于聰聰，姚玉陽(yáng)，耿雪營(yíng)， 苗啟明，郭俊霞，張艷貞，米生權(quán)*

1北京聯(lián)合大學(xué)健康與環(huán)境學(xué)院；2北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品(北京市)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

2型糖尿病(T2DM)是以餐后高血糖為特征的慢性代謝類疾病，其碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝異常，導(dǎo)致血糖水平失控[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠抑制餐后葡萄糖峰值，延緩碳水化合物的消化，減少葡萄糖水平的吸收[2,3]。α-淀粉酶抑制劑可作為碳水化合物的阻滯劑，限制胃腸道飲食的消化率，減少碳水化合物的攝入和吸收[4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過(guò)可逆占據(jù)酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)，從而減少多糖的降解，延緩腸道對(duì)碳水化合物的吸收，最終達(dá)到降糖作用[5,6]。因此，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑被認(rèn)為是高血糖預(yù)防性治療的有效手段。然而，目前臨床合成α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑僅限于阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，雖然這些抑制劑能夠延緩葡萄糖的吸收，但其在預(yù)防治療過(guò)程中通常都伴有一定的副作用，如腹脹、腹瀉、腹痛等[7,8]。尋求具有更高功效、更少副作用影響的抑制劑成為目前的研究熱點(diǎn)。來(lái)自植物的天然酶抑制劑因其具有較少副作用和較高活性功能而被人們重點(diǎn)關(guān)注。

橡實(shí)是全皮櫟和麻櫟的果實(shí)，廣泛分布于我國(guó)遼寧、河北、陜西等地，因其含有大量鞣質(zhì)而被人們廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)橡實(shí)含多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、纖維素、黃酮類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)等，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抑菌、抗腫瘤和抗衰老作用，能夠降低心血管疾病、糖尿病和微生物感染的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9-12]。本文以全皮櫟野生橡實(shí)為材料，研究其不同極性萃取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，通過(guò)福林酚法、HPLC法和分子對(duì)接技術(shù)追蹤活性組分，推測(cè)橡實(shí)活性組分中的主要活性成分，以期為橡實(shí)降糖功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全皮櫟野生橡實(shí)；α-葡萄糖苷酶(1 kU/13.4 mg)、α-淀粉酶(3700 U/g)、(4-硝基苯基)-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、DNS試劑、阿卡波糖(北京索萊寶科技有限公司)；可溶性淀粉(MW=342.3)、無(wú)水乙醇、色譜級(jí)甲醇、乙酸(鼎國(guó)有限公司)；纖維素酶(10 000 U/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鞣花酸(批號(hào)：B21073)、沒(méi)食子酸(批號(hào)：B20851)、綠原酸(批號(hào)：B20782)、阿魏酸(批號(hào)：B20007)、原兒茶酸(批號(hào)：B21614)、(+)-兒茶素(批號(hào)：B21722)(純度均為HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)。

Y1-050ST型超聲清洗機(jī)(河北德科機(jī)械科技有限公司)；UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東榮豐科技儀器有限公司)，RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；HW-SY11-K型電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)；Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀、Diamonsil C18色譜柱(250 mm × 4.6mm × 5 μm，美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 橡實(shí)不同極性萃取物的制備

將新鮮的橡實(shí)用清水洗凈，用電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)于45 ℃干燥48 h，去殼、去皮，粉碎過(guò)80目篩。

纖維素酶-超聲輔助提取：準(zhǔn)確稱取5.0 g橡實(shí)粉末于三角瓶中，與40%乙醇溶液按料液比1∶20 g/mL混合，加入纖維素酶(4 mg/mL)，pH調(diào)至5，置于超聲波清洗儀中。超聲條件為270 W和30 min。超聲結(jié)束后在100 ℃，水浴5 min，使酶滅活。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后用真空冷凍干燥機(jī)于-50 ℃干燥24 h直至變成粉末狀，密封4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆?，即獲得橡實(shí)粗提物。

不同極性萃取物的制備：將上述粗提物用蒸餾水溶解，按1∶1的比例用石油醚萃取3次，得到石油醚相和水相一。水相一繼續(xù)按以1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相和萃余水相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮各萃取相，最后用真空冷凍干燥機(jī)于-50 ℃干燥24 h直至變成粉末狀，密封4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆?，即獲得石油醚相、乙酸乙酯相、萃余水相。

1.3 不同極性組分對(duì)α-淀粉酶活性的影響

在96孔板中加入50 μL不同濃度的樣品或阿卡波糖(1、2、3、4、5、6、7、8和9 mg/mL)，再加入50 μL的1.5%(W/V)淀粉溶液，37 ℃水浴10 min；再加入10 μL含α-淀粉酶溶液(0.5 mg/mL)的0.02 mol/L PBS緩沖溶液(pH=6.9)，37 ℃水浴10 min；最后加入20 μL DNS試劑，95 ℃水浴8 min，冷卻后用酶標(biāo)儀在540 nm下測(cè)吸光度。用緩沖液代替酶溶液作為空白，用緩沖液代替樣液作為對(duì)照。按公式(1)計(jì)算酶活抑制率及IC50值。

(1)

式中：A1為不含樣品含有酶的吸光度，A2為不含樣品不含酶的吸光度，A3為含有樣品含有酶的吸光度，A4為含有樣品不含酶的吸光度。

1.4 不同極性組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

在96孔板中加入50 μL PBS緩沖液(pH=6.9)、20 μL樣品或阿卡波糖(0、1、2、4、6、8、10、20、30、40、50 μg/mL)、20 μL 4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(5 mmol/L)，在37 ℃反應(yīng)10 min，加入10 μLα-葡萄糖苷酶(0.1 U/mL)，37 ℃再反應(yīng)10 min，加入10 μL 0.02 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)吸光度。用PBS緩沖液(pH=6.9)代替酶溶液作為空白，用PBS緩沖液(pH=6.9)代替樣液作為對(duì)照。按公式(1)計(jì)算酶活抑制率及IC50值。

1.5 多酚含量的測(cè)定

利用Folin-酚試劑比色法測(cè)定總多酚含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液。取6只10 mL容量瓶，精密吸取0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液于10 mL容量瓶中，分別加入20%福林酚試劑1.0 mL，混勻，加入15% Na2CO3溶液2.0 mL，混勻，加水定容、搖勻。反應(yīng)靜置60 min后測(cè)定765 nm處吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程為：Y=6.104 3X+0.008 3(r2=0.995 9)。沒(méi)食子酸在0～10 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

樣品中多酚含量測(cè)定。取0.2 mL樣品試液于10 mL容量瓶中，加入20%福林酚試劑1.0 mL，加5 mL蒸餾水，混勻；加入15% Na2CO3溶液2.0 mL，混勻，加水定容，搖勻。反應(yīng)靜置60 min后測(cè)定765 nm處吸光度值。按公式(2)計(jì)算橡實(shí)各極性組分中的總多酚含量。

(2)

Y：提取物中多酚的含量，mg/g；C：標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品質(zhì)量濃度，μg/mL；V：樣品溶液測(cè)定時(shí)的體積，mL；n：樣品稀釋倍數(shù)；W：測(cè)定樣品質(zhì)量，g。

1.8 HPLC分析條件

Diamonsil-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5.0 μm)；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：B相為0.1%乙酸水溶液，A相為甲醇。梯度洗脫條件：0～10 min，86%B；10～42 min，86%B；42～56 min，60%B；56～70 min，50%B；70～80 min，30%B；80～85 min，86%B。

1.7 分子對(duì)接虛擬篩選

準(zhǔn)備好靶點(diǎn)蛋白(α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)、小分子(沒(méi)食子酸、原兒茶酸、(+)-兒茶素、綠原酸、阿魏酸、鞣花酸)和AutoDockTools.1.5.6軟件。靶點(diǎn)蛋白從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中搜索相應(yīng)的靶點(diǎn)并選取蛋白保存為PDB格式，小分子從PubChem平臺(tái)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找，下載SDF格式。將小分子化合物運(yùn)用Open Babel軟件將SDF格式轉(zhuǎn)化為PDB格式。運(yùn)行AutoDockTools.1.5.6軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等操作，并保存為PDBQT格式，導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 不同極性組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響

橡實(shí)不同極性組分和阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同極性組分對(duì)α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)活性的影響Fig.1 Effect of different polar components on the-amylase (A) and-glucosidase (B) activities

隨著樣品濃度的增加，粗提物、乙酸乙酯相、萃余水相、石油醚相對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率不斷增加。當(dāng)乙酸乙酯相濃度大于4 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶完全被抑制；當(dāng)乙酸乙酯相濃度大于0.015 mg/mL時(shí)，α-葡萄糖苷酶的抑制作用趨于穩(wěn)定。

通過(guò)曲線擬合后得出各極性組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度IC50值如表1所示。

表1 不同極性組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值Table 1 IC50 values of different polar components for α-amylase and α-glucosidase

各極性組分對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制強(qiáng)度依次為乙酸乙酯相>粗提物>阿卡波糖>萃余水相>石油醚相。與阿卡波糖相比，乙酸乙酯相和粗提物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制能力較強(qiáng)，說(shuō)明橡實(shí)中的有效活性成分被富集在了乙酸乙酯相，且其具有較強(qiáng)的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶酶活性抑制效果。

2.2 總酚含量測(cè)定結(jié)果

利用Folin-酚試劑比色法測(cè)得各極性組分總酚含量如表2所示。

結(jié)果顯示，多酚類物質(zhì)在乙酸乙酯相中具有較好的富集效果，且多酚含量與酶抑制活性成正比?？赏茰y(cè)橡實(shí)提取物抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性成分很有可能是多酚類物質(zhì)。

2.3 HPLC含量測(cè)定結(jié)果

6種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖見(jiàn)圖2，回歸方程見(jiàn)表3。依次建立HPLC方法測(cè)定各極性組分中的活性成分，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。乙酸乙酯相的HPLC結(jié)果和6種多酚類物質(zhì)在各極性組分含量比較見(jiàn)圖3。

表2 橡實(shí)不同極性萃取物的總酚含量Table 2 Total phenolic content in acorn with different polar extracts

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖Fig.2 HPLC map of mixed standard solution注：從左到右：沒(méi)食子酸、原兒茶酸、(+)-兒茶素、綠原酸、阿魏酸、鞣花酸。Note:From left to right:gallic acid,procatechin acid,(+) -catechin,chlorogenic acid,ferulic acid,ellagic acid.

表3 6種酚類標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程及線性范圍Table 3 The regression equations and linear ranges of 6 phenolic standards

表4 各極性組分中6種多酚化合物的含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of six polyphenolic compounds in each polar component

由以上數(shù)據(jù)可知，各極性組分中均含有這6種化合物，可能是由于液液萃取不徹底，導(dǎo)致6種化合物存在于各極性組分。另外，乙酸乙酯相中的活性成分含量最高，其對(duì)沒(méi)食子酸、綠原酸和鞣花酸的富集效果最好，含量分別為10.61±0.58、12.84±2.74和500.75± 6.93 mg/g。鞣花酸在各極性組分中的含量最高，是粗提物的10.79倍、石油醚相的21.77倍、萃余水相的50.58倍。乙酸乙酯相中鞣花酸的響應(yīng)值可達(dá)1 000 mAU以上，而其余各成分響應(yīng)值均小于300 mAU。因此，可推測(cè)鞣花酸是乙酸乙酯相中的主要活性成分，且此HPLC方法能夠很好地檢測(cè)鞣花酸的含量。

2.4 分子對(duì)接虛擬篩選結(jié)果

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，乙酸乙酯相中活性成分含量最高，且活性最好。因此，將“2.3”中發(fā)現(xiàn)的乙酸乙酯相富集效果最好的3種化合物作為對(duì)接對(duì)象，分別與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶進(jìn)行對(duì)接打分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞣花酸具有最低結(jié)合能，且通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)只有鞣花酸滿足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18(見(jiàn)表5)。因此可以認(rèn)為鞣花酸與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的結(jié)合作用，是橡實(shí)中有效的活性成分。鞣花酸分別與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的對(duì)接結(jié)果圖見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，鞣花酸與α-淀粉酶中的ARG-20、GLU-78、THR-114氨基酸殘基形成氫鍵，與α-葡萄糖苷酶中的HIS-382、GLN-380、ALA-417、ASP-27氨基酸殘基形成氫鍵，結(jié)合效果好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，進(jìn)一步確定鞣花酸在橡實(shí)提取物活性研究中占有主導(dǎo)地位。

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)植物提取物的藥理活性研究主要集中在抑菌、抗氧化和抗腫瘤等方面。Ayele等[13]收集了6個(gè)不同地點(diǎn)的巴豆植物根，研究發(fā)現(xiàn)其提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)肺炎葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的抑制作用與陽(yáng)性抗生素具有同等效力。Nakamura等[14]使用HPLC在芍藥葉中鑒定出沒(méi)食子酸甲酯、五沒(méi)食子酰葡萄糖和芍藥苷，發(fā)現(xiàn)其均具有抑制口腔鱗狀癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期，表明芍藥葉提取物具有潛在的抗腫瘤作用。除此之外，植物提取物還具有降糖、降脂等功能。橡樹(shù)最早在歐洲被人們研究，法國(guó)橡實(shí)提取物已被申請(qǐng)專利，作為一種特效藥在市場(chǎng)流通[15]。但我國(guó)橡樹(shù)鮮少受到人們的關(guān)注。已有的研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)橡實(shí)提取物具有抑菌、抗氧化和抗腫瘤活性，但其對(duì)降糖作用的研究較少，降糖機(jī)制及降糖成分研究不夠深入[16]。本研究發(fā)現(xiàn)橡實(shí)不同極性萃取物均對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且乙酸乙酯相抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組。其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50分別為1.590±0.073 mg/g、3.927±0.019(×10-3mg/g)。另外，研究獲得橡實(shí)粗提物、乙酸乙酯相、石油醚相、萃余水相中總酚含量分別為402.13±11.79、753.23±32.18、121.62±3.20、252.44±4.00 mg/g，表明橡實(shí)乙酸乙酯相的酶抑制率與多酚含量成正比。這與Pan等[17]的研究結(jié)果一致。

在證實(shí)橡實(shí)乙酸乙酯相中多酚含量最高，且其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)橡實(shí)乙酸乙酯相多酚類單體物質(zhì)，通過(guò)HPLC分析證明乙酸乙酯相中所測(cè)6種多酚化合物含量均高于其他極性組分，且乙酸乙酯相中的鞣花酸含量為500.75±6.93 mg/g，高于其他組分10～50倍，表明乙酸乙酯對(duì)鞣花酸具有較好的富集效果，橡實(shí)乙酸乙酯相中的主要活性成分依然是多酚類物質(zhì)，推測(cè)其酶活性抑制與鞣花酸有關(guān)。這與Ding等的研究結(jié)果一致[18]。最后，本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)分子對(duì)接虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)只有鞣花酸與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有良好的結(jié)合活性，進(jìn)一步驗(yàn)證鞣花酸對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖3 橡實(shí)不同極性萃取物中6種多酚化合物的含量Fig.3 Contents of six polyphenolic compounds in different polar extracts of acorn注：A：乙酸乙酯相的色譜圖；B：不同組分中6種多酚化合物的含量比較。Note:A:Chromatogram of ethyl acetate phase;B:Content comparison of six polyphenolic compounds in different components.

表5 橡實(shí)活性成分與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶對(duì)接打分結(jié)果Table 5 Scoring results for docking of acorn active components with α-amylase and α-glucosidase

圖4 鞣花酸與α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)對(duì)接結(jié)果Fig.4 Docking results of ellagoic acid with α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

鞣花酸是一種具有生物活性的多酚化合物，存在于多種植物類群。在結(jié)構(gòu)上，鞣花酸是六羥基聯(lián)苯酸的二內(nèi)酯，被認(rèn)為是二聚沒(méi)食子酸衍生物[19]。主要通過(guò)鞣花單寧水解產(chǎn)生，鞣花單寧是一種廣泛分布的植物次生代謝物。鞣花酸因其具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗腫瘤、降糖、降脂等生物活性而被廣泛關(guān)注。目前，研究表明鞣花酸能夠在小腸中吸收，未吸收分子被大腸微生物代謝形成尿石素。尿石素可被吸收到血液中并參與全身循環(huán)，最終隨尿液排出，或尿石素在腸細(xì)胞和肝細(xì)胞中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，形成尿石素代謝物[20]。因此，鞣花酸在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的研究意義和開(kāi)發(fā)前景。在降糖方面，植物提取物較合成降糖藥物具有活性高、成本低、副作用少、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[21]。如本研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于阿卡波糖，與Alqahtani等[22]的研究一致。但也有人持相反觀點(diǎn)，如Hbika等[23]研究表明苦艾乙酸乙酯提取物在大鼠體內(nèi)對(duì)腸道α-葡萄糖苷酶沒(méi)有抑制活性。這可能與不同植物種類和提取成分之間存在協(xié)同作用相關(guān)。不同活性物質(zhì)之間具有未知的相互作用，這就需要我們不斷研究，不斷探索。目前，在不影響治療效果的情況下減少合成藥物對(duì)機(jī)體的副作用是治療各種慢性病的挑戰(zhàn)，探索阿卡波糖替代物或與阿卡波糖共同作用物是降糖藥物研究的新方向。因此本研究有望為尋找合成藥物的替代物或共作物奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，橡實(shí)乙酸乙酯萃取相具有潛在的降糖作用。其鞣花酸含量豐富，由于鞣花酸含量可間接量化植物性食物中存在的鞣花單寧，因此本研究表明橡實(shí)材料可作為鞣花單寧的主要來(lái)源。另外，推測(cè)其降糖作用受鞣花酸含量影響，鞣花酸具有作為阿卡波糖替代物或共作物的潛力。