劉小英，吳碧君，張游南，黃飛龍，劉國(guó)強(qiáng)

（莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建莆田 351100）

0 引言

龍眼(Dimocarpus longan)為無(wú)患子科龍眼屬多年生常綠喬木，原產(chǎn)于中國(guó)，分布在中國(guó)西南部、南部、東南部和越南北部[1]。中國(guó)早在2000多年前就開(kāi)始種植龍眼，是全世界最主要的龍眼生產(chǎn)國(guó)，栽培面積最大[2]。福建、廣東、廣西和四川是主產(chǎn)區(qū)，海南、云南、貴州、重慶、臺(tái)灣也有栽培，浙江零星分布[3]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然演化，不同國(guó)家和產(chǎn)區(qū)龍眼種質(zhì)資源間的交流，不可避免產(chǎn)生同種異名、異種同名的混亂情況，給龍眼種質(zhì)資源保存、良種選育、產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大的困難。因而，分析龍眼材料間遺傳多樣性，探討龍眼品種的分類(lèi)研究尤為重要。龍眼的育種研究技術(shù)和分類(lèi)方法先后經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記4個(gè)階段[4]。相較于其他3種分類(lèi)方法，DNA分子標(biāo)記以生物遺傳物質(zhì)多態(tài)性為基礎(chǔ)，不受組織類(lèi)別、發(fā)育時(shí)期、環(huán)境條件等干擾，具有揭示的多態(tài)性更加豐富、信息量大、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在龍眼種質(zhì)資源分類(lèi)中顯示出優(yōu)越性。目前在龍眼上應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)有RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SCOT、SRAP等[2,4]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等[5]于1994年在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子標(biāo)記，具有模板需要量少，產(chǎn)物多態(tài)性豐富，操作簡(jiǎn)單、快速、高效，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，呈孟德?tīng)柺竭z傳等優(yōu)點(diǎn)。目前ISSR在龍眼上的研究主要集中在親緣關(guān)系分析、指紋圖譜構(gòu)建等。洪自同[6]、曾黎輝等[7]通過(guò)ISSR遺傳多樣性分析，能很好的區(qū)分中國(guó)龍眼和泰國(guó)龍眼。袁磊[8]利用ISSR遺傳多樣性分析，將龍荔與其他龍眼材料分開(kāi)。陳虎等[9-10]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，將來(lái)自中國(guó)、越南和泰國(guó)的37份龍眼品種分開(kāi)，認(rèn)為中國(guó)龍眼種質(zhì)遺傳多樣性較高，泰國(guó)和越南較低。朱建華等[11]對(duì)不同生態(tài)類(lèi)型的39份龍眼種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，認(rèn)為ISSR標(biāo)記能揭示材料間較高的遺傳多樣性，且不同生態(tài)類(lèi)型對(duì)龍眼的親緣關(guān)系影響不大。姜帆等[12]采用引物ISSR-13構(gòu)建了12個(gè)龍眼基因型的分子檢索表，認(rèn)為ISSR標(biāo)記能夠用于龍眼品種間指紋圖譜的構(gòu)建。鄭姍等[13]以‘冬寶9號(hào)’、‘高寶’等6份龍眼新品種（品系）與11份主栽品種為試材進(jìn)行ISSR指紋圖譜初步研究，篩選出的引物py-9可將供試龍眼品種（品系）區(qū)分開(kāi)，并以此構(gòu)建龍眼品種（品系）DNA指紋圖譜。為有效鑒別龍眼新品種（品系），鄭姍等[14]利用ISSR分析標(biāo)記分析‘冬寶9號(hào)’、‘高寶’等4個(gè)龍眼新品種（品系）與36個(gè)龍眼品種的遺傳關(guān)系，選用雙引物組合構(gòu)建其DNA指紋圖譜。郭印山等[15]、任鵬榮[16]以‘鳳梨朵’ב大烏圓’F1為作圖群體，構(gòu)建了‘鳳梨朵’和‘大烏圓’的分子遺傳圖譜。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ISSR分子標(biāo)記對(duì)收集的20份龍眼品種（品系）進(jìn)行遺傳多樣性分析，確定供試材料間的親緣關(guān)系，以期為提高龍眼育種效率、育種親本選配提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

20份龍眼種質(zhì)資源均由莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室收集，采集新抽嫩梢的健康葉片，用冰壺保存帶回實(shí)驗(yàn)室，沖洗吸干水分后置于-80℃冰箱中備用。其材料編號(hào)、選育途徑、來(lái)源詳見(jiàn)表1，其中‘晚香’的來(lái)源地不明確。

表1 供試龍眼種質(zhì)資源名稱(chēng)、選育途徑及來(lái)源地

1.2 DNA提取

基因組DNA采用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的磁珠法基因組DNA抽提試劑盒提取，UVmini1240測(cè)定DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，TE緩沖液稀釋DNA至約20 ng/μL，置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物選擇

選用已發(fā)表文獻(xiàn)中的龍眼屬及龍眼相近科屬條帶清晰、多態(tài)性豐富的ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，共選出引物30條，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增總體積50 μL，包括2 ng模板DNA，PCR master mix 25 μL，ISSR 引物 1 μL(10 μmol/L)，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)在Hema9600型基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）中進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火90 s，72℃延伸1.5 min，40個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.6%瓊脂糖凝膠上100 V恒壓電泳2.5 h，4S Red Plus染色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)標(biāo)記統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增圖譜的強(qiáng)帶或清晰弱帶，同一遷移位置按照條帶的有無(wú)分別賦值“1”和“0”，建立0/1矩陣。利用公式計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率P[式(1)]。利用NTSYSpc(2.10)軟件中的DICE法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，按SAHN和UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

式中，k是多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，n為所測(cè)位點(diǎn)總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的擴(kuò)增結(jié)果

從30條ISSR引物中篩選得到擴(kuò)增效果好的11條引物，對(duì)供試的20份龍眼種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增與檢測(cè)（引物UBC873、UBC880的擴(kuò)增結(jié)果如圖1～2所示），共擴(kuò)增出113條DNA片段，其中多態(tài)性片段90條，多態(tài)性比例為79.65%（表2）。

圖1 引物UBC873對(duì)20份龍眼種質(zhì)材料的擴(kuò)增電泳圖譜

圖2 引物UBC880對(duì)20份龍眼種質(zhì)材料的擴(kuò)增電泳圖譜

表2 ISSR實(shí)驗(yàn)引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳相似系數(shù)

通過(guò)NTSYSpc軟件對(duì)20份龍眼種質(zhì)材料間遺傳相似系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果（表3）表明，供試龍眼材料的遺傳相似系數(shù)介于0.5487～0.8673之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.7758。其中8號(hào)材料（‘泉龍223’）和16號(hào)材料（‘松風(fēng)本’）之間的相似系數(shù)最大，為0.8673，15號(hào)材料（‘白皮龍眼’）和20號(hào)材料（‘福晚8號(hào)’）之間的相似系數(shù)最小，為0.5487，說(shuō)明‘泉龍223’與‘松風(fēng)本’的親緣關(guān)系最近，‘白皮龍眼’和‘福晚8號(hào)’的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 20份龍眼種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)表

2.3 聚類(lèi)分析

圖3為20份龍眼種質(zhì)材料的ISSR遺傳關(guān)系聚類(lèi)圖。在遺傳相似系數(shù)0.6642時(shí)，‘白皮龍眼’單為一類(lèi)，其他龍眼材料聚為一類(lèi)，說(shuō)明‘白皮龍眼’與其他龍眼材料的遺傳差異較大。在遺傳相似系數(shù)0.7340時(shí)，20份龍眼材料被分4類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)包括‘水南1號(hào)’、‘泉龍103’、‘泉龍207’、‘泉龍104’、‘泉龍157’、‘泉龍222’、‘泉龍223’、‘松風(fēng)本’、‘石硤’、‘四季蜜’、‘美國(guó)1號(hào)’、‘晚香’、‘美國(guó)2號(hào)’、‘斑葉龍眼’；第Ⅱ類(lèi)包括‘軟枝烏龍嶺’、‘翠香’、‘福晚3號(hào)’、‘福晚8號(hào)’；‘鳳梨穗’、‘白皮龍眼’各自聚為第Ⅲ、Ⅳ類(lèi)。

圖3 20份龍眼種質(zhì)材料的ISSR遺傳關(guān)系聚類(lèi)圖

3 結(jié)論與討論

3.1 供試龍眼材料間的親緣關(guān)系較近

本研究以收集及本所保留的龍眼種質(zhì)資源為研究材料，采用ISSR技術(shù)對(duì)20份龍眼材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，11條ISSR引物共擴(kuò)增出113條條帶，其中多態(tài)性條帶90條，多態(tài)性比例為79.65%。20份龍眼材料的遺傳相似系數(shù)介于0.5487～0.8673之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.7758，供試龍眼材料間的遺傳相似系數(shù)較高，這與大部分供試材料來(lái)自福建，龍眼基因資源比較單一有關(guān)。世界各地最初的龍眼品種均引自中國(guó)，引入外源基因的機(jī)會(huì)少；且龍眼的馴化時(shí)間晚，繁殖多采用實(shí)生播種，缺少遠(yuǎn)緣雜交，因而變異程度不大[17]。

3.2 供試龍眼材料間的遺傳關(guān)系分析

實(shí)驗(yàn)采用ISSR標(biāo)記對(duì)20份龍眼材料進(jìn)行分析，在遺傳相似系數(shù)0.7340時(shí)，可將20份龍眼材料分4類(lèi)：第Ⅰ類(lèi)包含14個(gè)龍眼材料，既有福建省內(nèi)龍眼材料，也有省外及國(guó)外龍眼材料，地理分布較遠(yuǎn)卻聚在一類(lèi)，除與相似系數(shù)取值有關(guān)外，也可能與品種（品系）具有相似的環(huán)境條件，常年的引種以及相近的選育標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。在遺傳相似系數(shù)0.7710時(shí)，第Ⅰ類(lèi)又可分3個(gè)亞類(lèi)，第1亞類(lèi)中除來(lái)自莆田的‘水南1號(hào)’和‘松風(fēng)本’，其余皆是來(lái)自泉州的泉龍系列龍眼；第2亞類(lèi)中的‘石硤’和‘四季蜜’來(lái)自廣西；第3亞類(lèi)中的‘美國(guó)1號(hào)’和‘美國(guó)2號(hào)’，來(lái)源地為美國(guó)夏威夷。這一結(jié)果證實(shí)了ISSR分子標(biāo)記在一定程度上能夠揭示材料的地理分布情況，研究結(jié)果與陳虎[9-10]、鄭珊[13]、張立杰等[18]得出的結(jié)論一致。此外，龍眼的聚類(lèi)結(jié)果可能受親本關(guān)系影響，具有父本‘冬寶9號(hào)’遺傳背景的‘翠香’、‘福晚3號(hào)’、‘福晚8號(hào)’龍眼品種共同聚在第Ⅱ類(lèi)，這與鄭珊等[14]研究結(jié)果一致。來(lái)自廈門(mén)同安的‘鳳梨穗’在本次聚類(lèi)中區(qū)別于大多數(shù)福建品種，獨(dú)自聚為第Ⅲ類(lèi)，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。第Ⅳ類(lèi)僅含‘白皮龍眼’，引自馬來(lái)西亞，熱帶龍眼亞種。經(jīng)莆田市農(nóng)科所工作人員多年田間觀察，‘白皮龍眼’同常規(guī)龍眼品種有較大的生物性狀差異：一年可多次開(kāi)花結(jié)果，果實(shí)近圓形，果皮淡黃色帶褐色網(wǎng)點(diǎn)，果味獨(dú)特。聚類(lèi)圖顯示，該龍眼材料與其他龍眼材料遺傳相似系數(shù)最低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在遺傳相似系數(shù)0.6642處區(qū)別于其他龍眼材料。Yonemoto等[19]采用RAPD標(biāo)記分析來(lái)自美國(guó)、泰國(guó)、中國(guó)、越南、日本、臺(tái)灣、馬來(lái)西亞等7個(gè)地區(qū)的龍眼材料時(shí)，在遺傳相似系數(shù)0.611時(shí)，來(lái)自馬來(lái)西亞的龍眼材料也顯著區(qū)別于其他地區(qū)龍眼材料。筆者認(rèn)為來(lái)自馬來(lái)西亞的龍眼材料具有作為今后龍眼雜交育種重要材料的潛力，可用于提高后代遺傳和變異程度，選育出雜種優(yōu)勢(shì)更強(qiáng)、綜合性狀更好的龍眼新品種。

有報(bào)道認(rèn)為，‘四季蜜’龍眼來(lái)源于泰國(guó)[20]、越南[21]或廣西與越南交接處[22]。彭宏祥等[23]應(yīng)用AFLP的分析結(jié)果表明，‘四季蜜’與廣西‘大烏圓’龍眼親緣關(guān)系較近，陳虎等[9]應(yīng)用ISSR分析認(rèn)為‘四季蜜’與廣西主栽龍眼品種‘石硤’親緣關(guān)系較近。本研究中‘四季蜜’與廣西‘石硤’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.8407，說(shuō)明四季蜜與廣西龍眼品種的起源有較大的關(guān)系，這與陳虎等[9]、彭宏詳?shù)萚23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

4 實(shí)驗(yàn)存在問(wèn)題及今后研究方向

研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)20份龍眼種質(zhì)材料開(kāi)展遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，實(shí)驗(yàn)選定的品種（品系）為近年實(shí)生選育或雜交選育的龍眼品種（品系），因而在聚類(lèi)分析上與已報(bào)道研究缺乏可比性，今后實(shí)驗(yàn)應(yīng)考慮選材的合理性和多樣性。同時(shí)，筆者認(rèn)為ISSR技術(shù)目前在龍眼上的應(yīng)用研究還需持續(xù)深化優(yōu)化，充分應(yīng)用龍眼表型鑒定結(jié)合基因型檢測(cè)技術(shù)，加強(qiáng)ISSR技術(shù)與其他分子標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，以期更好地服務(wù)于龍眼種質(zhì)資源的分類(lèi)、保存、遺傳進(jìn)化研究以及雜交親本的選優(yōu)工作等。