史文麗，陳慧敏，馬丙祥

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童腦病診療康復(fù)中心，鄭州 450000)

抽動障礙(tic disorder，TD)是一種兒童常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為突然、快速、反復(fù)、非節(jié)律性的運動或發(fā)聲[1]。近年來，本病在全球范圍發(fā)病率逐步上升[2-3]，國內(nèi)最新研究顯示為1%～4%，國際報道約3%，以5～7歲發(fā)病者最多，14～16歲仍有表現(xiàn)，30%～40%可延續(xù)至成人，對學(xué)習(xí)、生活、社交均造成危害[4-5]，由此可見TD不僅僅是一個醫(yī)學(xué)問題，更逐漸成為醫(yī)學(xué)背景下急待解決的社會問題。但目前TD發(fā)病因素及發(fā)病機制不明，故無特效治療藥物，且90%的患者可伴注意缺陷多動障礙、強迫障礙、自閉、焦慮、品行障礙、人格障礙及睡眠障礙等共患病[6-7]，更顯疾病的復(fù)雜性[8-10]，增加治療難度。動物模型是挑戰(zhàn)和驗證病理生理學(xué)假說的重要工具，并且在驗證新的治療方案中扮演重要角色，故關(guān)于TD動物模型的研究可提高對TD的認(rèn)識和研究水平，成為探索神經(jīng)精神系統(tǒng)與TD發(fā)病關(guān)系的關(guān)鍵點。然而，國內(nèi)醫(yī)學(xué)界對TD及其動物模型的認(rèn)知非常有限，為提高通過更精確的動物模型發(fā)現(xiàn)疾病的病因及病機水平及加速新藥研發(fā)進(jìn)程，現(xiàn)對近年國際上TD動物模型的最新研究熱點進(jìn)行闡述及比較。

1 TD動物模型研究的最新熱點

考慮到抽動表型的高度復(fù)雜性，動物方面通常采用哺乳動物，尤其是嚙齒類動物(大鼠、小鼠、倉鼠)，同樣是基于它們具有很高的成本效益和與人類神經(jīng)生物學(xué)高度相似性[11]。構(gòu)建的理想動物模型主要特征：表面有效性(模型行為表現(xiàn)與TD癥狀和體征的類比度)；結(jié)構(gòu)有效性(TD病因、病機與模型中生物學(xué)的一致性)；預(yù)測有效性(模型對藥物的反應(yīng)性與患者的相似性)[12]。

表面有效性可通過觀察抽動行為實現(xiàn)，但由于嚙齒類動物的行為方式與人類截然不同，它會以重復(fù)和適應(yīng)不良的方式復(fù)制有目的的行為，同時因兩者的喉運動結(jié)構(gòu)不同很難判斷是否為發(fā)聲性抽動，且無法復(fù)制先驅(qū)性沖動，故基于此評估方法的動物模型已被證實偏倚性和低可靠性[13]。

預(yù)測有效性可作為表面有效性的補充，但部分患者對任何有效的療法均無反應(yīng)，而研究者迫切通過動物模型和抽動行為驗證療法的反應(yīng)性，因此會降低通過動物獲取不同作用機制新型治療方法的有效性。同時該方法需要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，通過美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第5版中根據(jù)嚴(yán)重程度而并非神經(jīng)生物學(xué)進(jìn)行亞型分類可知目前對TD認(rèn)識不足。故可解釋基于此評估方法動物模型局限性的原因。

結(jié)構(gòu)有效性即基于可遺傳性、易感性確定相對應(yīng)的內(nèi)在表型，主要結(jié)合抽動表型、生物化學(xué)、神經(jīng)解剖、神經(jīng)心理和認(rèn)知特征確定其關(guān)聯(lián)性，尤其在涉及跨物種參數(shù)時(如人和嚙齒類動物)更能可靠及有效地應(yīng)用，故研究甚多。由上背景可見，TD動物模型的國際研究熱點涉及2個：①基于基因變異和環(huán)境因素的動物模型開發(fā)，旨在復(fù)制與病因相關(guān)的關(guān)鍵因素；②通過表面、結(jié)構(gòu)和預(yù)測有效性判斷TD模型的內(nèi)在表型。

2 基因模型

30多年前，TD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)就得到了學(xué)術(shù)界的認(rèn)可[14-16]，基于人群和雙胞胎家庭的研究表明一級親屬患病風(fēng)險顯著增加[17]，8%～57%的父母有抽動病史，同卵雙胞胎的患病一致率為53%～56%，而異卵雙胞胎卻僅有8%。既往認(rèn)為TD是符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因遺傳病，但二代測序檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用很快修正了這一看法，提出TD是一種多基因病，并增加了大量的候選基因[18-20]，但需注意的是并非所有的基因變異都被用來建立有效的臨床前模型。既往公布了第一個全基因組的關(guān)聯(lián)分析，更有學(xué)者希望找到基因型與遺傳方式、遺傳異質(zhì)性、不完全外顯的關(guān)聯(lián)[21]，但數(shù)據(jù)顯示在不到1%的患者中發(fā)現(xiàn)了特定的遺傳異常(包括多態(tài)性和拷貝數(shù)變異)[22-23]，并在此過程中構(gòu)建了相應(yīng)的基因變異小鼠，通過特定的病理生理學(xué)進(jìn)行了模型驗證，故基于基因技術(shù)的TD動物模型應(yīng)運而生。

2.1多巴胺轉(zhuǎn)運體1(dopamine transporter 1,DAT1)基因模型 DAT1基因是編碼突觸多巴胺含量的主要調(diào)節(jié)因子之一。DAT的主要功能是促進(jìn)多巴胺重新攝取到突觸前末端，因此其表達(dá)減少和功能減退會導(dǎo)致紋狀體區(qū)突觸多巴胺水平的顯著提高。既往關(guān)于DAT1與TD遺傳異質(zhì)性關(guān)聯(lián)性的研究表明，DAT1變異是易感性的潛在危險因素，基于行為學(xué)檢測的小鼠研究發(fā)現(xiàn)了刻板行為、過度活動和注意力改變[24]。進(jìn)一步的研究提示，DAT1基因敲除小鼠表現(xiàn)出質(zhì)子泵抑制劑缺陷，此缺陷可被多巴胺D2和5-羥色胺2A血清素受體的拮抗劑以及去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體的阻斷劑抵消，并對多巴胺D1樣受體阻斷劑敏感。動物模型的比較研究表明，與野生型小鼠相比，DAT1缺陷小鼠表現(xiàn)出較低的D1受體表達(dá)和結(jié)合率。DAT1突變體小鼠因內(nèi)在表型與TD最接近，是國際上最早使用且最成熟的基因模型。

2.2單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)基因模型 MAOA是5-羥色胺和去甲腎上腺素代謝的關(guān)鍵酶，在多巴胺降解中起重要的促進(jìn)作用，而MAOA基因敲除的表型特征與TD發(fā)病機制部分吻合。既往研究表明，MAOA基因變異會增加TD的遺傳易感性，人類MAOA無義突變會導(dǎo)致攻擊行為，其啟動子功能性變數(shù)串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性的低活性變異體與攻擊性相關(guān)，這在早期有創(chuàng)傷史的男性中尤為突出。動物模型顯示，MAOA轉(zhuǎn)基因小鼠在環(huán)境和社會加工、自發(fā)攻擊性、挑戰(zhàn)環(huán)境時的不適應(yīng)行為、重復(fù)刻板行為等方面異常[25-26]，對N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受體拮抗劑具有高反應(yīng)性，這與臨床相吻合，故是繼DAT1后又一熱點模型。此外，MAOA基因敲除小鼠的體感皮質(zhì)明顯受損，這將進(jìn)一步為TD患者該區(qū)域的神經(jīng)解剖學(xué)研究提供依據(jù)。

2.3接觸蛋白相關(guān)蛋白樣2(contactin-associated protein-like 2，CNTNAP2)基因模型 CNTNAP2在細(xì)胞黏附途徑和皮質(zhì)發(fā)育中起關(guān)鍵作用，部分家族性TD患者中已確認(rèn)CNTNAP2基因的變異，并且該基因的單核苷酸多態(tài)性變異與腫瘤干細(xì)胞具有關(guān)聯(lián)性[27]。動物實驗已證實，該基因敲除小鼠表現(xiàn)出抽動樣、孤獨癥譜系障礙樣和多動癥表型，并有神經(jīng)元遷移異常、中間神經(jīng)元數(shù)量減少和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動異常，而治療TD臨床療效確切的利培酮可減少模型動物的高度重復(fù)刻板行為。有分子生物學(xué)研究顯示，CNTNAP2基因敲除小鼠紋狀體區(qū)多巴胺釋放水平增加，γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元減少，抑制信號改變，而氟哌啶醇可改善此狀態(tài)[28]，故此模型可從臨床表型、神經(jīng)生化及結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。

2.4SLITRK基因模型 SLIT和NTRK-like均為SLITRK基因家族成員，該家族由6個編碼富含亮氨酸跨膜蛋白的基因組成，參與軸突靶向和神經(jīng)元分化，與皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)回路動態(tài)相關(guān)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的生長。既往研究已證實SLITRK1為家族性TD的一個責(zé)任基因，并與共患病(如強迫癥和拔毛癥)及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)[29]。小鼠動物研究顯示，SLITRK1的過度表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)元生長，而家族的其他成員起到抑制生長作用，SLITRK1基因敲除小鼠顯示出高去甲腎上腺素水平以及焦慮樣癥狀，并對可樂定敏感。而SLITRK5等位基因變異度為零的小鼠紋狀體細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，并表現(xiàn)出過度的自體生長和高度的焦慮樣反應(yīng)，這與眶額皮質(zhì)的過度激活相關(guān)，且對由谷氨酸受體亞單位組成的氟西汀敏感。因此，國際上在研究抽動共患強迫方面常使用此模型。

2.5L-組氨酸脫羧酶(L-histidine decarboxylase，HDC)基因模型 組胺在TD病理生理學(xué)中的作用尚不清楚，但動物實驗已證明該神經(jīng)遞質(zhì)在紋狀體區(qū)多巴胺能傳遞中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。HDC通過促進(jìn)組氨酸轉(zhuǎn)化為組胺，在組胺能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。研究者在家族性TD中發(fā)現(xiàn)了人類發(fā)展中心基因的變異[30]，從而促成HDC基因敲除小鼠模型的制備。該模型動物被驗證可表現(xiàn)出紋狀體區(qū)多巴胺水平的升高以及高度的自發(fā)刻板行為[31]，而這些現(xiàn)象能被多巴胺D2受體阻斷，并能被腦內(nèi)組胺輸注減弱。此外，在該模型中發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白膽固醇缺乏可導(dǎo)致小鼠質(zhì)子泵抑制劑缺乏和大腦D2/D3受體結(jié)合上調(diào)[32]。HDC基因模型的造模目的和應(yīng)用范圍與TD基本重合，是近年國際上在基因模型領(lǐng)域新的研究熱點。

2.6神經(jīng)連接蛋白(neuroligin，NLGN)基因模型 NLGN是突觸后細(xì)胞黏附分子，參與突觸可塑性調(diào)節(jié)，在TD多巴胺能神經(jīng)傳遞的調(diào)控中具有潛在意義。NLGN4基因突變體可編碼神經(jīng)球蛋白-4(一種突觸細(xì)胞黏附蛋白)，一個罕見家族性NLGN4缺失的研究提示該基因與TD和孤獨癥譜系障礙有關(guān)，編碼蛋白被證實與抽動樣行為及早期發(fā)育階段的社會互動缺陷相關(guān)[33]。NLGN基因敲除小鼠模型可表現(xiàn)出獲得性重復(fù)行為，其基礎(chǔ)是對表達(dá)D1受體的神經(jīng)元突觸選擇性損害抑制，但腹側(cè)紋狀體和伏隔核中的D2受體沒有損害[34]。一項基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究已證實，該模型體感皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)興奮性降低[35]，但是否與體感皮質(zhì)變薄有關(guān)仍須進(jìn)一步研究。

2.7SAP90相關(guān)蛋白3(SAP90 associated protein 3，SAPAP3)基因模型 SAPAP3基因編碼突觸后致密區(qū)蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵支架成分，最近的研究強調(diào)該基因是TD和強迫癥的一個候選基因。SAPAP3基因敲除小鼠模型顯示出過度修飾，以及許多功能和神經(jīng)結(jié)構(gòu)異常，通過慢病毒載體或外側(cè)眶上紋狀體回路的光遺傳刺激恢復(fù)該蛋白可改善模型動物的抽動表型[36]。SAPAP3基因模型和SLITRK一樣，是國際上在研究抽動共患病方面常選用的模型。

2.8D1CT-7基因模型 基于鼠遺傳突變株特征的鑒定已顯示該模型與TD相似，其中基于霍亂毒素胞內(nèi)酶亞單位A1與人多巴胺D1受體啟動子連接產(chǎn)生的D1CT-7轉(zhuǎn)基因小鼠目前被認(rèn)為是具有最高表面和預(yù)測有效性的TD模型之一[37]，因為其抽動樣表現(xiàn)對藥物治療有反應(yīng)。另一個是Hoxb8轉(zhuǎn)基因小鼠，表現(xiàn)出皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)和腦干環(huán)投射神經(jīng)元的顯著異常，而這些特征可能與TD及相關(guān)疾病(如拔毛癥)有關(guān)[38-39]。盡管這些模型的行為模式與TD相似，但是結(jié)構(gòu)有效性受到質(zhì)疑，因為目前缺乏這些變異病理生理學(xué)的進(jìn)一步驗證。如D1CT-7轉(zhuǎn)基因小鼠，該突變體可于第3周出現(xiàn)具有性別二型性的抽動樣表現(xiàn)(男性嚴(yán)重且復(fù)雜)、過度活動、跳躍、強迫或其他精神運動異常，以及D1神經(jīng)元亞群的活性長期增強，且對抗精神病藥物敏感。但與表面和預(yù)測有效性相反的是其人工性質(zhì)和解剖定位不確定性，故如何通過質(zhì)子泵抑制劑和基底神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)生物學(xué)改變來評估TD主要內(nèi)在表型中的結(jié)構(gòu)有效性，仍有待于未來進(jìn)一步探索。

3 基于環(huán)境因素暴露的動物模型

基于環(huán)境因素暴露TD動物模型的開發(fā)依賴于兩種互補策略，旨在最大限度地提高結(jié)構(gòu)和病因?qū)W有效性，主要體現(xiàn)：環(huán)境因素的復(fù)制和接觸與TD的高風(fēng)險相關(guān)(如產(chǎn)前或產(chǎn)后早期暴露于壓力或炎癥)[40-41]；通過與個體發(fā)育中涉及的主要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)的藥理學(xué)干預(yù)來模擬TD病理生理學(xué)的特定方面。

3.1基于早期應(yīng)激和產(chǎn)科因素模型 既往流行病學(xué)研究表明，早期暴露于一些關(guān)鍵環(huán)境因素可能在TD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，特別是產(chǎn)前和圍生期有不良事件和(或)應(yīng)激史的患者，發(fā)病風(fēng)險明顯增加[42]。產(chǎn)科因素、母親吸煙與多種精神疾病有關(guān)，目前通過孕期糖尿病、子癇前期、低體重、妊娠出血、孕母營養(yǎng)不良、母體感染、產(chǎn)前壓力等方式已經(jīng)制備了多種多巴胺功能異常的動物模型[43]，試圖復(fù)制導(dǎo)致其后遺癥的病理生理學(xué)機制，并通過動物實驗再次驗證。因為多巴胺能信號的改變，大多數(shù)模型可出現(xiàn)顯著的抽動現(xiàn)象學(xué)癥狀、刻板行為、質(zhì)子泵抑制劑缺乏，但大部分還沒有從TD的角度進(jìn)行專科驗證，故其有效性有待于進(jìn)一步確定。

3.2基于早期神經(jīng)炎癥的模型 神經(jīng)炎癥[特別是產(chǎn)前和(或)產(chǎn)后早期的感染]是文獻(xiàn)記載的最早關(guān)于環(huán)境因素的動物模型，其中最經(jīng)典的是A組β溶血性鏈球菌(group A beta-hemolytic Streptococcus，GABHS)與TD和其他神經(jīng)精神疾病之間的關(guān)系，GABHS抗體的發(fā)現(xiàn)更進(jìn)一步驗證了關(guān)聯(lián)性。將TD患者血清注射到紋狀體后會出現(xiàn)多巴胺水平和多巴胺轉(zhuǎn)運體表達(dá)改變，可導(dǎo)致運動性及發(fā)聲性抽動緩解。故基于TD患者血清和基底神經(jīng)節(jié)中細(xì)胞因子含量變化，研究者已開發(fā)幾種動物模型，目的是再現(xiàn)早期暴露于關(guān)鍵候選細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2和IL-6的相關(guān)表型[44]，如妊娠中期使用IL-2干預(yù)懷孕雌性小鼠會導(dǎo)致行為改變，IL-6干預(yù)會導(dǎo)致質(zhì)子泵抑制劑減少，而兩者可溶性受體的特定亞單位干預(yù)會導(dǎo)致刻板動作的多維度改變。給予患者血清和(或)GABHS抗原后的模型動物與TD神經(jīng)生物學(xué)表型譜具有高度異質(zhì)性[45]，這種可變性可能反映了抗體含量差異，且該模型驗證的再現(xiàn)性差、預(yù)測有效性不確定，故之后的研究提示將GABHS暴露作為獨立病因仍須探究。鉀/鈉超極化激活的環(huán)核苷酸通道4屬于調(diào)節(jié)蒼白球γ-氨基丁酸釋放的通道家族，其編碼基因的多態(tài)性變異與強迫癥和情緒障礙有關(guān)，但一項基于嚙齒動物的基礎(chǔ)研究顯示，使用環(huán)核苷酸通道4干預(yù)可使刻板動作和抽動樣反應(yīng)增加[46]，故環(huán)核苷酸通道4和TD之間的直接聯(lián)系有待于進(jìn)一步研究。

4 不同類型動物模型應(yīng)用

目前越來越多的流行病學(xué)研究及環(huán)境因素暴露的隊研究顯示諸多因素參與TD的發(fā)生及發(fā)展，明確這些因素不僅可指導(dǎo)早期預(yù)防，并且對深一層次研究本病的病理生理及臨床治療有益。國內(nèi)對TD的研究多局限于藥理學(xué)模型[47]，但高度還原TD臨床表型及發(fā)病機制的動物模型是研究本病的第一步。目前國內(nèi)外仍主要使用3種有效性對動物模型進(jìn)行評估[48-49]，基于表面有效性評估因人類與嚙齒類動物跨物種區(qū)別不能完全呈現(xiàn)抽動表型(尤其發(fā)聲性抽動)，基于預(yù)測有效性評估因部分動物對臨床療效確切藥物仍然無效，故限制兩者在實驗研究中的應(yīng)用。隨著目前基因檢測尤其是全基因組的廣泛應(yīng)用，大量疾病的臨床表型與基因型的關(guān)聯(lián)性(即內(nèi)在表型)逐漸確立，故基于基因變異和環(huán)境因素暴露的動物模型因更能體現(xiàn)模型的結(jié)構(gòu)有效性，有助于發(fā)現(xiàn)病理生理學(xué)變化以及內(nèi)在表型，故成為動物模型首推的制備方法。并且除了特定單基因的靶向研究外，目前尚沒有任何一種模型符合預(yù)測有效性。目前，環(huán)境因素暴露展現(xiàn)出較為典型的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化，符合目前研究結(jié)果(即理論假設(shè)的腦結(jié)構(gòu)及功能損傷改變)，對于研究孕期、圍生期及GABHS暴露等相關(guān)病因、病機研究較為符合。其中孕期和圍生期環(huán)境因素暴露模型的子鼠能確切體現(xiàn)多巴胺功能異常的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，更適合發(fā)病因素研究；GABHS暴露的神經(jīng)炎癥模型不僅能體現(xiàn)表面有效性，其腦功能及結(jié)構(gòu)的異常亦符合當(dāng)前的理論假設(shè)，但因?qū)贵w含量要求高和模型復(fù)制性差，限制了其廣泛應(yīng)用?；蜃儺愺w對應(yīng)的是不同的腦功能及腦結(jié)構(gòu)異常，故基于遺傳的基因模型更能明確其造模目的及藥物作用靶點，能夠較好地實現(xiàn)模型的3種有效性評估。

5 小 結(jié)

TD腦功能及結(jié)構(gòu)異常、基因變異都是近年來研究者正在探索的熱點領(lǐng)域，有利于挖掘TD發(fā)病因素及機制、驗證治療方法有效性。雖然當(dāng)前尚沒有完全符合3個基本有效性的理想模型，但基因模型是目前國際上TD動物模型首選及研究熱點，建議結(jié)合研究目的選擇合適的動物模型進(jìn)行制備，除病因?qū)W外的動物實驗可優(yōu)先選擇基因模型，以便更好地推進(jìn)TD的深入研究。而如何與病理生理學(xué)及藥物作用靶點結(jié)合，更精確地進(jìn)行模型制備是要進(jìn)一步解決的問題。