汪潔,蘇麗清,黃淑鈴,林曉婧,鄭燕寧,李玉荷,伊雪

(廈門醫(yī)學(xué)院 a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，b.機能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室，c.呼吸疾病研究所，福建 廈門 361023)

外泌體是一類由細胞釋放的、具有脂質(zhì)雙層膜性結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡。其以細胞外分泌小泡的形式存在，該分泌形式可保護核酸類物質(zhì)在血液中不被降解，增強了腫瘤細胞的治療抵抗，為腫瘤細胞的信號傳遞提供載體和途徑。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類不具有5′端帽子和3′端Poly(A)尾巴，以共價鍵形成的單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，幾乎存在于所有的物種中，且含量豐富。因其3′,5′-磷酸二酯鍵首尾相連，可耐受核酸外切酶降解，其比傳統(tǒng)的線性RNA更具有穩(wěn)定性[1]。circRNA多存在于血液、唾液、尿液等體液中，定位于細胞質(zhì)或儲存于外泌體，且在外泌體中與線性RNA的比例是細胞中的6倍[2]。表明外泌體circRNA有作為癌癥早期診斷與篩查指標的潛能。現(xiàn)主要闡述外泌體circRNA的生物學(xué)功能及在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用，探討外泌體circRNA作為癌癥早期診斷生物標志物的臨床應(yīng)用前景。

1 外泌體概述

外泌體是一類具有脂質(zhì)雙層膜性結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，直徑多為30～150 nm，密度為1.13～1.19 g/ml。最初被認為是細胞中的廢物，以囊泡的形式排出體外，隨著進一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體能夠攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和糖等生物活性分子，并在細胞間傳遞重要信息[3]。外泌體體積微小、性質(zhì)穩(wěn)定，可自由穿過細胞外基質(zhì)、血管壁等，廣泛分布于血液、尿液、乳汁、唾液、腦脊液等體液中[4]。外泌體表面含有四跨膜蛋白家族中的CD9、CD63和CD81、膜聯(lián)蛋白、上皮細胞黏附分子等特殊的膜蛋白，可作為檢測外泌體的特異性標志物。在透射電子顯微鏡下外泌體的形態(tài)為杯托狀或圓盤狀[5]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體在腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和耐藥中起著重要作用[6]。腫瘤細胞分泌的外泌體可使正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，例如前列腺癌來源的外泌體能誘導(dǎo)脂肪干細胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化[7]，乳腺癌來源的外泌體可導(dǎo)致正常細胞中相關(guān)信使RNA(messenger RNA，mRNA)沉默,促進腫瘤的形成[8]；這些均與外泌體轉(zhuǎn)運致癌蛋白、mRNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)相關(guān)。且不同來源的外泌體能促進腫瘤細胞增殖，Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體來源的miR-224-5p的過表達可通過抑制雄激素受體和介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)促進非小細胞肺癌的生長，誘導(dǎo)非小細胞肺癌的增殖。Lin等[10]發(fā)現(xiàn),肝癌細胞分泌的外泌體中高表達的miR-210可轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞中,抑制內(nèi)皮細胞Sma和Mad相關(guān)蛋白4、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子6的表達,促進新生血管生成,提高腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

2 circRNA的生物學(xué)功能及在癌癥中的作用

2.1circRNA的生物學(xué)功能 circRNA是一類具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)且耐受核酸外切酶降解的非編碼RNA，廣泛存在于各種體液中。circRNA可以分為外顯子環(huán)化形成的circRNA、內(nèi)含子環(huán)化形成的circRNA及外顯子-內(nèi)含子circRNA[11]。目前已發(fā)現(xiàn)的circRNA大部分為外顯子circRNA，主要定位于細胞質(zhì)，而內(nèi)含子circRNA和外顯子-內(nèi)含子circRNA主要定位于細胞核。

circRNA主要有4種生物學(xué)功能。①miRNA海綿作用：circRNA含有大量miRNA的結(jié)合位點，可作為miRNA分子海綿與miRNA結(jié)合，阻礙miRNA與mRNA靶點結(jié)合，降低miRNA的活性、抑制miRNA的功能，從而上調(diào)miRNA靶基因的表達，在疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12]。②調(diào)控蛋白結(jié)合：多種RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)參與RNA的剪切、穩(wěn)定性調(diào)控以及mRNA的翻譯。在沒有circRNA時，RBP與mRNA結(jié)合，翻譯大量蛋白質(zhì)。由于circRNA分子序列上包含了特定的RBP結(jié)合位點，circRNA與RBP結(jié)合形成RNA蛋白復(fù)合物，從而抑制特定的RBP功能及親本基因轉(zhuǎn)錄[13]。③翻譯蛋白質(zhì)：circRNA雖然屬于非編碼RNA，但也有部分circRNA可被核糖體翻譯，并編碼多肽，進而行使調(diào)控功能[14]。④調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄：circRNA能夠以RNA-RNA相互作用的方式與U1小核糖核蛋白結(jié)合，其中U1與RNA聚合酶Ⅱ形成復(fù)合物結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子IIH基因上[11]。circRNA通過調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ的活性促進親本基因的表達。已經(jīng)有越來越多的circRNA在生物體中被發(fā)現(xiàn)，它們廣泛地、多樣地、保守地、穩(wěn)定地存在于真核生物中，具有組織特異性、時序特異性和疾病特異性等特征，這些顯著特征是其成為人類疾病生物標志物的前提。

2.2circRNA在癌癥中的作用 circRNA是非編碼RNA網(wǎng)絡(luò)的一顆新星，隨著對circRNA研究的不斷深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多circRNA參與了腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[15-17]。Han等[18]發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_0007874、hsa_circRNA_104135可通過海綿作用與促癌基因miR-9結(jié)合,促進p21的表達，抑制肝癌進展。Chen等[19]研究表明，circRNA NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2基因可通過與胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2、高遷移率族蛋白A2 RNA形成蛋白質(zhì)三元復(fù)合物，穩(wěn)定高遷移率族蛋白A2 mRNA的穩(wěn)定性，促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的進程。Van Der Steen等[20]通過對60例肺癌和非轉(zhuǎn)化細胞系的研究制作了非小細胞肺癌的circRNA圖譜，發(fā)現(xiàn)大量circRNA亞群與細胞增殖相關(guān)。Shangguan等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，外顯子circRNA circSLC25A16可以通過與miR-488-3p/缺氧誘導(dǎo)因子-1α結(jié)合，激活乳酸脫氫酶A，加速糖酵解與非小細胞肺癌細胞增殖。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001783的高表達與乳腺癌的發(fā)生和進展呈正相關(guān)，敲除hsa_circ_001783抑制了乳腺癌細胞的進展，進一步分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001783通過海綿作用與miR-200c-3p結(jié)合，調(diào)控乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。circRNA的顯著特征和它的生物學(xué)功能使其具有成為疾病早期診斷及治療靶點的潛能。

3 外泌體circRNA在癌癥早期診斷的價值及相關(guān)機制

3.1外泌體circRNA在癌癥早期診斷中的價值 Li等[2]已證實人血清外泌體中已鑒定出1 215個完整且穩(wěn)定的circRNA，超過90%由外顯子環(huán)化而來。目前對癌癥的早期篩查主要通過影像學(xué)檢查、腫瘤標志物檢測及手術(shù)穿刺活檢等方法。然而，影像學(xué)檢查存在假陽性高及輻射暴露的缺點；腫瘤標志物檢測具有較低的靈敏度和特異度；通過內(nèi)鏡等手術(shù)或穿刺方法進行組織病理學(xué)檢查的準確率高，但其為有創(chuàng)檢查，易對患者心理和生理造成創(chuàng)傷。外泌體circRNA能否作為一種靈敏、特異、創(chuàng)傷性小、不良反應(yīng)少的癌癥篩查手段是目前研究的重點方向。

外泌體形成過程中circRNA富集的機制尚不清楚。一種可能是circRNA在細胞質(zhì)中豐富并且在其形成期間被動地包含在外泌體中，另一種可能是circRNA從細胞質(zhì)中主動轉(zhuǎn)移到外泌體。circRNA可通過外泌體轉(zhuǎn)移到供體細胞和受體細胞之間作為信使來介導(dǎo)多種信號通路。腫瘤患者與正常健康人群體內(nèi)外泌體circRNA存在差異性表達[23-24]，進一步表明腫瘤細胞來源的差異性外泌體circRNA有作為癌癥檢測生物標志物的潛能。

許多分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于外泌體circRNA的檢測，包括高通量測序、基因芯片、定量聚合酶鏈反應(yīng)等[25-28]。基因芯片主要用于檢測全基因組circRNA，其檢出率非常高。高通量測序技術(shù)對于circRNA的檢測主要是通過反向可變剪切接頭序列，而這些測序片段只占轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)所有測序片段中很少部分，常規(guī)測序深度使許多豐度的circRNA被損失掉，因此高通量測序技術(shù)檢出率較基因芯片技術(shù)低。而定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測circRNA表達與差異分析是對高通量測序、芯片結(jié)果的有效補充和驗證，能有效與線性RNA區(qū)分開來，可檢測包括細胞、組織、血液和外泌體等多種樣本中circRNA差異表達情況。

在消化道腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些異常表達的外泌體circRNA，如結(jié)腸癌患者血漿外泌體hsa_circ_0004071[24]及血清外泌體circRNA同源域相互作用蛋白激酶3基因[29]與正常人相比有明顯的差異性表達，且對結(jié)腸癌的診斷特異度及靈敏度均較高；早期胃癌患者血漿外泌體circ0065149較健康者明顯降低，且其對早期胃癌的診斷特異度及靈敏度均高于傳統(tǒng)的腫瘤標志物，如癌胚抗原、糖類抗原199、糖類抗原125[30]；在胰腺導(dǎo)管癌患者血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)circRNA異亮氨酰轉(zhuǎn)移RNA合成酶(isoleucyl-tRNA synthetase，IARS)基因明顯上調(diào)，且circ-IARS可通過外泌體進入人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)并促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[28]；circ-0000284在膽管癌細胞系、腫瘤組織和血漿外泌體中明顯升高，并且circ-0000284的高表達增強膽管癌細胞在體內(nèi)、體外的遷移、侵襲和增殖能力[31]，提示這些外泌體circRNA可作為消化道腫瘤早期診斷和轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標志物。在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了具有差異性表達的circRNA。如circRNA蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5在膀胱癌患者血清和尿液外泌體中的水平與臨床分期、生存率及腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示circRNA蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因可作為膀胱癌早期診斷及預(yù)后的生物標志物[27]。Xu等[32]從Ⅲ期子宮內(nèi)膜腺癌患者中鑒定出275個差異性表達的circRNA，提示這些差異性表達的外泌體circRNA可能對子宮內(nèi)膜癌的診療具有指導(dǎo)意義。在呼吸系統(tǒng)腫瘤方面，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血漿外泌體中hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346在肺腺癌早期即出現(xiàn)明顯上調(diào)[33]；這些結(jié)果均提示外泌體circRNA有作為癌癥早期診斷候選標志物的潛能。

3.2外泌體circRNA促進癌癥發(fā)生發(fā)展的機制

3.2.1調(diào)控EMT EMT是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，具體表現(xiàn)為上皮細胞極性消失，失去與基底膜的連接，黏附能力下降，喪失上皮相關(guān)表型，同時獲得了間充質(zhì)細胞特性與表型的能力，如遷移、侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力?？沙霈F(xiàn)細胞骨架及相關(guān)基因的改變，如上皮標志物上皮鈣黏素的減少及間質(zhì)標志物神經(jīng)鈣黏素和波形蛋白的表達增加，導(dǎo)致癌細胞間黏附性減弱，易于脫落和轉(zhuǎn)移，增加腫瘤的侵襲和遷移[34]。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)，胃癌外泌體circRNA核受體相互作用蛋白1可作為miR-149-5p的海綿，通過蛋白激酶B1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路促進EMT，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移。Joseph等[36]研究顯示，肝細胞生長因子受體MET途徑可調(diào)節(jié)小泛素樣調(diào)節(jié)劑活化酶E2和circRNA卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域66的表達，誘導(dǎo)表皮生長因子受體耐藥，增加肺腺癌細胞的EMT和轉(zhuǎn)移潛能。

3.2.2調(diào)控血管生成和內(nèi)皮細胞通透性 腫瘤新生血管的形成提供了腫瘤細胞代謝和生長所需的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要原因。腫瘤外泌體circRNA可增加血管內(nèi)皮細胞的形成，誘導(dǎo)新生血管腔的形成，進而促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。Huang等[37]發(fā)現(xiàn)肝癌外泌體circRNA-100338可與miR-141-3p相互作用，并通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，促進HUVECs血管形成能力和肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織和其轉(zhuǎn)移性疾病患者的血漿外泌體中circ-IARS基因表達明顯上調(diào)。在胰腺癌中，circ-IARS通過胰腺癌細胞外泌體進入HUVECs，調(diào)控miR-122的表達，增加大鼠肉瘤病同源家族成員癌基因的活性，上調(diào)纖維狀肌動蛋白的水平，降低了胞質(zhì)緊密連接-1表達，增強內(nèi)皮細胞通透性和局灶性黏附，促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。敲低circ-IARS后，大鼠肉瘤病同源家族成員癌基因活性降低和纖維狀肌動蛋白表達量減少，HUVECs的通透性減弱，癌細胞侵襲能力減弱。

3.2.3調(diào)控腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境指腫瘤細胞生長的細胞環(huán)境，包含多種成分，如腫瘤細胞、生長因子、細胞外基質(zhì)、蛋白酶等。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移前會首先釋放外泌體，外泌體被相應(yīng)器官的受體細胞攝取后，可使原器官細胞的狀態(tài)發(fā)生改變，營造一個適宜腫瘤生長的微環(huán)境，從而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[38-39]。馬維東等[40]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細胞中的circ_0044366能夠通過外泌體轉(zhuǎn)運至腫瘤相關(guān)成纖維細胞中，吸附miR-29b上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2的表達水平。MMP2可分解層粘連蛋白-5產(chǎn)生具有催化作用的可溶性片段，參與腫瘤的免疫過程，促進癌細胞的遷襲和轉(zhuǎn)移。李豪等[41]發(fā)現(xiàn)黑色素瘤外泌體可通過誘導(dǎo)成纖維細胞MMP2、MMP9的表達,促進成纖維細胞侵襲能力。黑色素瘤釋放的外泌體還能夠刺激基質(zhì)細胞產(chǎn)生膠原蛋白18、層粘連蛋白-5,并活化促分裂原活化的蛋白激酶、尿激酶,通過重構(gòu)腫瘤微環(huán)境支持轉(zhuǎn)移細胞的生長[42]。

3.2.4促進腫瘤細胞免疫逃逸 機體的免疫系統(tǒng)雖然有產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，但是許多腫瘤仍能在機體內(nèi)生長和增殖，說明腫瘤具有逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，使機體不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，即腫瘤免疫逃逸。鄭乃盛等[43]體外用M2型巨噬細胞模擬腫瘤相關(guān)巨噬細胞，提取其外泌體與胃癌細胞共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攝取了基質(zhì)蛋白2胞外域的胃癌細胞可減弱CD8陽性T細胞的殺傷作用，并可激活干擾素通路，增加胃癌細胞程序性死亡受體-配體1的表達，促進胃癌細胞的免疫逃逸。Wang等[44]發(fā)現(xiàn)circRNA-002178在患者的肺腺癌組織、癌細胞和外泌體以及血清中顯著上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-002178可以作為miR-34的海綿，通過外泌體進入CD8陽性T細胞中，增強癌細胞內(nèi)程序性死亡受體1的表達，誘導(dǎo)T細胞衰竭。

3.2.5調(diào)控腫瘤化療耐藥 腫瘤耐藥性是指化療過程中，腫瘤細胞對化療藥物逐漸產(chǎn)生耐受性的現(xiàn)象。化療耐藥是影響腫瘤治療的主要障礙之一。腫瘤細胞耐藥的主要機制包括：①發(fā)生于細胞膜水平的耐藥，如藥物攝取減少和細胞表面蛋白(P糖蛋白或多藥耐藥相關(guān)蛋白等)外排增多，引起細胞內(nèi)藥物的絕對濃度降低。②抗腫瘤藥物進入細胞后，在亞細胞水平發(fā)生再次分布引起的耐藥，如進入細胞質(zhì)中的藥物被轉(zhuǎn)運至外泌體囊泡中，從而隔絕藥物作用，并以胞吐的方式排出細胞外。③發(fā)生在藥物細胞內(nèi)代謝過程的耐藥，如藥物降解加速，積蓄減少等；腫瘤通常依靠有氧糖酵解產(chǎn)生ATP來快速生長和化療耐藥。M2型丙酮酸激酶在催化糖酵解過程中起關(guān)鍵作用。Wang等[45]研究表明，外泌體ciRS-122通過競爭性結(jié)合miR-122，上調(diào)M2型丙酮酸激酶促進糖酵解，并與化療耐藥性呈正相關(guān)。④發(fā)生在細胞核水平的耐藥，如藥物靶點的改變、凋亡途徑的阻滯、腫瘤干細胞或腫瘤微環(huán)境的改變等。Yao等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥的胃癌血清和細胞中，外泌體circRNA漿細胞瘤變異體易位1上調(diào)。抑制circRNA漿細胞瘤變異體易位1的表達，可提高胃癌對順鉑的敏感性。

4 小 結(jié)

盡管外泌體circRNA在癌癥早期診斷中取得一定進展，但仍存在多方面的挑戰(zhàn)和困難。雖然外泌體與體液有高親和力，可通過攜帶circRNA將生物信息和物質(zhì)轉(zhuǎn)運到目標細胞，保護circRNA免受破壞；但是細胞通過外排外泌體小泡也增加了circRNA的清除，減少了circRNA的聚積，最終導(dǎo)致外泌體中circRNA豐度較低。其次，圓形構(gòu)象和序列與線性mRNA對應(yīng)物重疊，使得對circRNA表達和功能的精確評估具有挑戰(zhàn)性。隨著檢測手段的不斷改進，實驗方法的改良和生物信息學(xué)算法的不斷優(yōu)化，相信外泌體circRNA將作為一種高靈敏度、高特異度、高穩(wěn)定性、創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)少的新型生物標志物，在癌癥早期診斷中發(fā)揮舉足輕重的作用。