陳松鶴,向曉玲,雷 芳,鄒喬生,艾代龍,鄭 亭,黃秀蘭,樊高瓊

四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室, 成都 611130

土壤微生物是影響肥力與質(zhì)量狀況的關鍵因素[1],對土壤肥力形成與發(fā)展、植物發(fā)育生長與保持生態(tài)穩(wěn)定等多個領域有關鍵的影響[2—3]。在四川丘陵旱地雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)土壤有機質(zhì)缺乏,秸稈覆蓋還田由土壤微生物驅(qū)動分解釋放養(yǎng)分,提高土壤有機質(zhì)含量[4]。相較于細菌,真菌有更強的吸收氮素和磷素及分解土壤中植物殘體和復雜化合物的能力[3,5]。因此,研究秸稈覆蓋與氮肥定位施用土壤真菌群落變化及其驅(qū)動因素對提升石灰性紫色土肥力和促進小麥生產(chǎn)具有重要意義。

秸稈作為一種有機肥源富含有機質(zhì)及各營養(yǎng)元素,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用較為廣泛[6]。秸稈還田不僅提高土壤速效養(yǎng)分的含量[4,7],而且為土壤微生物的生長和繁殖提供適宜的碳源和氮源[8—9],從而提高了微生物多樣性[8]和改變其群落結(jié)構(gòu)[10]。真菌作為土壤中常見的微生物具有很強的降解復雜化合物能力[11],在秸稈降解的過程中,真菌的分解作用占據(jù)優(yōu)勢[12]。前人研究表明[13—15],秸稈還田有助于提高真菌群落的豐富度,改變真菌群落結(jié)構(gòu),但也有研究認為秸稈還田會降低真菌Alpha多樣性[16]?；瘜W氮肥是提高作物產(chǎn)量常用肥料,但長期施用氮肥會降低真菌群落多樣性和改變其群落結(jié)構(gòu)[17—18]。此外,目前有關土壤真菌的研究主要集中在驅(qū)動真菌群落結(jié)構(gòu)變化的土壤環(huán)境因素、土壤類型、施肥方式和栽培措施等方面[2,16,19—21]。秸稈覆蓋和施氮對土壤真菌群落的影響雖有研究[22],但針對秸稈覆蓋配施氮肥如何影響根際真菌群落結(jié)構(gòu)及促進作物生產(chǎn)力研究較少。

本研究基于石灰性紫色土連續(xù)4年秸稈覆蓋與施氮定位試驗,采用Illumina Miseq測序技術,研究真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性對秸稈覆蓋與施氮的響應,并結(jié)合土壤養(yǎng)分揭示其驅(qū)動因素及與小麥產(chǎn)量的關系,為石灰性紫色土培肥地力和提高小麥生產(chǎn)力提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

該定位試驗于2015年在四川省眉山市仁壽縣珠嘉鎮(zhèn)踏水村(30°04′ N,104°13′ E)進行試驗地屬亞熱帶季風濕潤氣候,丘陵地貌,海拔482 m,年均降雨量1009.4 mm,年均氣溫17.4 °C。土壤類型為石灰性紫色土。前茬作物為夏玉米,研究對象冬小麥為后茬作物。2015年試驗開始時土壤(0—20 cm)基礎肥力：pH 7.82 (土∶水= 1∶2.5),有機質(zhì)16.9 g/kg,全氮0.83 g/kg,全磷0.86 g/kg,全鉀14.0 g/kg,堿解氮68.2 mg/kg,速效磷9.3 mg/kg,速效鉀158.2 mg/kg。

1.2 試驗設計與方法

試驗采用二因素裂區(qū)設計,主區(qū)為玉米秸稈粉碎覆蓋(SM)與不覆蓋(NSM)；裂區(qū)為兩種氮水平為：0(N0)和180(N1)kg/hm2,共計4個處理,每個處理均設4次重復,小區(qū)面積為30 m2(6 m×5 m)。所有試驗小區(qū)氮肥為尿素(N 46.2%),磷肥和鉀肥分別為過磷酸鈣(P2O512%)和氯化鉀(K2O 60%),磷鉀肥用量均為75 kg/hm2。60%的氮與所有磷、鉀肥作為基肥撒施,剩余氮肥于小麥拔節(jié)期作為追肥。于每年8月下旬實施玉米機械粉碎均勻撒于試驗小區(qū)表面,秸稈粉碎長度約5 cm,覆蓋量為8 000 kg/hm2。并于2018年10月底免耕開溝播種小麥(川麥104),基本苗為2.25×106株/hm2。于2019年5月上旬收獲。其他栽培管理措施同當?shù)卮筇锷a(chǎn)。

1.3 樣品采集

于2019年小麥開花期采集土壤樣品,此時期根際效應最為強烈[23]。每個處理采集15株小麥植株,將整株小麥挖出,采用抖根法將附著在根系上的土壤作為根際土,使用冷藏箱將樣品運輸至實驗室,并在-80℃下儲存,直至DNA提取。同時采用“S”形5點采樣法采集0—20 cm非根際土混為1個土樣,在室內(nèi)通風處自然風干,用于土壤養(yǎng)分測定。于小麥成熟期選定4 m2進行小麥產(chǎn)量測定。

1.4 項目測定與方法

1.4.1 土壤理化性狀測定

1.4.2 土壤DNA的提取和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因的高通量測序

準確稱取0.5g新鮮土壤使用美國MOBIO公司生產(chǎn)的Fast DNA Spin Kit for Soil 試劑盒參照說明書提取土壤總DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度以及濃度。實驗使用真菌18S引物為ITS5F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′, ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。擴增體系為25 μL,主要構(gòu)成為4 μL 5× FastPfu Buffer,2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各0.8 μL(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA,ddH2O進行補充至體積。擴增條件所設定的具體參數(shù)是98℃ 預變性2 min,設定為98℃持續(xù)變性處理10 s,設定為55℃進行退火處理并持續(xù)30 s,設定為72℃進行延伸處理持續(xù)30 s,持續(xù)30個循環(huán)。各樣本均進行3次重復的操作,對同樣本聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物進行有效混合之后,運用2%瓊脂糖凝膠進行電泳測定工作,完成前述操作后進行回收擴增子的處理。PCR擴增物用AgencourtAMPure珠純化(Beckman Coulter,使用PicoGreen dsDNA試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))開展定量分析,以同樣濃度進行混合處理。采用Illumina 公司 MiSeq 測序儀完成序列分析(由上海派森諾生物科技股份有限公司測定)。獲得原始序列后進行質(zhì)量控制,在97%序列相似性水平上聚類成可操作的分類單元(OTUs),對照RDP和UNITE數(shù)據(jù)庫進行分類注釋,獲取對應的真菌分類學信息。測序獲得的具體數(shù)據(jù)已傳遞到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫,具體編號參數(shù)是：SRP346982。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用QIIME2 2019.4 (https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)按照官方教程中的描述處理序列。使用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù),IBM SPSS Statistics 26進行相應的雙因素方差分析和相關分析,采用Fisher氏最小顯著差檢驗法(LSD)進行平均值顯著性多重比較(P<0.05)。基于Bray-Curtis距離的主坐標分析(PCoA)和冗余分析(RDA)使用R v4.1.0軟件的vegan包進行；利用主成分分析(PCA)分析真菌群落與小麥產(chǎn)量的關系；線性判別分析效應量(LEfSe)分析不同條件下微生物群落的特征,以線性判別分析(LDA)值≥ 4.5被認為是每個處理的顯著差異物種。采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈覆蓋與施氮對小麥產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分的影響

秸稈覆蓋和施氮提高了小麥產(chǎn)量(圖1),差異顯著。秸稈覆蓋處理較不覆蓋處理小麥產(chǎn)量增加40.3%。不覆蓋施氮處理(NSMN1)比無覆蓋不施氮處理(NSMN0)小麥產(chǎn)量顯著提高75%；覆蓋施氮處理(SMN1)較覆蓋不施氮處理(SMN0)小麥產(chǎn)量顯著提高92%。

圖1 秸稈覆蓋與施氮處理下冬小麥產(chǎn)量

表1 秸稈覆蓋與施氮對土壤養(yǎng)分的影響

2.2 秸稈覆蓋與施氮對根際真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知,秸稈覆蓋和施氮對小麥根際真菌群落豐富度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))均有顯著或極顯著的影響。秸稈覆蓋(SM)相對無覆蓋(NSM)處理有利于提高小麥根際真菌群落豐富度與多樣性。無論秸稈覆蓋與否,施氮處理(N1)與不施氮(N0)處理相比顯著降低了真菌群落豐富度和多樣性；真菌群落豐富度與多樣性以SMN0處理最高。真菌群落以子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)與被孢霉門(Mortierellomycota)為所有處理的優(yōu)勢門(圖3),其相對豐度分別為26%—49%、4.61%—26.9%和2.71%—14.5%。SM處理相較NSM處理顯著增加擔子菌門和降低被孢霉門相對豐度,子囊菌門的相對豐度無顯著差異(表2)。在NSM條件下,施氮顯著增加子囊菌門的相對豐度,擔子菌門與被孢霉門相對豐度顯著降低,在SM處理中,施氮處理顯著降低子囊菌門的相對豐度,擔子菌門的相對豐度顯著增加,被孢霉門的相對豐度降低,但無顯著差異。在屬水平上(圖3；表2),SM處理較NSM處理顯著增加了光蓋傘屬(Psilocybe)、彎孢菌屬(Curvularia)和黑孢霉屬(Nigrospora)的相對豐度,被孢霉屬(Mortierella)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、帚枝霉屬(Sarocladium)、鐮刀菌屬(Fusarium)和柱霉屬(Scytalidium)的相對豐度顯著降低,蛋白單胞屬(Pyrenochaetopsis)的相對豐度無顯著差異。在NSM處理中,施氮處理較不施氮處理顯著增加了球腔菌屬、彎孢菌屬和帚枝霉屬的相對豐度,顯著降低被孢霉屬和柱霉屬的相對豐度；在SM處理中施氮則顯著增加光蓋傘屬、彎孢菌屬、帚枝霉屬和柱霉屬的相對豐度,顯著降低被孢霉屬的相對豐度。

圖2 秸稈覆蓋與施氮處理下冬小麥根際真菌群落多樣性

圖3 秸稈覆蓋和施氮處理下小麥根際土壤細菌群落組成

表2 秸稈覆蓋與施氮處理對真菌群落結(jié)構(gòu)的方差分析

2.3 秸稈覆蓋與施氮對小麥根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)間差異的影響

采用主坐標分析(PCoA),第一、二主坐標軸對相應結(jié)構(gòu)變異產(chǎn)生的解釋量為37.8%和22.8%(圖4)。相同處理的4個重復之間,得出的實際距離參數(shù)接近,結(jié)構(gòu)相似度較高。SM處理與NSM處理明顯區(qū)分開,NSMN0和NSMN1處理在PC1軸上的投影較為接近,SMN1和SMN0處理在PC1軸上的投影與不覆蓋處理兩種施氮水平明顯區(qū)分開,說明秸稈覆蓋還田改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。通過組間群落差異分析(圖5),SM處理和NSM處理分別有15個和14個類群有顯著差異。對NSM處理起重要作用的是被孢霉屬和根霉屬,SM處理主要是柱霉屬、光蓋傘屬和彎孢菌屬。說明秸稈覆蓋和施氮改變了土壤中真菌特征類群。

圖4 秸稈覆蓋與施氮處理下主坐標分析

圖5 秸稈覆蓋和施氮肥處理下小麥根際土壤真菌的組間群落差異(LEfSe)分析

2.4 真菌群落與土壤環(huán)境因子及其與產(chǎn)量的關系

圖6 秸稈覆蓋和施氮肥處理下小麥根際土壤真菌群落和環(huán)境因子的冗余分析(RDA)

圖7 秸稈覆蓋和施氮處理下小麥根際土壤真菌群落與小麥產(chǎn)量的主成分分析

3 討論

3.1 秸稈覆蓋與施氮提高了土壤養(yǎng)分和冬小麥產(chǎn)量

3.2 秸稈覆蓋與施氮優(yōu)化了根際真菌群落結(jié)構(gòu),提高冬小麥生產(chǎn)力

真菌是土壤中重要的分解者,對土壤中植物殘體和纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等難降解有機物具有較強的分解能力[3]和吸收轉(zhuǎn)化氮素的能力[37]。覆蓋處理提高真菌群落多樣性,施氮則降低真菌群落多樣性,這與秸稈覆蓋后的有機質(zhì)增加、土壤溫度及濕度等存在非常密切的聯(lián)系[38—39]。本研究中,秸稈覆蓋相比單施氮肥增加了真菌群落的多樣性,從而提高了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。有研究表明[40—41],長期采用有機無機肥配施真菌群落以子囊菌門、擔子菌門與接合菌門為主；在本研究中,子囊菌門、擔子菌門與被孢霉門為優(yōu)勢門,該結(jié)論和之前報道一致[42]。宋秀麗等[39]研究得出,和旋耕、深松不覆蓋的處理相比,深松與覆蓋處理之后有助于子囊菌門相對豐度大幅增加。靳玉婷等[43]在水稻-油菜輪作發(fā)現(xiàn)秸稈還田配施化肥土壤中子囊菌門和擔子菌門真菌群落的相對豐度提高。本試驗中,子囊菌門的相對豐度以秸稈覆蓋不施氮處理最高和覆蓋施氮處理最低,覆蓋處理降低被孢霉門的相對豐度,擔子菌門的相對豐度增加,說明擔子菌門更適宜秸稈覆蓋提供的生長環(huán)境。有研究表明[44],擔子菌門是植物凋落物頑固性成分的主要分解者。因此,在秸稈覆蓋條件下?lián)泳T的相對豐度增加更有利于秸稈的分解。前人研究表明[15,45],秸稈還田顯著增加彎孢菌屬、鐮刀菌屬、被孢霉屬的相對豐度；而本研究中,秸稈覆蓋增加了光蓋傘屬、彎孢菌屬和黑孢霉屬的相對豐度。光蓋傘屬、彎孢菌屬和黑孢霉屬具有降解木質(zhì)素和纖維素的功能[46—48],說明此類真菌菌屬在秸稈覆蓋下相對豐度增加利于秸稈分解,促進養(yǎng)分釋放。

4 結(jié)論