廖緣，曾曉玲，楊婧

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 550004； 2.貴州省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴州 550004)

脆性X綜合征(fragile X syndrome，F(xiàn)XS)是智力障礙和自閉癥譜系障礙的最常見疾病，男性發(fā)生率約為1/5 000，女性發(fā)生率為1/8 000～1/4 000，大多數(shù)FXS患者表現(xiàn)出注意力缺陷多動障礙、癲癇發(fā)作、焦慮和語言延遲等癥狀[1]。FXS的病因主要是脆性X智力障礙1(fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1)基因啟動子區(qū)域的CGG三核苷酸異常重復(fù)擴增，正常人中FMR1基因具有6～44個CGG重復(fù)，前突變患者有55～200個CGG重復(fù)，全突變患者有200個以上的CGG重復(fù)，相對于正常人，CGG重復(fù)增加會使DNA甲基化，導(dǎo)致組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄基因沉默，脆性X智力低下蛋白 (fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)丟失，F(xiàn)MRP缺乏涉及大腦中信使RNA(message RNA，mRNA)代謝的多個方面，被認(rèn)為是FXS表型的直接原因[2]。FXS可采用靶向治療、病因治療和對癥治療，靶向治療會影響涉及FMRP的神經(jīng)生物學(xué)通路，對癥治療主要通過抗精神病藥物對FXS患者的癥狀進行治療，病因治療包括采用染色質(zhì)修飾酶抑制劑、RNA或基因進行定向基因編輯以恢復(fù)FMR1基因表達[3]。目前針對FXS的有效靶向治療進展緩慢，尚無藥物被批準(zhǔn)用于FXS的治療，但在臨床研究中有潛力的治療策略正在研究中，現(xiàn)對這些治療策略進行綜述，以期為FXS的治療提供參考。

1 FMR1基因

FMR1基因包含17個外顯子，長度為38 kb，產(chǎn)生4.4 kb的mRNA，通過選擇性剪接產(chǎn)生12種不同的FMRP，分子量為70 000～80 000[2]。FMR1基因包括甲基化區(qū)、啟動子區(qū)、CGG段和編碼序列，甲基化區(qū)域的邊界位于CGG序列上游650～800個核苷酸處，在FXS中此邊界不明顯，主要因為啟動子和CGG段被甲基化[3]。啟動子包括約56個CpG位點(CpG 島)以及位于CGG序列上游約130個核苷酸的3個啟動子樣序列。多態(tài)性CGG重復(fù)位于外顯子1的5′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，該序列超過200個可導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)識別CpG島，DNMT向CGG序列中的胞嘧啶添加一個甲基，作為異染色質(zhì)化和基因沉默的信號，甲基化的胞嘧啶被甲基化CpG結(jié)合蛋白2識別，CpG結(jié)合蛋白2激活組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)，進而去除甲基化的胞嘧啶附近的組蛋白H3和H4 N端區(qū)域的乙?；?，從而導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚[4]。

2 FXS的治療策略

FMR1基因沉默涉及兩種主要機制：CGG擴增超過200次重復(fù)和表觀遺傳修飾(主要是DNA甲基化)，以上機制會導(dǎo)致FMRP缺失，而FMRP缺失會導(dǎo)致FXS表型。理論上根據(jù)發(fā)生機制可以采用兩種不同的方法治療FXS：①針對由于FMR1缺乏導(dǎo)致的其他信號通路異常進行治療；②恢復(fù)FMR1表達，作用于參與轉(zhuǎn)錄失活的表觀遺傳機制。目前有3個較為有潛力的針對病因的治療方向。第一個治療方向是FMR1基因的藥理學(xué)再激活，這些藥物可影響DNA甲基化和組蛋白修飾；第二個方向是用非編碼RNA治療FXS，盡管目前用非編碼RNA治療仍處于發(fā)展階段，但已經(jīng)顯示出巨大的潛力；第三個方向是基因治療，主要根據(jù)基因組的變化治療FXS。研究表明，對CGG重復(fù)進行靶向基因組的編輯會導(dǎo)致FMR1啟動子DNA完全去甲基化，并隨后重新激活該基因[2]。

2.1基于FMR1基因的治療策略

2.1.1地西他濱 地西他濱是一種去甲基化劑，已被包括美國食品藥品管理局和歐盟委員會在內(nèi)的多個監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療[5]。地西他濱是激活FMR1基因表達的代表藥物，可以抑制DNMT，目前已在人類中鑒定出3種活性DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，地西他濱可以插入到胞苷的位置，與DNMT1以共價鍵不可逆地結(jié)合，并在細(xì)胞分裂過程中導(dǎo)致DNA去甲基化[5]，但地西他濱對基因組DNA的去甲基化作用僅限于特定區(qū)域。經(jīng)地西他濱治療7 d后，重新激活FMR1轉(zhuǎn)錄的效果可持續(xù)1個月，且轉(zhuǎn)錄水平在使用地西他濱后10～15 d達到峰值[6]。高劑量的地西他濱會迅速引起DNA損傷和細(xì)胞毒性，患者可發(fā)生惡心、嘔吐、腹瀉以及中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)[7]，這些不良反應(yīng)極大地限制了地西他濱的使用劑量和治療時間，故限制了地西他濱的應(yīng)用。

2.1.2HDAC抑制劑 在FXS動物模型中，使用DNMT抑制劑進行全身治療會導(dǎo)致組織中FMR1表達增強[8]。HDAC抑制劑具有獨特的結(jié)構(gòu)，針對全突變患者的淋巴母細(xì)胞使用3種可誘導(dǎo)組蛋白過度乙?；乃幬?4-苯基丁酸、丁酸鈉和曲古抑菌素A)進行治療時，F(xiàn)MR1基因被重新激活，與單獨使用地西他濱相比，上述藥物與地西他濱聯(lián)用可使FMR1 mRNA水平提高2～5倍，組蛋白過度乙?；cDNA去甲基化在FMR1基因重新激活過程中具有明顯的協(xié)同作用[9]。經(jīng)美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的HDAC抑制劑，如羅米地辛、伏立諾他等，在FXS細(xì)胞中僅具有較弱的FMR1基因重新激活效果，且僅針對部分細(xì)胞，大部分HDAC抑制劑會誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞毒性，因此HDAC抑制劑不具有作為治療FXS藥物開發(fā)的潛力[10]。

2.2針對非編碼RNA的治療策略 非編碼RNA是一類非蛋白質(zhì)編碼RNA和功能性RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、干擾小RNA等。非編碼RNA參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展。FXS的發(fā)病主要由RNA結(jié)合的FMRP丟失引起[11]。FMRP與神經(jīng)細(xì)胞樹突中的mRNA相互作用，從而調(diào)控突觸的可塑性，并抑制突觸蛋白質(zhì)翻譯。此外，F(xiàn)MRP還參與RNA干擾通路，并通過與不同miRNA相互作用調(diào)節(jié)重要神經(jīng)生物學(xué)通路受體亞基的翻譯[12]，如FMRP與miR-125b相互作用以調(diào)節(jié)N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基的表達，進而影響突觸可塑性；FMRP與miR-125a的相互作用可逆地抑制突觸后密度蛋白-95 mRNA的翻譯，而突觸后密度蛋白-95是谷氨酸受體定位的重要影響因素[13]。RNA干擾過程與組蛋白或DNA甲基化作用之間的關(guān)聯(lián)涉及轉(zhuǎn)錄抑制，其中一些基因的轉(zhuǎn)錄抑制在FXS中較為常見[14]。研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾途徑參與擴展CGG重復(fù)甲基化的過程，miRNA由包含CGG重復(fù)(rCGG)的切割的雙鏈RNA產(chǎn)生，該結(jié)論基于rCGG可由RNase Ⅲ酶切割，且完全突變的CGG重復(fù)在早期胚胎發(fā)育過程中被轉(zhuǎn)錄[15]。此外，Suhl等[16]發(fā)現(xiàn)，1例非完全突變但3′UTR存在突變的患者神經(jīng)細(xì)胞中FMRP表達水平降低，且miR-130b與突變基因中的3′UTR結(jié)合導(dǎo)致FMRP表達降低。在斑馬魚模型中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1轉(zhuǎn)錄本與FMR1-miRNA水平呈負(fù)相關(guān)，在某些條件下，F(xiàn)MR1-miRNA表達的增加可誘導(dǎo)FMR1基因啟動子區(qū)域的DNA高甲基化，導(dǎo)致FMR1基因轉(zhuǎn)錄失活和FMRP表達降低[17]。miR-219和miR-960在果蠅模型中發(fā)現(xiàn)，其中miR-219通過與3′UTR結(jié)合降低FMR1基因表達，表明該miRNA直接參與FXS的發(fā)病[18]。

非編碼RNA(如lncRNA)通路可以影響染色質(zhì)重塑和基因表達過程[19]。lncRNA與許多染色質(zhì)修飾酶相關(guān)，這些酶可以調(diào)控組蛋白或DNA與染色質(zhì)的相互作用，從而影響遺傳信息的表達[19]。在FXS中觀察到多種lncRNA，如FMR4、FMR5、FMR6、反義FMR1等，在這些lncRNA中，F(xiàn)MR6是一種與FMR1外顯子15-17重疊的剪接反義定向lncRNA，可能參與調(diào)節(jié)FMR1基因轉(zhuǎn)錄，且FMR6可能與FMR1 3′UTR中miR-19a和miR-19b的結(jié)合位點重疊，通過miRNA途徑介導(dǎo)FMRP的有效翻譯[20]。

某些非編碼RNA(如干擾小RNA和lncRNA)通過參與染色質(zhì)重塑和DNA甲基化過程調(diào)節(jié)基因的表達和基因組穩(wěn)定性，這些非編碼RNA對研究FXS的治療藥物有指導(dǎo)意義。目前部分針對miRNA的藥物正處于臨床試驗中，如miRNA模擬物、miRNA抑制劑等[21]。由于FMR1基因及其基因產(chǎn)物參與不同的非編碼RNA通路，因此靶向非編碼RNA通路可成為治療FXS的靶標(biāo)。雖然目前尚未開發(fā)出基于miRNA抑制劑的FXS治療方法，且缺少關(guān)于FMR1基因敲除小鼠的實驗數(shù)據(jù)，但由于CGG重復(fù)甲基化和異染色質(zhì)化在FXS發(fā)病機制中的重要作用，因此可以基于非編碼RNA的作用開發(fā)FXS的治療方法。非編碼RNA主要作為FMRP表達的負(fù)調(diào)控因子，通過降低CGG重復(fù)甲基化水平使基因表達正?；襪iRNA抑制劑可通過降低miRNA水平刺激FMRP表達增加[21]。

2.3病毒載體介導(dǎo)的FXS基因治療策略 基因治療是現(xiàn)代生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中最有前途的研究領(lǐng)域之一，這種方法適用于治療由基因組變化導(dǎo)致的無法治愈的疾病?；蛑委熌壳耙驯灰肱R床，諾華公司開發(fā)的Zolgensma于2019年5月獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療脊髓性肌萎縮癥[22]。

研究顯示，在FMR1基因敲除小鼠中提高FMRP的表達可以挽救部分FXS表型缺陷，如大睪丸、焦慮和聽覺反射性癲癇發(fā)作的易感性，將人類FMR1的互補DNA或包含整個FMR1基因的酵母人工染色體引入小鼠可誘導(dǎo)FMRP表達[23-25]。在一項關(guān)于使用含有FMR1編碼序列的重組腺相關(guān)病毒(FMR1-AAV5)的研究中，將FMR1-AAV5載體注射到FMR1基因敲除小鼠的海馬體可以改善小鼠的長期抑郁，而該病癥與突觸可塑性異常有關(guān)[26]。另一項研究將含有神經(jīng)元特異性的突觸蛋白1啟動子的FMR1-AAV9載體注射到5日齡FMR1基因敲除小鼠的側(cè)腦室發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP在多個前腦區(qū)域表達，但在注射部位的遠(yuǎn)側(cè)和尾部區(qū)域未檢測到FMRP的表達，且可逆轉(zhuǎn)小鼠異常的重復(fù)行為，但運動過度、超聲波發(fā)聲和聽覺反射性癲癇等癥狀并未消除[27]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP的表達水平在前腦結(jié)構(gòu)中最高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和尾部等區(qū)域較低[28]。研究顯示，F(xiàn)MR1-AAV9治療逆轉(zhuǎn)了小鼠的焦慮狀態(tài)和聽覺驚嚇反應(yīng)，并部分逆轉(zhuǎn)了運動過度；在生化方面，突觸后密度蛋白-95和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑甲基化CpG結(jié)合蛋白2的表達改善[27]。較高水平的FMRP可改善FMR1基因敲除小鼠的部分癥狀，表明當(dāng)FMRP表達水平是野生型FMRP表達水平的35%～115%時可以治療表型缺陷[28]。

2.4基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術(shù)的基因療法 CRISPR是一類重復(fù)的DNA序列，與CRISPR相關(guān)基因協(xié)同作用，使細(xì)菌獲得抵抗噬菌體和質(zhì)粒DNA的免疫力。在這種免疫反應(yīng)過程中，入侵的DNA首先被切割并整合到CRISPR基因組中，然后該基因組被轉(zhuǎn)錄為單個非編碼前體CRISPR RNA，并進一步加工成成熟的短片段，成熟的短片段最終與內(nèi)切核酸酶Cas9形成核糖核蛋白復(fù)合物，后者識別并切割入侵的DNA。采用CRISPR技術(shù)進行基因編輯是基因治療研究的最新方向，目前已有學(xué)者將CRISPR用于FXS的治療。在體外實驗中，CRISPR技術(shù)導(dǎo)致了具有FMR1基因的完全突變的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)中CGG重復(fù)序列的減少，這些細(xì)胞用編碼Cas9的質(zhì)粒進行電穿孔，并使用單導(dǎo)向RNA(single guide RNA，sgRNA)靶向CGG重復(fù)序列上游的序列末端，在2%～3%完全突變細(xì)胞中CGG重復(fù)序列被完全刪除，且細(xì)胞基因啟動子發(fā)生去甲基化，重新激活FMRP的表達[29]。使用兩個sgRNA靶向三核苷酸重復(fù)上游和下游的序列可以導(dǎo)致約67%CRISPR編輯的雜交克隆系和20%的人類FXS iPSC克隆系基因的重新激活，重新激活的克隆系在啟動子區(qū)域表現(xiàn)出低水平的DNA甲基化，而未激活的細(xì)胞表現(xiàn)出原本的甲基化水平，這可能是由細(xì)胞復(fù)制后不完全再甲基化所導(dǎo)致，因此分裂越活躍的細(xì)胞越有可能表現(xiàn)出有效的FMR1再激活[30]。

失活Cas9-DNA甲基化羥化酶(nuclease-dead mutants of Cas9-tet methylcytosine dioxygenase 1，dCas9-Tet1)是一種編輯工具，包含催化失活的Cas9(dCas9)和Tet1，Tet1是一種誘導(dǎo)胞嘧啶去甲基化的酶，通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)dCas9-Tet1/sgRNA逆轉(zhuǎn)CGG重復(fù)序列的超甲基化，可在體外重新激活iPSC，進而重新激活FMR1的表達，并以最小的脫靶效應(yīng)恢復(fù)iPSC中FMR1啟動子的活性；修復(fù)了iPSC衍生神經(jīng)元的異常電生理表型，移植到小鼠大腦后維持了編輯過的神經(jīng)元中FMR1的表達，且有絲分裂后FXS神經(jīng)元中CGG重復(fù)序列的去甲基化重新激活了FMR1(盡管效率低于FXS iPSC)，并逆轉(zhuǎn)了小鼠的自發(fā)性過度活躍狀態(tài)[29]。通過類似的方法，有學(xué)者將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子VP192融合后在體外導(dǎo)入FXS人類胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞，從而靶向重新激活FMR1基因，雖然這種方法在這些細(xì)胞中實現(xiàn)了較好的轉(zhuǎn)錄再激活效果，但并未觀察到FMRP表達的顯著增加，且與靶向啟動子的sgRNA相比，靶向CGG的sgRNA能夠誘導(dǎo)更高水平的轉(zhuǎn)錄活性[1]。在FXS小鼠模型中進行的首次體內(nèi)基因編輯實驗中，使用金納米粒子將Cas9和Cpf1核酸酶遞送到成年小鼠的大腦以靶向代謝性谷氨酸受體5基因編碼代謝性谷氨酸受體5蛋白，在顱內(nèi)注射編輯工具后，局部紋狀體代謝型谷氨酸受體5水平降低，小鼠的過度重復(fù)行為得到改善[31]。

3 FMR1基因在FXS診斷中的應(yīng)用

FXS的主要病因是位于X染色體(Xq27.3)上的FMR1發(fā)生突變，進而引起表觀遺傳上的修飾改變，導(dǎo)致相應(yīng)的基因功能沉默，造成基因失活，從而引起一系列多系統(tǒng)的機體、行為和智力的改變[2]。FXS患者目前尚缺少針對性、有效的治療方法，針對高危人群進行篩查及診斷是行之有效的方法。FXS癥狀不具有特異性，因此診斷難度較大。目前，男性FXS患者的平均診斷年齡為3歲，女性更晚[32]，早期診斷不僅可以實現(xiàn)早期干預(yù)和治療，還可以減輕家庭壓力。因此，對FXS進行準(zhǔn)確、有效的早期診斷十分重要。

3.1FXS的診斷原理及方法

3.1.1基于FMR1基因突變的檢測 美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院建議，對所有出現(xiàn)精神發(fā)育遲緩、智力障礙和(或)行為問題的個體進行FXS檢測[33]。Southern印跡分析和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)通常用于估計FMR1基因CGG重復(fù)的大小和甲基化，兩種方法聯(lián)合檢測是FXS分子診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。多年來，基于PCR的分析方法得到改進，目前的方法可更精確地估計重復(fù)序列的大小、AGG的中斷和甲基化狀態(tài)，所需樣本量更小，成本效益更高[33]。對于臨床表型提示可能是FXS但CGG擴增呈陰性的個體，測序和多重連接依賴探針擴增等可用于識別拷貝數(shù)變異和單核苷酸差異[34]。在前突變和完全突變的女性攜帶者中，還需要確定影響臨床表型的X-失活率(X染色體失活細(xì)胞的百分比)[35]。

3.1.2定量FMR1 mRNA和FMRP 根據(jù)CGG重復(fù)的大小，未甲基化的等位基因可能會產(chǎn)生部分FMRP，從而導(dǎo)致較輕的FXS表型，同時未甲基化的完全突變等位基因可產(chǎn)生FMR1 mRNA，其與FXS的毒性相關(guān)[36]。因此，測量FMR1的轉(zhuǎn)錄水平和FMRP水平對臨床診斷有幫助，同時兩者也可作為臨床試驗設(shè)計中患者分層的依據(jù)。逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)廣泛用于測量FXS患者外周血和其他細(xì)胞類型中的FMR1 mRNA水平，而高通量測序是測量細(xì)胞裂解液和干血斑中FMRP的高靈敏度檢測方法[36-37]。但這些檢測方法是基于甲基化程度和嵌合現(xiàn)象的組織差異，無法確定外周樣本(如血液和唾液)中測量水平是否能夠準(zhǔn)確反映大腦的水平。

3.2產(chǎn)前診斷 母系遺傳是FXS常見的遺傳模式，但男性攜帶者以及前突變者隱藏的風(fēng)險仍不可忽視，產(chǎn)前篩查是防止FXS患兒出生的第一道防線。當(dāng)孕婦已被證實為FXS攜帶者時，應(yīng)當(dāng)進行產(chǎn)前診斷。在我國，針對FXS的產(chǎn)前診斷遠(yuǎn)低于唐氏篩查，也只有極少數(shù)國家將FMR1基因篩查納入孕婦的常規(guī)檢查[38]。大多數(shù)國家建議針對CGG重復(fù)≥60的孕婦進行產(chǎn)前診斷，產(chǎn)前診斷可于妊娠10～12周進行絨毛活檢或妊娠16～18周進行羊水穿刺，但由于妊娠前3個月FMR1基因甲基化不完全導(dǎo)致Southern印跡分析不易區(qū)分前突變和完全突變，因此還需要在孕中期進行羊水穿刺[39-40]。

4 小 結(jié)

藥理學(xué)治療方法是治療疾病最常見和被普遍接受的方法，但基于分子生物學(xué)的治療方法已經(jīng)被開發(fā)并逐漸進入臨床實踐。FXS基因治療是通過直接編輯CGG重復(fù)序列或傳遞誘導(dǎo)去甲基化的酶治療疾病，基因治療在FMR1基因重新激活方面具有較好的效果。目前，基因編輯在細(xì)胞系和動物模型中效果明顯，部分藥物已進入臨床試驗階段。由于FXS對患者家庭及社會都會產(chǎn)生較大的壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此要加強高危孕婦的產(chǎn)前診斷及咨詢服務(wù)，推廣普及FXS相關(guān)知識，有效降低FXS的發(fā)病率，改善患者的生活質(zhì)量。