朱韜 陳巧玲 陶革方 黃衛(wèi)平

1.臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）整形美容外科，浙江臺(tái)州 318000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院特需病房，浙江臺(tái)州 317000

瘢痕疙瘩又稱結(jié)締組織增生，是創(chuàng)面愈合過程中膠原合成代謝持續(xù)活躍導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和膠原過度增生的結(jié)果，呈腫瘤樣侵襲性生長(zhǎng)[1]。手術(shù)切除、放療和激素是常用的治療方法，但治療效果差且常伴有復(fù)發(fā)[2]。由于瘢痕疙瘩的發(fā)病病因尚不清楚，因此，迫切需要了解瘢痕疙瘩形成的潛在機(jī)制，以探討新的治療靶點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）在細(xì)胞增殖、分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA 參與瘢痕疙瘩的形成和生長(zhǎng)[3]。此外，miRNA 也被認(rèn)為是一種新型的細(xì)胞過程調(diào)控因子，參與成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，這些均與傷口愈合有關(guān)[4]。例如，過表達(dá)miR-21-5p 可促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts，KFs）的增生和遷移[5]。因此miRNA 在瘢痕疙瘩纖維化中發(fā)揮重要作用，可能成為基因治療的新靶點(diǎn)。miR-203a-5p是一種腫瘤抑制因子，與腫瘤細(xì)胞增生、遷移和侵襲有關(guān)[6]。但關(guān)于miR-203a-5p 在瘢痕疙瘩中的作用和確切分子機(jī)制報(bào)道較少。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）/beclin-1 通路是調(diào)控細(xì)胞自噬凋亡的重要通路，且被證明與KFs的生長(zhǎng)有關(guān)[7]。本研究擬檢測(cè)miR-203a-5p 對(duì)KFs細(xì)胞增生、遷移和凋亡的影響，并探討B(tài)cl-2/beclin-1通路在此過程中的作用，旨在為瘢痕疙瘩的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

KFs 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（天津?yàn)笊镉邢薰綪M1900429）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、miRNA 陰性對(duì)照（miR negative control，miR-NC）（5'-UUCUCCGAACGAACGUGUCAC-3'）、miR-203a-5p 抑制劑（5'-CCCUCCUCCUUGCUUGGGUUG-3'）和miR-203a-5p 模擬（5'-GUGAGGACUCGGGAG GUGGC-3'）（上海吉?jiǎng)P生物公司）；Trizol（美國Invitrogen 公司)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence-PCR，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）試劑盒（瑞士Roche 公司，SC-3187、SC-5490）；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell count kit 8，CCK-8）（美國Amresco 公司）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；RIPA 裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、beclin-1、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ（autophagy related protein light chain 3 Ⅱ microtubule associated protein 1，LC3Ⅱ）、膠原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）、β-actin和HRP 標(biāo)記山羊抗鼠二抗（武漢博士德生物工程公司，批號(hào)：A2140、A0325、A1427、A0208、A1937、A0356、A1358、A2456）；Thermo CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀（美國Thermo公司）；HBS-1096B 酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Real-time PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）；基質(zhì)膠和24 孔Transwell 小室（美國CORNING 科技有限公司）；BD 流式細(xì)胞儀和BIO-RAD 垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司）。

1.2 組織來源

因外傷導(dǎo)致肩部瘢痕疙瘩需手術(shù)切除的10 例瘢痕疙瘩組織離體標(biāo)本及周圍少許正常皮膚組織（購自上海芯超生物科技有限公司），其中男8 例，女2例，年齡22～43 歲，平均（29.25±18.61）歲，所有標(biāo)本取材后立即放入液氮保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)組織中miR-203a-5p和Bcl-2mRNA 表達(dá) 取瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織，剪碎后加入1ml Trizol 進(jìn)行總RNA 的提取，根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA，根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒說明制備20μl 反應(yīng)體系，Real-time PCR 擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性95℃ 5s、預(yù)變性95℃ 30s、擴(kuò)增60℃ 44s、40 個(gè)循環(huán)、采集熒光61℃，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-203a-5p和Bcl-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（以U6 作為內(nèi)對(duì)照）。引物為miR-203a-5p 上游引物：5'-GCGAGCACAGA ATTAATACGAAC-3'，下游引物：5'-GCGAGCACAG AATTAATACGAAC-3'；Bcl-2 上游引物：5'-GACTTC GCCGAGATGTCCAG-3'，下游引物：5'-GTGCAGGT GCCGGCAGG-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3'。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及組別 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)KFs 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、miR-NC 組、miR-203a-5p 抑制劑組和miR-203a-5p 模擬組。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行處理；miR-NC 組、miR-203a-5p 抑制劑組和miR-203a-5p 模擬組按lipofectamine 2000 說明書方法分別將miR-NC、miR-203a-5p 抑制劑和miR-203a-5p 模擬轉(zhuǎn)染到KFs 細(xì)胞，48h 后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將Bcl-2 野生型/突變型（WT/MUT）與miR-203a-5p NC/抑制劑/模擬轉(zhuǎn)染到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KFs 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h 后用雙熒光素酶檢測(cè)試劑分析熒光素酶活性。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 按照1.3.1方法轉(zhuǎn)染KFs 細(xì)胞后接種于96 孔板中，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4h向培養(yǎng)板中加入CCK-8（10μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h，測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增生率[細(xì)胞增生率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白孔A值）/（空白對(duì)照組A值-空白組A值）。

1.3.5 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 按照1.3.1 方法轉(zhuǎn)染KFs 細(xì)胞后接種于Transwell 小室中，小室加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，48h 后取出小室，用甲醛固定10min，然后用結(jié)晶紫染色30min，沖洗干凈后計(jì)數(shù)紫色染色的細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照1.3.1 方法轉(zhuǎn)染KFs 細(xì)胞后接種于6 孔板中，48h 后收獲細(xì)胞，離心棄上清，分別加入5μl 膜聯(lián)蛋白（Annexin V-FITC）與碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.7 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、beclin-1、LC3Ⅱ和collagen Ⅰ蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染KFs細(xì)胞后接種于6 孔板中，48h 后收獲細(xì)胞，離心棄上清，加入RIPA 裂解液100μl，冰上裂解30min 進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，采用BIO-RAD 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳（20μg/孔），切膠、轉(zhuǎn)膜、封膜后將膜與Bcl-2（1:200）、Bax（1:200）、Caspase-3（1:400）、beclin-1（1:300）、LC3Ⅱ（1:500）、collagenⅠ（1:400）和β-actin（1:500）進(jìn)行孵育，4℃過夜，用HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗（1:5000）在室溫下孵育30min，滴加電化學(xué)發(fā)光劑，進(jìn)行顯色，采集圖像進(jìn)行分析（以β-actin 作為內(nèi)對(duì)照）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203a-5p 對(duì)Bcl-2 的靶向調(diào)節(jié)作用

通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（www.Targetscan.org）檢索發(fā)現(xiàn)，miR-203a-5p 與Bcl-2 有潛在的結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)，熒光素酶報(bào)告顯示，轉(zhuǎn)染miR-203a-5p-模擬可明顯降低Bcl-2-WT 的熒光素酶活性，對(duì)Bcl-2-MUT 沒有影響，而miR-203a-5p-抑制劑則表現(xiàn)出相反作用，表明miR-203a-5p 與Bcl-2 存在靶向調(diào)節(jié)作用，見圖1、表1。

圖1 Targetscan 預(yù)測(cè)miR-203a-5p 與Bcl-2 mRNA 的互補(bǔ)配對(duì)系列

表1 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（，n=9）

表1 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.2 miR-203a-5p 和Bcl-2 mRNA 在組織中的表達(dá)

瘢痕疙瘩中 miR-203a-5p 表達(dá)低于正常皮膚[（0.54±0.05）vs.（0.89±0.15）]（t=6.641，P＜0.001）；瘢痕疙瘩中 Bcl-2 mRNA 表達(dá)高于正常皮膚[（1.02±0.17）vs.（0.73±0.08）]（t=4.567，P＜0.001）。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

與對(duì)照組和miR-NC 組比較，miR-203a-5p 抑制劑組增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與對(duì)照組、miR-NC 組和miR-203a-5p抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響（，n=9）

表2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響（，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組和miR-NC 組比較，miR-203a-5p 抑制劑組Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與對(duì)照組、miR-NC 組和miR-203a-5p抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的影響（，n=9）

表3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的影響（，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.5 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組和miR-NC 比較，miR-203a-5p 抑制劑組beclin-1、LC3Ⅱ和collagen Ⅰ蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與對(duì)照組、miR-NC 組和miR-203a-5p 抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組beclin-1、LC3Ⅱ和Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見表4 和圖2。

表4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白的影響（，n=9）

表4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白的影響（，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

圖2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對(duì)KFs 細(xì)胞beclin-1、LC3Ⅱ和collagenⅠ蛋白的影響

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩形成過程中，miRNA 可調(diào)控成纖維細(xì)胞增生、遷移、凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。例如，下調(diào)miR-637 可通過靶向瘢痕疙瘩中的smad3 促進(jìn)增生和轉(zhuǎn)移[8]。瘢痕疙瘩中過量的ECM 成分，如膠原蛋白、纖維凝集素、彈性蛋白及蛋白酶抑制劑，是由KFs 積累所致。KFs 在病理性瘢痕中起重要作用，其增生促進(jìn)顆粒組織形成，導(dǎo)致膠原合成增加[9]。過多的KFs 細(xì)胞增生和KFs細(xì)胞凋亡不足導(dǎo)致瘢痕疙瘩，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步研究瘢痕疙瘩的細(xì)胞和分子機(jī)制可能對(duì)改善瘢痕疙瘩的臨床治療策略至關(guān)重要。MiR-152-5p 通過調(diào)控人KFs 細(xì)胞中smad3 的表達(dá)，抑制增生、遷移，促進(jìn)凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-203a-5p可能作為一種纖維化抑制因子，在瘢痕疙瘩組織中顯著下調(diào)。此外，KFs 細(xì)胞參與了瘢痕疙瘩中ECM（如Collagen）沉積[11]。同時(shí)，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-203a-5p 能顯著降低KFs 細(xì)胞中Collagen Ⅰ表達(dá)，提示miR-203a-5p 過表達(dá)能抑制瘢痕疙瘩的形成，隨后的功能性實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了上述結(jié)果，miR-203a-5p 過表達(dá)能抑制KFs 細(xì)胞增生和遷移，促進(jìn)KFs 細(xì)胞凋亡，抑制miR-203a-5p 表達(dá)則作用相反。然后通過targetscan 分析確定Bcl-2為miR-203a-5p 的潛在靶標(biāo)，熒光素酶報(bào)告證實(shí)了miR-203a-5p 與Bcl-2 存在靶向調(diào)節(jié)作用。

凋亡調(diào)控已被證明在傷口愈合過程中起重要作用，且主要與增生細(xì)胞清除有關(guān)。在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)了凋亡抑制蛋白Bcl-2 的過表達(dá)，加之抗凋亡蛋白Bax 表達(dá)的缺失，可導(dǎo)致瘢痕疙瘩源性KFs 細(xì)胞增生和細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)[12]。Bcl-2拮抗劑的使用部分阻止了腸道KFs細(xì)胞的纖維形成，并降低了轉(zhuǎn)化生子因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)的KFs 細(xì)胞分化相關(guān)因子的表達(dá)，成為克羅恩病相關(guān)纖維化潛在治療的選擇[13]。同時(shí)，miR-30a-5p 過表達(dá)可通過靶向Bcl-2 誘導(dǎo)KFs細(xì)胞凋亡[14]。本研究在瘢痕疙瘩組織中檢測(cè)到Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 模擬后抑制Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)Bax 和Caspase-3 表達(dá)，誘導(dǎo)KFs 細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡常發(fā)生在同一細(xì)胞中，決定細(xì)胞命運(yùn)，KFs 細(xì)胞抗凋亡能力的增強(qiáng)是瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)和侵襲的重要致病機(jī)制[15]。然而，目前關(guān)于KFs細(xì)胞自噬的相關(guān)報(bào)道較少。目前，beclin 1 在自噬領(lǐng)域的研究越來越廣泛。在人類乳腺癌細(xì)胞中，beclin 1隨著自噬體的增加而表達(dá)降低，促進(jìn)細(xì)胞增生。此外，促進(jìn)beclin-1 基因表達(dá)可抑制體外細(xì)胞自噬水平，抑制細(xì)胞增生[16]。最近的研究表明，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 可以抑制自噬，通過BH3 結(jié)構(gòu)域，Bcl-2與beclin 1 結(jié)合形成復(fù)合體，在自噬過程中被破壞[17]。同時(shí)，具有BH3 結(jié)構(gòu)域的Bcl-2 家族成員之間（如Bax）通過與beclin 1 結(jié)合，抑制Bcl-2 與beclin 1結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞自噬[18]。自噬過程中，LC3 結(jié)合體系的形成負(fù)責(zé)囊泡的延伸。LC3 通常由泛素產(chǎn)生，其殘基經(jīng)自噬相關(guān)基因4A（autophagy associated gene 4A，ATG4A）同源物催化作用暴露在囊泡膜表面，并在細(xì)胞質(zhì)中形成LC3Ⅰ[19]。LC3Ⅰ可特異性結(jié)合磷脂酰乙醇胺在囊泡膜表面，最終形成LC3Ⅱ，并與自噬水平呈正相關(guān)。輻射通過下調(diào)自噬相關(guān)誘導(dǎo)因子beclin-1 和阻止LC3Ⅱ的形成來抑制自噬[20]。本研究中，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 模擬后抑制KFs 細(xì)胞中beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白表達(dá)。

綜上所述，miR-203a-5p 在瘢痕疙瘩組織中低表達(dá)，通過基因干擾技術(shù)促進(jìn)miR-203a-5p 表達(dá)能靶向抑制Bcl-2/beclin-1 通路的激活，抑制KFs 細(xì)胞增生和遷移，同時(shí)促進(jìn)KFs 細(xì)胞凋亡。