周登雙，劉嫚琪，吳子君，吳鏗

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 湛江 524000； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 湛江 524000)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征同時伴有胰島素缺乏和(或)胰島素抵抗的慢性進(jìn)行性代謝性疾病，其中2型糖尿病約占90%，預(yù)測2040年全球有6.42億糖尿病患者，我國已確診的糖尿病患者超過1.164億，約占世界總患病人數(shù)的1/4[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DbCM)是基于糖尿病，除外高血壓、冠心病等疾病引起的心肌病，表現(xiàn)為左心室肥厚和舒張功能減退，伴或不伴有收縮功能障礙。DbCM早期階段已經(jīng)出現(xiàn)心肌細(xì)胞底物代謝變化，線粒體功能異常，誘發(fā)微血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞過度免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致微血管功能障礙，心肌細(xì)胞異常凋亡和間質(zhì)纖維化，引起心功能不全。心肌免疫炎癥反應(yīng)包括固有免疫和適應(yīng)性免疫兩大類，而DbCM的免疫反應(yīng)被認(rèn)為傾向于前者。固有免疫又稱先天免疫，即單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞通過模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式的結(jié)構(gòu)或危險模式信號分子，募集活化后產(chǎn)生的免疫效應(yīng)。干預(yù)這些免疫反應(yīng)將一定程度上減輕微血管炎癥，可能有效地改善糖尿病患者受損的心功能。目前已報道部分黏附分子、趨化因子及其受體、模式識別受體在DbCM中表達(dá)升高，在動物模型體內(nèi)靶向這些分子已經(jīng)顯示出對心臟的保護(hù)作用，但具體作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞尚不明確?，F(xiàn)將近年來干預(yù)固有免疫改善DbCM的研究進(jìn)行歸納整理，為減輕微血管病變以治療DbCM提供更多的依據(jù)。

1 DbCM的病理生理機(jī)制

DbCM的關(guān)鍵病理生理機(jī)制主要分為兩個方面，即局部微血管功能障礙和心肌細(xì)胞自身功能結(jié)構(gòu)的異常。首先，糖尿病患者的心臟葡萄糖利用障礙，其更依賴于長鏈脂肪酸作為能量來源，但脂肪酸氧化因氧耗逐漸增加和微血管供氧障礙而導(dǎo)致效率低下，脂肪酸代謝中間產(chǎn)物累積產(chǎn)生毒性，鈣離子失衡，心肌細(xì)胞收縮及舒張功能障礙且異常凋亡。其次，微循環(huán)障礙是糖尿病的特異并發(fā)癥，其典型改變是微血管基底膜增厚和功能異常。良好的冠狀動脈微循環(huán)在調(diào)節(jié)冠狀動脈血流以及響應(yīng)心臟氧需求方面起著基礎(chǔ)性作用。當(dāng)糖尿病患者心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物攻擊，可出現(xiàn)微血管慢性炎癥，血小板活化聚集[2]，成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)增加，血管周圍纖維化，最終引起冠狀動脈微循環(huán)血流受阻[3]。因此微血管病變可能是糖尿病心肌出現(xiàn)廣泛性壞死的關(guān)鍵病理因素。Rajagopalan等[4]利用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像心肌灌注成像對無冠心病相關(guān)癥狀的糖尿病患者進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)無癥狀糖尿病患者中存在心肌血流灌注缺損的占18%。這提示在糖尿病早期已經(jīng)出現(xiàn)微血管病變，且影響了心肌血流的灌注。也有研究證明，糖尿病患者冠狀動脈血管儲備以及微血管阻力儲備下降[5]。經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)可以改善糖尿病患者冠狀動脈主要分支血流灌注，但難以有效改善其微血管病變。因此，在DbCM早期微血管病變已經(jīng)影響了心肌血流灌注。

2 固有免疫在DbCM中的作用

固有免疫是機(jī)體抵御病原體入侵的首要防線。心臟固有免疫反應(yīng)存在于其豐富的血管和致密的肌肉組織中，其重要組成因素包括危險信號、黏附分子、趨化分子、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和模式識別受體等。糖尿病患者長期的糖脂代謝異常造成持續(xù)的微血管慢性炎癥。AGEs、飽和脂肪酸、游離亞細(xì)胞碎片均可形成危險模式信號，從而啟動糖尿病狀態(tài)下心臟組織的免疫反應(yīng)。飽和脂肪酸或AGEs均可與髓樣分化因子2結(jié)合并激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4引起心肌組織的炎癥反應(yīng)[6]。各種因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞應(yīng)激或損傷后，心臟組織或外周血中炎癥細(xì)胞通過必要的免疫反應(yīng)對凋亡細(xì)胞或失效的亞細(xì)胞器進(jìn)行吞噬并清除，這種適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答對機(jī)體有利。Nicolás-ávila等[7]研究表明，心室肌巨噬細(xì)胞通過受體型酪氨酸激酶信號攝取心肌細(xì)胞廢舊線粒體碎片及亞細(xì)胞器的囊泡，減少炎癥小體激活而維持心臟穩(wěn)態(tài)，而分離這些巨噬細(xì)胞或敲除受體型酪氨酸激酶將導(dǎo)致心臟收縮及舒張功能減退。若刺激持續(xù)存在或刺激強(qiáng)度增大，募集大量外周血來源的免疫細(xì)胞浸潤，甚至正常心肌區(qū)域也出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤，則引起炎癥過度激活，細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積和間質(zhì)纖維化。研究表明，前壁心外膜植入組織工程的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞雙層細(xì)胞片可以減輕1型糖尿病大鼠的微血管功能障礙和心肌間質(zhì)纖維化，血小板分化群CD31陽性密度降低，血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)水平降低[8]，表明改善微血管炎癥是治療DbCM的有效措施。由此可見，過度的固有免疫可能伴隨糖脂代謝紊亂，且貫穿于DbCM發(fā)生發(fā)展過程中。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因,尋求DbCM的有效治療策略十分重要，而改善微血管病變始終是極其重要的治療策略。

3 干預(yù)固有免疫反應(yīng)防治DbCM

固有免疫防御體系一般由組織屏障、固有免疫細(xì)胞和固有免疫分子組成。心臟富含微血管，微血管與心肌細(xì)胞之間上皮或黏膜形成的組織屏障能在感知危險相關(guān)分子模式后較快地啟動免疫細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附并且到達(dá)靶點(diǎn)。而持續(xù)高糖與飽和非酯化脂肪酸的長期刺激造成微血管固有免疫細(xì)胞募集和固有免疫分子表達(dá)，如糖尿病足和糖尿病腎病的組織微血管功能破壞，進(jìn)而導(dǎo)致局部功能逐漸衰退。干預(yù)微血管的固有免疫反應(yīng)可有效減輕微血管病變而治療DbCM。

3.1干預(yù)黏附分子治療DbCM 細(xì)胞黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合和作用的分子，參與細(xì)胞的附著和移動，細(xì)胞的發(fā)育和分化，細(xì)胞的識別活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是免疫應(yīng)答和炎癥發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)。黏附分子在微血管固有免疫反應(yīng)中起到橋接內(nèi)皮細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞的作用。糖尿病患者體內(nèi)血糖升高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)接觸醛糖后發(fā)生糖基化和氧化并生成糖化血紅蛋白，經(jīng)過分子重排形成AGEs,AGEs可與內(nèi)皮細(xì)胞AGEs受體結(jié)合，從而激活核因子κB，誘導(dǎo)多種基因的轉(zhuǎn)錄，如內(nèi)皮素1、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，以招募單核巨噬細(xì)胞等觸發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。高糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增加[10]；另外，糖尿病患者外周血中VCAM-1和中性粒細(xì)胞水平高于健康人[11]，且有并發(fā)癥的糖尿病患者血清中可溶性VCAM-1水平明顯高于無并發(fā)癥患者[12]。注射ICAM-1抗體可減輕血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心室重構(gòu)[13]，但在糖尿病模型體內(nèi)尚未驗(yàn)證。穿心蓮內(nèi)酯和木犀草素均可降低糖尿病小鼠心肌ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平，同時增加左心室射血分?jǐn)?shù)[14-15]。另外，葛根素、白藜蘆醇查爾酮分別降低糖尿病大鼠心肌ICAM-1和VCAM-1密度，并改善心功能[16-17]。但上述4種中草單體是否可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ICAM-1或VCAM-1改善DbCM動物模型的心功能有待進(jìn)一步探討。

3.2干預(yù)趨化因子和趨化因子受體治療DbCM 趨化因子是一類由細(xì)胞分泌的具有誘導(dǎo)附近反應(yīng)細(xì)胞定向趨化能力的細(xì)胞因子或信號蛋白。例如單核細(xì)胞在單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1等作用下由微血管內(nèi)皮遷移至全身組織器官，根據(jù)局部微環(huán)境不同分化發(fā)育為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和旁路活化的M2型巨噬細(xì)胞。人內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖處理24 h后導(dǎo)致MCP-1增加[10]，并促進(jìn)單核細(xì)胞與ECV304細(xì)胞(一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞)間的黏附[18]。對糖尿病患者分離的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行高糖處理后，MCP-1表達(dá)增加40%～70%[19]。MCP-1介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的募集和激活，導(dǎo)致纖維化因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β和骨橋蛋白)的增加[20]，對心肌重構(gòu)發(fā)揮強(qiáng)大的纖維化作用[21]。這些證據(jù)表明高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的MCP-1基因表達(dá)增加，而有趣的是高水平的血漿MCP-1與晚期心力衰竭患者的不良結(jié)局獨(dú)立相關(guān)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1競爭抑制劑可減少炎癥性單核細(xì)胞募集，限制血管新生內(nèi)膜增生[23]?？梢?，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的MCP-1參與了糖尿病心肌炎癥反應(yīng)。有研究報道，姜黃素衍生物、丁香樹脂醇、熊果酸等單體或衍生物可減少糖尿病小鼠心肌炎癥細(xì)胞浸潤并降低MCP-1表達(dá)水平，減輕心臟炎癥反應(yīng)[24-26]。而靶向MCP-1能否通過改善微血管內(nèi)皮功能障礙延緩糖尿病心功能惡化有待進(jìn)一步研究。與趨化因子結(jié)合的CC趨化因子受體2[chemokine (C-C motif) receptor 2,CCR2]和CXC趨化因子受體4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4,CXCR4]均屬于趨化因子受體家族成員，為7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，與相應(yīng)的趨化因子等配體結(jié)合后，啟動胞內(nèi)下游信號通路發(fā)揮效應(yīng)。糖尿病小鼠心肌組織CCR2信使RNA和蛋白水平均明顯升高，敲除CCR2基因可改善心肌纖維化和心功能[27]。CXCR4拮抗劑減少糖尿病小鼠心肌α-平滑肌肌動蛋白標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量，顯著減輕心肌纖維化[28]，且甘草素可降低糖尿病大鼠心肌組織CXCR4蛋白水平，進(jìn)而改善心功能[29]。但CCR2和CXCR4等趨化因子受體與趨化因子的相互結(jié)合是否在冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮調(diào)節(jié)DbCM的免疫作用仍有待證實(shí)。

3.3干預(yù)模式識別受體治療DbCM 模式識別受體廣泛存在于固有免疫細(xì)胞表面、胞內(nèi)器室膜上，分布于組織、血液和胞質(zhì)中，它們能夠直接識別外來病原體及其產(chǎn)物，或發(fā)生畸變、衰老和凋亡細(xì)胞的某些共有特定模式分子結(jié)構(gòu)。固有免疫細(xì)胞可通過模式識別受體結(jié)合病原體及其產(chǎn)物或體內(nèi)靶細(xì)胞表面相關(guān)配體，介導(dǎo)產(chǎn)生非特異性抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，還參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動和效應(yīng)全過程。幾種胞質(zhì)模式識別受體能夠感知病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，導(dǎo)致胱天蛋白酶1的募集和激活，并誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18分泌。清道夫受體CD36、TLR和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)等模式識別受體與DbCM密切相關(guān)。

3.3.1干預(yù)清道夫受體治療DbCM 清道夫受體是一種跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將病原菌或衰老凋亡的細(xì)胞殺傷清除。白細(xì)胞分化抗原CD36是清道夫受體家族成員之一，在單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞上具有免疫學(xué)功能,但在人體內(nèi)僅表達(dá)于血小板上。血小板上的CD36是氧化型低密度脂蛋白的受體，其對氧化型低密度脂蛋白具有很高的親和力。CD36基因敲除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞攝取的氧化型或乙酰化低密度脂蛋白減少75%～90%[30]。也有研究表明，AGEs誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，同時增加CD36的表達(dá)[31]。糖尿病患者的血小板具有高反應(yīng)性，這與AGEs的積累有關(guān)[32]。以上研究提示，清道夫受體CD36可能與糖尿病患者血液中AGEs誘發(fā)的血小板高反應(yīng)性相關(guān)。AGEs通過誘導(dǎo)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞CD36表達(dá)增加而引起血管功能障礙[33]。與正常血糖受試者相比，糖尿病患者中糖基化的CD36表達(dá)水平顯著升高[34]。Zhu等[35]在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白通過CD36的相互作用可誘導(dǎo)血栓形成。AGEs或氧化型低密度脂蛋白激活的CD36誘導(dǎo)血小板活化，隨之微血栓形成，導(dǎo)致糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生。因此，CD36過度激活可能是DbCM冠狀動脈微血管病變的固有免疫反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)之一。研究表明，恩格列凈可減少糖尿病大鼠心臟CD36表達(dá)，降低心臟MCP-1、腫瘤壞死因子-α和IL-6信使RNA水平[36]。由此可見，干預(yù)CD36可能影響糖尿病模型動物冠狀動脈微血管功能而改變心臟功能，但仍需后續(xù)研究證實(shí)。

3.3.2干預(yù)TLR治療DbCM TLR是單個的跨膜非催化性蛋白，可識別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子，是一類參與固有免疫的重要蛋白質(zhì)。TLR可分兩大類，第一類為內(nèi)膜型，如TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR10；第二類為內(nèi)體型，如TLR3、TLR7和TLR9。其中，TLR2、TLR3、TLR4和TLR6主要表達(dá)于心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，并參與炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)在越來越多的研究表明，TLR是糖尿病心肌炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵受體。首先，機(jī)體在長期高糖條件下產(chǎn)生AGEs和非酯化脂肪酸等物質(zhì)作為內(nèi)源性配體激活TLR4，TLR4活化后與髓樣分化因子88的Toll/IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合[37]，使得核因子κB核易位，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[38]，導(dǎo)致IL-6、腫瘤壞死因子-α等表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終引起組織損傷。高糖可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4表達(dá)增加[39]。TLR2激動劑促進(jìn)人血小板聚集和與內(nèi)皮細(xì)胞黏附[40]。研究發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病大鼠主動脈中TLR2與髓樣分化因子88表達(dá)增加，蛋白相互作用增強(qiáng)；與野生型組相比，糖尿病大鼠組主動脈平滑肌細(xì)胞中TLR2表達(dá)升高，血管收縮標(biāo)志物增加[41]。在糖尿病小鼠中激活TLR2導(dǎo)致左心室舒張末期內(nèi)徑和收縮末期內(nèi)徑增大，而TLR2基因敲除糖尿病小鼠心肌中纖維化較DbCM小鼠下降[42]。另外，TLR4基因沉默或抑制可減少糖尿病模型小鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[43]；而尾部靜脈注射TLR4干擾小RNA可減輕糖尿病導(dǎo)致的炎癥介質(zhì)和黏附分子過表達(dá)，改善左心室縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)[44]。研究顯示，人參皂苷和紫檀烯可降低糖尿病大鼠心肌組織TLR4、NLR蛋白(NLR protein,NLRP)3和炎癥介質(zhì)蛋白水平，改善其心功能[45-46]。敲除TLR6可抑制核因子κB的轉(zhuǎn)錄活性，明顯減輕心肌纖維化[47]。Gao等[48]發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)特異性敲除心肌細(xì)胞Yes原癌相關(guān)基因后，大多數(shù)TLR表達(dá)和促炎性細(xì)胞因子分泌增加?？傊?，TLR2、TLR4、TLR6等均有可能在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上參與固有免疫應(yīng)答。

3.3.3干預(yù)NLR治療DbCM NLR是細(xì)胞質(zhì)蛋白家族，是一類重要的胞內(nèi)識別受體。NLR主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。NLRP1、NLRP2和NLRP3為典型的NLRP，一旦激活則磷酸化核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶引起細(xì)胞凋亡。NLRP2基因敲除可抑制糖尿病大鼠心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[49]。激活后的胱天蛋白酶1介導(dǎo)IL-1β前體和IL-18前體切割活化成IL-1β和IL-18并釋放到細(xì)胞外,促使組織細(xì)胞的炎癥壞死[50]。研究證實(shí),高血糖可作為刺激信號,誘導(dǎo)NLRP3的裝配及活化[51]。高糖等外界刺激使活性氧急劇增加,機(jī)體抗氧化的能力相對不足,引起活性氧大量集聚。受損線粒體釋放的線粒體DNA片段和活性氧作為危險信號活化NLRP3[52]。氧化型低密度脂蛋白刺激后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3水平上調(diào)[53]。在糖尿病大鼠心肌勻漿中，IL-1β、NLRP3水平顯著上調(diào)[54]。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌中活化的胱天蛋白酶1和IL-1β水平降低，心肌纖維化減輕，左心室收縮舒張功能障礙減輕[55]。MCC950(一種NLRP3小分子抑制劑)可明顯抑制糖尿病小鼠主動脈粥樣硬化病變，減少炎癥反應(yīng)，改善血管功能[56]。在DbCM模型大鼠心肌中可見NLRP3、胱天蛋白酶1過表達(dá),當(dāng)敲除大鼠NLRP3時,大鼠心肌纖維化減少,心功能明顯改善[57]。有研究發(fā)現(xiàn),沉默糖尿病大鼠心肌細(xì)胞硫氧還蛋白相互作用蛋白可以抑制NLRP3的活化,緩解高糖導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[58]。與NLRP1和NLRP2相比，NLRP3是研究更為廣泛的胞內(nèi)模式識別受體，然而這些受體蛋白在心肌細(xì)胞還是血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)或發(fā)揮作用尚不確定。

4 小 結(jié)

心臟微血管炎癥導(dǎo)致的微循環(huán)障礙是DbCM發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。減輕心臟微血管炎癥在一定程度上可延緩DbCM進(jìn)程。干預(yù)MCP-1、CCR2、CXCR4、TLR和NLR等均可改善實(shí)驗(yàn)性糖尿病動物的心功能。干預(yù)固有免疫的部分環(huán)節(jié)可有效治療DbCM。黏附分子、趨化因子與趨化因子受體、模式識別受體等可表達(dá)于心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞胞膜，而CD36表達(dá)于血小板，它們均參與微血管內(nèi)或血管周圍的固有免疫反應(yīng)。另外，TLR同時在心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞上表達(dá)，而NLR也可以表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞，兩者是否參與心肌細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)尚不清楚。因此，干預(yù)上述固有免疫環(huán)節(jié)是否依賴于改善微血管炎癥治療DbCM有待進(jìn)一步證實(shí)。