陳松鶴,向曉玲,雷 芳,鄒喬生,艾代龍,鄭 亭,黃秀蘭,樊高瓊

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 611130

土壤微生物是影響肥力與質(zhì)量狀況的關(guān)鍵因素[1],對(duì)土壤肥力形成與發(fā)展、植物發(fā)育生長(zhǎng)與保持生態(tài)穩(wěn)定等多個(gè)領(lǐng)域有關(guān)鍵的影響[2—3]。在四川丘陵旱地雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)缺乏,秸稈覆蓋還田由土壤微生物驅(qū)動(dòng)分解釋放養(yǎng)分,提高土壤有機(jī)質(zhì)含量[4]。相較于細(xì)菌,真菌有更強(qiáng)的吸收氮素和磷素及分解土壤中植物殘?bào)w和復(fù)雜化合物的能力[3,5]。因此,研究秸稈覆蓋與氮肥定位施用土壤真菌群落變化及其驅(qū)動(dòng)因素對(duì)提升石灰性紫色土肥力和促進(jìn)小麥生產(chǎn)具有重要意義。

秸稈作為一種有機(jī)肥源富含有機(jī)質(zhì)及各營(yíng)養(yǎng)元素,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛[6]。秸稈還田不僅提高土壤速效養(yǎng)分的含量[4,7],而且為土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供適宜的碳源和氮源[8—9],從而提高了微生物多樣性[8]和改變其群落結(jié)構(gòu)[10]。真菌作為土壤中常見(jiàn)的微生物具有很強(qiáng)的降解復(fù)雜化合物能力[11],在秸稈降解的過(guò)程中,真菌的分解作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)[12]。前人研究表明[13—15],秸稈還田有助于提高真菌群落的豐富度,改變真菌群落結(jié)構(gòu),但也有研究認(rèn)為秸稈還田會(huì)降低真菌Alpha多樣性[16]?；瘜W(xué)氮肥是提高作物產(chǎn)量常用肥料,但長(zhǎng)期施用氮肥會(huì)降低真菌群落多樣性和改變其群落結(jié)構(gòu)[17—18]。此外,目前有關(guān)土壤真菌的研究主要集中在驅(qū)動(dòng)真菌群落結(jié)構(gòu)變化的土壤環(huán)境因素、土壤類型、施肥方式和栽培措施等方面[2,16,19—21]。秸稈覆蓋和施氮對(duì)土壤真菌群落的影響雖有研究[22],但針對(duì)秸稈覆蓋配施氮肥如何影響根際真菌群落結(jié)構(gòu)及促進(jìn)作物生產(chǎn)力研究較少。

本研究基于石灰性紫色土連續(xù)4年秸稈覆蓋與施氮定位試驗(yàn),采用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù),研究真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性對(duì)秸稈覆蓋與施氮的響應(yīng),并結(jié)合土壤養(yǎng)分揭示其驅(qū)動(dòng)因素及與小麥產(chǎn)量的關(guān)系,為石灰性紫色土培肥地力和提高小麥生產(chǎn)力提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

該定位試驗(yàn)于2015年在四川省眉山市仁壽縣珠嘉鎮(zhèn)踏水村(30°04′ N,104°13′ E)進(jìn)行試驗(yàn)地屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候,丘陵地貌,海拔482 m,年均降雨量1009.4 mm,年均氣溫17.4 °C。土壤類型為石灰性紫色土。前茬作物為夏玉米,研究對(duì)象冬小麥為后茬作物。2015年試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)土壤(0—20 cm)基礎(chǔ)肥力：pH 7.82 (土∶水= 1∶2.5),有機(jī)質(zhì)16.9 g/kg,全氮0.83 g/kg,全磷0.86 g/kg,全鉀14.0 g/kg,堿解氮68.2 mg/kg,速效磷9.3 mg/kg,速效鉀158.2 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)采用二因素裂區(qū)設(shè)計(jì),主區(qū)為玉米秸稈粉碎覆蓋(SM)與不覆蓋(NSM)；裂區(qū)為兩種氮水平為：0(N0)和180(N1)kg/hm2,共計(jì)4個(gè)處理,每個(gè)處理均設(shè)4次重復(fù),小區(qū)面積為30 m2(6 m×5 m)。所有試驗(yàn)小區(qū)氮肥為尿素(N 46.2%),磷肥和鉀肥分別為過(guò)磷酸鈣(P2O512%)和氯化鉀(K2O 60%),磷鉀肥用量均為75 kg/hm2。60%的氮與所有磷、鉀肥作為基肥撒施,剩余氮肥于小麥拔節(jié)期作為追肥。于每年8月下旬實(shí)施玉米機(jī)械粉碎均勻撒于試驗(yàn)小區(qū)表面,秸稈粉碎長(zhǎng)度約5 cm,覆蓋量為8 000 kg/hm2。并于2018年10月底免耕開(kāi)溝播種小麥(川麥104),基本苗為2.25×106株/hm2。于2019年5月上旬收獲。其他栽培管理措施同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)。

1.3 樣品采集

于2019年小麥開(kāi)花期采集土壤樣品,此時(shí)期根際效應(yīng)最為強(qiáng)烈[23]。每個(gè)處理采集15株小麥植株,將整株小麥挖出,采用抖根法將附著在根系上的土壤作為根際土,使用冷藏箱將樣品運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,并在-80℃下儲(chǔ)存,直至DNA提取。同時(shí)采用“S”形5點(diǎn)采樣法采集0—20 cm非根際土混為1個(gè)土樣,在室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干,用于土壤養(yǎng)分測(cè)定。于小麥成熟期選定4 m2進(jìn)行小麥產(chǎn)量測(cè)定。

1.4 項(xiàng)目測(cè)定與方法

1.4.1 土壤理化性狀測(cè)定

1.4.2 土壤DNA的提取和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因的高通量測(cè)序

準(zhǔn)確稱取0.5g新鮮土壤使用美國(guó)MOBIO公司生產(chǎn)的Fast DNA Spin Kit for Soil 試劑盒參照說(shuō)明書(shū)提取土壤總DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的純度以及濃度。實(shí)驗(yàn)使用真菌18S引物為ITS5F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′, ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。擴(kuò)增體系為25 μL,主要構(gòu)成為4 μL 5× FastPfu Buffer,2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各0.8 μL(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA,ddH2O進(jìn)行補(bǔ)充至體積。擴(kuò)增條件所設(shè)定的具體參數(shù)是98℃ 預(yù)變性2 min,設(shè)定為98℃持續(xù)變性處理10 s,設(shè)定為55℃進(jìn)行退火處理并持續(xù)30 s,設(shè)定為72℃進(jìn)行延伸處理持續(xù)30 s,持續(xù)30個(gè)循環(huán)。各樣本均進(jìn)行3次重復(fù)的操作,對(duì)同樣本聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行有效混合之后,運(yùn)用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳測(cè)定工作,完成前述操作后進(jìn)行回收擴(kuò)增子的處理。PCR擴(kuò)增物用AgencourtAMPure珠純化(Beckman Coulter,使用PicoGreen dsDNA試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))開(kāi)展定量分析,以同樣濃度進(jìn)行混合處理。采用Illumina 公司 MiSeq 測(cè)序儀完成序列分析(由上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)定)。獲得原始序列后進(jìn)行質(zhì)量控制,在97%序列相似性水平上聚類成可操作的分類單元(OTUs),對(duì)照RDP和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類注釋,獲取對(duì)應(yīng)的真菌分類學(xué)信息。測(cè)序獲得的具體數(shù)據(jù)已傳遞到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù),具體編號(hào)參數(shù)是：SRP346982。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用QIIME2 2019.4 (https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)按照官方教程中的描述處理序列。使用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù),IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行相應(yīng)的雙因素方差分析和相關(guān)分析,采用Fisher氏最小顯著差檢驗(yàn)法(LSD)進(jìn)行平均值顯著性多重比較(P<0.05)?；贐ray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)和冗余分析(RDA)使用R v4.1.0軟件的vegan包進(jìn)行；利用主成分分析(PCA)分析真菌群落與小麥產(chǎn)量的關(guān)系；線性判別分析效應(yīng)量(LEfSe)分析不同條件下微生物群落的特征,以線性判別分析(LDA)值≥ 4.5被認(rèn)為是每個(gè)處理的顯著差異物種。采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈覆蓋與施氮對(duì)小麥產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分的影響

秸稈覆蓋和施氮提高了小麥產(chǎn)量(圖1),差異顯著。秸稈覆蓋處理較不覆蓋處理小麥產(chǎn)量增加40.3%。不覆蓋施氮處理(NSMN1)比無(wú)覆蓋不施氮處理(NSMN0)小麥產(chǎn)量顯著提高75%；覆蓋施氮處理(SMN1)較覆蓋不施氮處理(SMN0)小麥產(chǎn)量顯著提高92%。

圖1 秸稈覆蓋與施氮處理下冬小麥產(chǎn)量

表1 秸稈覆蓋與施氮對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

2.2 秸稈覆蓋與施氮對(duì)根際真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知,秸稈覆蓋和施氮對(duì)小麥根際真菌群落豐富度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))均有顯著或極顯著的影響。秸稈覆蓋(SM)相對(duì)無(wú)覆蓋(NSM)處理有利于提高小麥根際真菌群落豐富度與多樣性。無(wú)論秸稈覆蓋與否,施氮處理(N1)與不施氮(N0)處理相比顯著降低了真菌群落豐富度和多樣性；真菌群落豐富度與多樣性以SMN0處理最高。真菌群落以子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)與被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)為所有處理的優(yōu)勢(shì)門(mén)(圖3),其相對(duì)豐度分別為26%—49%、4.61%—26.9%和2.71%—14.5%。SM處理相較NSM處理顯著增加擔(dān)子菌門(mén)和降低被孢霉門(mén)相對(duì)豐度,子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異(表2)。在NSM條件下,施氮顯著增加子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度,擔(dān)子菌門(mén)與被孢霉門(mén)相對(duì)豐度顯著降低,在SM處理中,施氮處理顯著降低子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度,擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加,被孢霉門(mén)的相對(duì)豐度降低,但無(wú)顯著差異。在屬水平上(圖3；表2),SM處理較NSM處理顯著增加了光蓋傘屬(Psilocybe)、彎孢菌屬(Curvularia)和黑孢霉屬(Nigrospora)的相對(duì)豐度,被孢霉屬(Mortierella)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、帚枝霉屬(Sarocladium)、鐮刀菌屬(Fusarium)和柱霉屬(Scytalidium)的相對(duì)豐度顯著降低,蛋白單胞屬(Pyrenochaetopsis)的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。在NSM處理中,施氮處理較不施氮處理顯著增加了球腔菌屬、彎孢菌屬和帚枝霉屬的相對(duì)豐度,顯著降低被孢霉屬和柱霉屬的相對(duì)豐度；在SM處理中施氮?jiǎng)t顯著增加光蓋傘屬、彎孢菌屬、帚枝霉屬和柱霉屬的相對(duì)豐度,顯著降低被孢霉屬的相對(duì)豐度。

圖2 秸稈覆蓋與施氮處理下冬小麥根際真菌群落多樣性

圖3 秸稈覆蓋和施氮處理下小麥根際土壤細(xì)菌群落組成

表2 秸稈覆蓋與施氮處理對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的方差分析

2.3 秸稈覆蓋與施氮對(duì)小麥根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)間差異的影響

采用主坐標(biāo)分析(PCoA),第一、二主坐標(biāo)軸對(duì)相應(yīng)結(jié)構(gòu)變異產(chǎn)生的解釋量為37.8%和22.8%(圖4)。相同處理的4個(gè)重復(fù)之間,得出的實(shí)際距離參數(shù)接近,結(jié)構(gòu)相似度較高。SM處理與NSM處理明顯區(qū)分開(kāi),NSMN0和NSMN1處理在PC1軸上的投影較為接近,SMN1和SMN0處理在PC1軸上的投影與不覆蓋處理兩種施氮水平明顯區(qū)分開(kāi),說(shuō)明秸稈覆蓋還田改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。通過(guò)組間群落差異分析(圖5),SM處理和NSM處理分別有15個(gè)和14個(gè)類群有顯著差異。對(duì)NSM處理起重要作用的是被孢霉屬和根霉屬,SM處理主要是柱霉屬、光蓋傘屬和彎孢菌屬。說(shuō)明秸稈覆蓋和施氮改變了土壤中真菌特征類群。

圖4 秸稈覆蓋與施氮處理下主坐標(biāo)分析

圖5 秸稈覆蓋和施氮肥處理下小麥根際土壤真菌的組間群落差異(LEfSe)分析

2.4 真菌群落與土壤環(huán)境因子及其與產(chǎn)量的關(guān)系

圖6 秸稈覆蓋和施氮肥處理下小麥根際土壤真菌群落和環(huán)境因子的冗余分析(RDA)

圖7 秸稈覆蓋和施氮處理下小麥根際土壤真菌群落與小麥產(chǎn)量的主成分分析

3 討論

3.1 秸稈覆蓋與施氮提高了土壤養(yǎng)分和冬小麥產(chǎn)量

3.2 秸稈覆蓋與施氮優(yōu)化了根際真菌群落結(jié)構(gòu),提高冬小麥生產(chǎn)力

真菌是土壤中重要的分解者,對(duì)土壤中植物殘?bào)w和纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等難降解有機(jī)物具有較強(qiáng)的分解能力[3]和吸收轉(zhuǎn)化氮素的能力[37]。覆蓋處理提高真菌群落多樣性,施氮?jiǎng)t降低真菌群落多樣性,這與秸稈覆蓋后的有機(jī)質(zhì)增加、土壤溫度及濕度等存在非常密切的聯(lián)系[38—39]。本研究中,秸稈覆蓋相比單施氮肥增加了真菌群落的多樣性,從而提高了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。有研究表明[40—41],長(zhǎng)期采用有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施真菌群落以子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)與接合菌門(mén)為主；在本研究中,子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)與被孢霉門(mén)為優(yōu)勢(shì)門(mén),該結(jié)論和之前報(bào)道一致[42]。宋秀麗等[39]研究得出,和旋耕、深松不覆蓋的處理相比,深松與覆蓋處理之后有助于子囊菌門(mén)相對(duì)豐度大幅增加。靳玉婷等[43]在水稻-油菜輪作發(fā)現(xiàn)秸稈還田配施化肥土壤中子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)真菌群落的相對(duì)豐度提高。本試驗(yàn)中,子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度以秸稈覆蓋不施氮處理最高和覆蓋施氮處理最低,覆蓋處理降低被孢霉門(mén)的相對(duì)豐度,擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度增加,說(shuō)明擔(dān)子菌門(mén)更適宜秸稈覆蓋提供的生長(zhǎng)環(huán)境。有研究表明[44],擔(dān)子菌門(mén)是植物凋落物頑固性成分的主要分解者。因此,在秸稈覆蓋條件下?lián)泳T(mén)的相對(duì)豐度增加更有利于秸稈的分解。前人研究表明[15,45],秸稈還田顯著增加彎孢菌屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬的相對(duì)豐度；而本研究中,秸稈覆蓋增加了光蓋傘屬、彎孢菌屬和黑孢霉屬的相對(duì)豐度。光蓋傘屬、彎孢菌屬和黑孢霉屬具有降解木質(zhì)素和纖維素的功能[46—48],說(shuō)明此類真菌菌屬在秸稈覆蓋下相對(duì)豐度增加利于秸稈分解,促進(jìn)養(yǎng)分釋放。

4 結(jié)論