醛、7種酯、4種萜、1種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，EU6檢測(cè)出37種揮發(fā)成分，包括8種醇、10種醛、8種酯、5種萜、3種酮、2種內(nèi)酯和1種烯，EU7檢測(cè)出33種揮發(fā)成分，包括8種醇、9種醛、9種酯、4種萜、1種酮和2種內(nèi)酯，EU8檢測(cè)出34種揮發(fā)成分，EU8相對(duì)于其他無(wú)性系枝皮檢測(cè)出的酯類最多，為10種酯。

在檢測(cè)的相對(duì)含量在1%以上的化學(xué)成分中，8個(gè)無(wú)性系杜仲枝皮中共有18種揮發(fā)性成分。而無(wú)性系EU1特有的揮發(fā)性成分為庚醛，EU6特有乙基芳樟醇、反式-2-己烯醇2種揮發(fā)性成分，EU7特有的揮發(fā)性成分為十三硫醇，EU8特有2種揮發(fā)性成分，為10-十一烯酸己酯和甲酸薄荷酯。在檢測(cè)的相對(duì)含量在5%以上的揮發(fā)成分中，無(wú)性系EU1含有棕櫚酸異辛酯、山崳醇和月桂酸異丁酯3種揮發(fā)成分，EU2中包括異植物醇、2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮、(Z)-9-庚烯、2-乙硫基乙醇和庚醛二甲基縮醛5種揮發(fā)成分，EU3包括十六醇、(Z)-9-庚烯和17-甲基十八酸甲酯3種揮發(fā)成分，EU4包括2-乙硫基乙醇、2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮和庚醛二甲基縮醛3種揮發(fā)成分。無(wú)性系EU5中相對(duì)含量在5%以上的揮發(fā)成分有17-甲基十八酸甲酯、異植物醇和己醛二己基縮醛，EU7有17-甲基十八酸甲酯，EU8有異植物醇和短指軟珊瑚內(nèi)酯，這些揮發(fā)成分是杜仲枝皮的主要揮發(fā)物質(zhì)。EU6揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量均在5%以下。上述表明，采用HS-SPME結(jié)合GC-MS能夠很好的表征不同杜仲無(wú)性系枝皮揮發(fā)性成分的組成信息。

8個(gè)杜仲無(wú)性系揮發(fā)物質(zhì)含量有明顯差異，萜類物質(zhì)異植物醇在EU2、EU5以及EU8無(wú)性系中相對(duì)含量均最高，分別占7.24%、9.40%、6.35%。2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮和2-乙硫基乙醇在EU2和EU4中相對(duì)含量均較高，月桂酸異丁酯在EU1和EU7中相對(duì)含量較高，分別為4.94%、5.13%，十六醇在EU3中相對(duì)含量最高為9.51%，而在其他無(wú)性系中相對(duì)含量不足2%。

表2 不同杜仲無(wú)性系枝皮揮發(fā)性氣體及相對(duì)含量Table 2 Relative content of volatile gases in branch bark of different E.ulmoides clones

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2.3 揮發(fā)物質(zhì)類別及含量

通過比較8個(gè)杜仲無(wú)性系枝皮中不同類別的揮發(fā)物質(zhì)成分相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，如表3所示。醇類作為普遍性揮發(fā)性物質(zhì)，在無(wú)性系EU3中相對(duì)含量最高，占總揮發(fā)物質(zhì)成分的26.03%。EU1、EU2、EU4和EU6均以醛類物質(zhì)相對(duì)含量最高，分別占總揮發(fā)物質(zhì)成分的26.82%、24.75%、28.43%、25.06%，EU5、EU7、EU8均以酯類物質(zhì)相對(duì)含量最高，分別占總揮發(fā)物質(zhì)成分的26.31%、31.28%、29.25%，萜類物質(zhì)在EU5中相對(duì)含量較高，這表明醇、醛、酯類是不同杜仲無(wú)性系枝皮的主要揮發(fā)物質(zhì)成分。

表3 不同杜仲無(wú)性系枝皮中各類別揮發(fā)性成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Relative mass fraction of various types of volatile components in the branch bark of different E.ulmoides clones

2.3 不同杜仲無(wú)性系枝皮的差異化物質(zhì)成分

2.3.1 基于主要活性成分的不同杜仲無(wú)性系聚類和主成分分析

為進(jìn)一步比較不同杜仲無(wú)性系枝皮活性成分的差異性，利用7種主要活性成分進(jìn)行聚類和主成分分析，結(jié)果如圖3、4所示。通過聚類分析可將杜仲8個(gè)無(wú)性系分為3組，分別為I組(EU1、EU4、EU5)、II組(EU3、EU4)、III組(EU2、EU6、EU8)。8個(gè)無(wú)性系主成分分析數(shù)據(jù)的總方差為97.5%，包含3種主成分，其中主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率為79.90%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率為9.55%，主成分3(PC3)的貢獻(xiàn)率為7.99%。在第一維度(PC1)上，無(wú)性系EU1、EU4、EU5位于右側(cè)，EU3、EU8位于左側(cè)，EU2、EU6、EU7位于中間，這表明PC1可明顯區(qū)分劃分出的三個(gè)組別。且在PC1上對(duì)無(wú)性系EU1、EU4、EU5有貢獻(xiàn)的活性成分主要是環(huán)烯醚萜類物質(zhì)京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷。

2.3.2 不同無(wú)性系杜仲枝皮的差異揮發(fā)物質(zhì)篩選

構(gòu)建PLS-DA模型衡量不同組別之間的差異，明確不同杜仲無(wú)性系枝皮之間的差異揮發(fā)物質(zhì)成分，結(jié)果如圖5所示。在交互檢驗(yàn)中，原始模型的R2Y和Q2分別為0.992和0.818，均超過0.8，表明PLS-DA模型沒有過擬合，在置換檢驗(yàn)中，置換后模型R2Y和Q2分別為0.964和0.225，均小于原始模型的R2Y和Q2，說明PLS-DA模型的數(shù)據(jù)可靠，可用于分析差異化揮發(fā)性物質(zhì)。根據(jù)貢獻(xiàn)值大于1從模型結(jié)果中篩選出22種揮發(fā)性物質(zhì)，如表4所示，分別為溴化香葉酯、己醛二己基縮醛、葎草烯、丁酸香茅酯、環(huán)十二酮、乙酸油酯、四氫香葉甲酸酯、戊酸香茅酯、馬來(lái)酸二丁酯、柱頭甾-5-烯-3β-醇、十六醇、順式橙花苷醋酸酯、棕櫚酸異辛酯、乙酰丙酸己酯、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸甲酯、十一醛、1-十一醇、順-3-己烯醛、反式-2-己烯醇、1-庚醇、反-2-癸醛、丙酸薄荷酯，可將這些揮發(fā)物質(zhì)成分作為8個(gè)杜仲無(wú)性系枝皮的特征物質(zhì)，其主要為酯類揮發(fā)性成分。

圖3 不同杜仲無(wú)性系的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of different E.ulmoides clones

圖4 不同杜仲無(wú)性系的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different E.ulmoides clones

圖5 不同杜仲無(wú)性系PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of different E.ulmoides clones

2.4 不同杜仲無(wú)性系枝皮的紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜分析8個(gè)杜仲無(wú)性系的指紋圖譜，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)紅外信號(hào)峰部分波段的信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生了改變。首先在3 400 cm-1處主要是材料中或者是空氣中的-OH伸縮振動(dòng)所引起的寬峰。2 900 cm-1綠色框標(biāo)記區(qū)域是由杜仲枝皮中的氨基成分引起的多峰信號(hào)，主要是N-H鍵的伸縮振動(dòng)和亞甲基飽和C-H鍵的伸縮振動(dòng)，這是存在揮發(fā)性成分的特征表現(xiàn)[19]。所有樣品在2 300 cm-1處都存在有個(gè)小的吸收波動(dòng)，這是在紅外測(cè)試過程中外界因素所誘發(fā)的。在1 737 cm-1處的振動(dòng)主要是含有C=O鍵化合物的伸縮振動(dòng)吸收峰。1 654 cm-1紅外吸收峰是由杜仲枝皮中的烯烴物質(zhì)造成的，歸屬于材料的C=C雙鍵的伸縮振動(dòng)，此處無(wú)性系EU3吸收較強(qiáng)可能與較高含量的(Z)-9-庚烯相關(guān)。1 600～1 170 cm-1綠色框標(biāo)記主要是C-H鍵的對(duì)稱變形振動(dòng)和不對(duì)稱變形振動(dòng)所導(dǎo)致的振動(dòng)峰群，此處官能團(tuán)活性差異不明顯。最后在1 053 cm-1處的紅外信號(hào)是由C-O鍵的伸縮振動(dòng)所引起的，此處無(wú)性系EU1、EU4和EU5具有較強(qiáng)的吸收峰，這可能與含有較多的環(huán)烯醚萜苷類成分有關(guān)。

表4 不同杜仲無(wú)性系枝皮篩選的差異揮發(fā)成分Table 4 Differential volatile components screened from branch bark of different E.ulmoides clones

續(xù)表4(Continued Tab.4)

圖6 不同杜仲無(wú)性系枝皮的傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of branch bark of different E.ulmoides clones

3 討論與結(jié)論

本研究采用HPLC和HP-SPME-GC-MS對(duì)短周期葉用林模式下不同杜仲無(wú)性系枝皮的化學(xué)成分進(jìn)行了定量檢測(cè)分析，同時(shí)利用紅外光譜進(jìn)行了比較，提取出了8個(gè)無(wú)性系枝皮的指紋圖譜，初步分析了化學(xué)成分和紅外圖譜的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)8個(gè)杜仲無(wú)性系枝皮中各化學(xué)成分之間存在差異，7種主要活性成分中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷在不同杜仲無(wú)性系枝皮中含量均較高，環(huán)烯醚萜類具有多種生物活性[20]，因此，可對(duì)葉林模式下不同杜仲無(wú)性系枝皮中環(huán)烯醚萜類成分加以利用。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)杜仲枝皮中松脂醇二葡萄糖苷含量隨樹齡的增加呈而增加，故松脂醇二葡萄糖苷在老皮中含量高，新皮中含量較低。葉用林杜仲皮中標(biāo)志性化合物松脂醇二葡萄糖苷平均含量相對(duì)較低，僅無(wú)性系EU1、EU4、EU7中含量大于0.1%，符合2 020版中藥藥典的要求，所以將松脂醇二葡萄糖苷作為藥用質(zhì)量指標(biāo)時(shí)應(yīng)選擇這3個(gè)無(wú)性系杜仲枝皮加以利用。

植物特異性揮發(fā)性物質(zhì)在植物信息的傳遞過程中起著重要的信號(hào)作用[22]。本研究利用植物代謝組學(xué)的策略，研究杜仲枝皮釋放揮發(fā)性物質(zhì)的種類和數(shù)量，植物代謝組所得數(shù)據(jù)需對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊、切割、濾噪等預(yù)處理，因此選擇了MS-DIAL軟件對(duì)多個(gè)樣本質(zhì)譜峰進(jìn)行特征峰匹配、對(duì)齊以及提取[23,24]，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)共檢測(cè)出酯類、醇類、醛類、萜類、酮類、內(nèi)酯、烯類7大類70種揮發(fā)物質(zhì)成分。吳婷婷等[25]發(fā)現(xiàn)在茶樹單作和花生+茶樹間作模式中，醛類和脂類化合物是茶樹總揮發(fā)物的主要組成部分，主要起著趨避害蟲和引誘天敵的作用。醇、醛、酯類是不同杜仲無(wú)性系枝皮的主要揮發(fā)化合物，可能在趨避植食性昆蟲防御中發(fā)揮著主要作用，有待進(jìn)一步研究。異植物醇是由四個(gè)異戊二烯分子首尾相接而構(gòu)成的雙萜類的二十碳不飽和烯叔醇，是生產(chǎn)維生素E的主要原料，萜類物質(zhì)異植物醇在無(wú)性系EU2、EU5以及EU8中相對(duì)含量均最高，且存在四氫香葉醇、乙基芳樟醇、橙花醇和葎草烯等萜烯類揮發(fā)物，具有抗炎、抑菌和抗腫瘤等藥理[26]，這對(duì)于杜仲枝皮進(jìn)一步藥用價(jià)值開發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。

監(jiān)督方法是用來(lái)探索完全未知數(shù)據(jù)特征的方法，根據(jù)樣本特性對(duì)原始數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分類，將具有相似特征的目標(biāo)數(shù)據(jù)歸在同源的類中，并使用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來(lái)，目前常見的無(wú)監(jiān)督方法有聚類分析和主成分分析等[27]。本文利用UPLC測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，將杜仲8個(gè)無(wú)性系分為3個(gè)組別，主成分分析提取出3個(gè)主成分，其中在第一維度上環(huán)烯醚萜類物質(zhì)京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷貢獻(xiàn)最大。并通過PLS-DA模型對(duì)杜仲枝皮揮發(fā)物質(zhì)成分在不同無(wú)性系之間的差異作進(jìn)一步分析，篩選出22種揮發(fā)性物質(zhì)可將其作為差異揮發(fā)成分，主要為酯類揮發(fā)性成分。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸等環(huán)烯醚萜類物質(zhì)是葉用林杜仲枝皮中主要次生代謝物質(zhì)，且其合成前體是香葉醇等單萜類物質(zhì)，因此，下一步可以考慮利用GC-MS技術(shù)進(jìn)行杜仲枝皮萜烯類揮發(fā)物的靶向代謝組分析。此外，杜仲在幼年期均表現(xiàn)為相同的樹皮特征，顏色呈青灰色，不開裂，皮孔顯著，沒有可以識(shí)別的形態(tài)特征[7]，后期可將傅里葉變換紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于葉用林模式下不同無(wú)性系杜仲皮的快速區(qū)分。