孫巖， 程磊， 彭顯

1.口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓科，四川 成都（610041）； 2. 口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）

液體活檢是近年來新興的一種非侵入性檢測方法，通過檢測生物液體中的生物標志物，檢測疾病的發(fā)生及發(fā)展［1］。液體活檢開始主要涉及血液，近年來研究者將目光逐漸集中于其他生物液體，如唾液、尿液、腦脊液、乳汁等。相較于其它體液，唾液具有易收集、經(jīng)濟實惠、無創(chuàng)、患者依從性好等優(yōu)點。但唾液成分容易受收集方法、唾液流速、晝夜規(guī)律等的影響，因此當進行全唾液分析時存在易被污染、變性和部分蛋白酶（如淀粉酶）干擾導(dǎo)致其它蛋白質(zhì)降解等缺點，而采用唾液外泌體分析則能有效克服以上難題［2-3］。唾液外泌體是指存在于唾液中的直徑在30～150 nm 的細胞外囊泡，電鏡下觀察唾液外泌體可見其為雙層膜包裹的球形囊泡，唾液外泌體內(nèi)含多種“生物活性物質(zhì)”（如蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)、DNA、RNA等），與細胞間交流、免疫傳遞、血管生成、促進凝血等生理功能密切相關(guān)［4］。近年來，唾液外泌體中多可檢測到上皮細胞及粒細胞的標志物，提示唾液外泌體可能主要來自上皮細胞和粒細胞［5］。唾液外泌體性質(zhì)穩(wěn)定，長期儲存仍可保持其膜的完整性。提純后的唾液外泌體存儲于4 ℃條件下，28 d 內(nèi)仍可保持蛋白等內(nèi)容物的穩(wěn)定性，利于開展相關(guān)研究［6］。唾液外泌體具有轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的能力，從而影響受體細胞或分泌細胞的生理和病理功能?；谏鲜鎏匦?，開發(fā)唾液外泌體作為疾病診斷的生物標志物的潛力具有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)唾液外泌體除與口腔疾病，如口腔癌［7］、牙周炎［8］、口腔扁平苔蘚［9］、干燥綜合征［10］等有關(guān)外，還同遠處部位腫瘤如胰腺癌［11］、肺癌［12］等及系統(tǒng)性疾病如帕金森綜合征［13］、炎癥性腸病［14］等密切相關(guān)。本文就唾液外泌體與口腔疾病、遠處部位腫瘤及系統(tǒng)性疾病的密切聯(lián)系作一綜述。

1 唾液外泌體與口腔癌

細胞外囊泡可以穿過上皮屏障，有助于將全身性來源的RNA、蛋白質(zhì)等從血液或組織轉(zhuǎn)移到唾液中。唾液外泌體很可能提供局部和全身性疾病和病癥的證據(jù)，因此，唾液外泌體分子水平濃度的任何改變都有可能作為生物標志物預(yù)測或監(jiān)測各種疾病。近年來，唾液外泌體相關(guān)研究主要集中于口腔癌的早期檢測。

1.1 唾液外泌體與口腔癌早期診斷生物標志物

同健康人相比，口腔癌患者唾液外泌體的數(shù)量及尺寸明顯升高，可通過簡化細胞間交流以促進腫瘤的生長［7］。研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者唾液外泌體的CD63 含量升高，CD9 及CD81 明顯降低，而CD9 及CD81 參與細胞粘附及運動的功能調(diào)節(jié)，其表達降低有助于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，這也提示了唾液外泌體可作為疾病的潛在生物標志物［15］。

He 等［16］發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者腫瘤組織中的miR?24?3p 明顯增高，同時OSCC 患者唾液外泌體中的miR?24?3p 水平也明顯高于健康人，提示唾液外泌體中的miR?24?3p 可能來自于腫瘤細胞。而過量表達的miR?24?3p 通過作用于period1（PER1）基因可以促進腫瘤細胞的增殖。因此，唾液外泌體miR?24?3p 可作為診斷OSCC 的生物標志物。有學(xué)者通過比較OSCC 患者和健康人唾液外泌體的Alix 水平，發(fā)現(xiàn)OSCC 患者組唾液外泌體內(nèi)Alix 水平明顯升高，可作為診斷OSCC 的生物標志物［17］。

除此之外，OSCC 患者唾液外泌體中miR?412?3p 和miR?512?3p 含量明顯升高，miR?302b?3p 和miR?517b?3p 選擇性富集于OSCC 患者的唾液外泌體中，這4 種miRNA 有作為診斷OSCC 生物標志物的潛力［18］。

研究發(fā)現(xiàn)口腔癌患者唾液外泌體具有特異性紅外光譜特性［19］，可通過檢測蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸構(gòu)象的細微變化同健康人的唾液外泌體相區(qū)別。這種方法可進一步研究，同檢測唾液外泌體的生物標志物技術(shù)相結(jié)合，有利于診斷早期階段的口腔癌或口腔病變的潛在惡性轉(zhuǎn)化。

1.2 外泌體參與口腔癌發(fā)生發(fā)展

越來越多證據(jù)表明，外泌體參與腫瘤細胞惡性行為的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。如唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）細胞來源的外泌體，可以增強SACC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。Xu 等［20］發(fā)現(xiàn)SACC?83 細胞來源的外泌體與人牙周膜成纖維細胞相互作用后，促進人牙周膜成纖維細胞產(chǎn)生神經(jīng)生長因子，從而增強SACC?83 細胞的侵襲能力。此外，學(xué)者發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡相關(guān)的免疫抑制是腫瘤逃避的重要機制之一，并與口腔癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如OSCC 細胞來源外泌體內(nèi)的miR?29a?3p 及CMTM6 可通過增強M2 亞型巨噬細胞極化以促進OSCC 細胞的增殖和侵襲［21?22］。外泌體還可通過轉(zhuǎn)移致瘤性miRNA 來調(diào)節(jié)受體細胞中抑癌基因的表達，使無侵襲性的受體細胞擁有潛在的侵襲性。腫瘤微環(huán)境中來自腫瘤細胞或其他細胞的外泌體一方面可通過抑制患者識別和攻擊癌細胞的免疫系統(tǒng)來促進口腔或唾液腺癌的進展；另一方面，腫瘤來源的外泌體可能是一種新的腫瘤抗原的來源，可增強機體對癌癥的免疫。

2 唾液外泌體與其它口腔疾病

2.1 牙周炎

目前牙周炎的診斷多依賴于臨床及影像學(xué)檢查而缺少根本性炎癥反應(yīng)的評估，因此研究者近年來不斷研究相關(guān)領(lǐng)域。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，相較于健康人，牙周炎患者唾液外泌體內(nèi)富含免疫相關(guān)蛋白，可能參與牙周炎發(fā)展過程中的免疫反應(yīng)［8］。Yu 等［23］通過qRT?PCR 檢測發(fā)現(xiàn)牙周炎患者唾液外泌體中的的程序性細胞死亡配體?1（pro?grammed cell death?ligand 1，PD?L1）mRNA 水平明顯高于健康人組，同時不同階段的牙周炎患者其PD?L1 mRNA 含量存在明顯差異。高水平的唾液外泌體PD?L1 與重度牙周炎相關(guān)，一方面反映了機體對炎癥組織破壞作用的抑制，另一方面反映了疾病的進展。因此PD?L1 mRNA 可用于鑒別牙周炎患者及判斷其嚴重程度。Han 等［24］通過分析健康人、牙齦炎和牙周炎患者的唾液和唾液外泌體，成功發(fā)現(xiàn)唾液外泌體內(nèi)microRNA 的含量存在巨大差異而全唾液中卻無此差異。牙周炎患者唾液外泌體中hsa?miR?140?5p、hsa?miR?146a?5p 和hsa?miR?628?5p 較健康組明顯升高，可作為診斷牙周炎高精度的潛在生物標志物。

同時，Tobón?Arroyave 等［25］發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，牙周炎患者唾液外泌體的CD9 和CD81 含量明顯降低。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗證明，這兩種生物標志物的含量同牙周炎的階段及進展速度成明顯負相關(guān)。唾液外泌體CD9、CD81 濃度降低可能在牙周病的發(fā)病機制中具有重要意義。Nik 等［26］通過比較慢性牙周炎和健康人唾液外泌體內(nèi)的miRNA，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎組唾液外泌體內(nèi)的hsa?miR?125a?3p 含量顯著升高，有作為慢性牙周炎生物標志物的潛力。此外，牙周炎患者唾液外泌體DNA 的甲基化水平明顯高于健康組，也可作為診斷牙周炎的潛在生物標志物［27］。眾多研究顯示，相較于全唾液，唾液外泌體更能作為診斷牙周炎的生物標志物及反映牙周炎的進展情況。

2.2 口腔扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維化、干燥綜合征

口腔扁平苔蘚，一種病因不明的慢性炎癥性口腔黏膜疾病，同樣與唾液外泌體密切相關(guān)。研究者通過miRNA 微陣列芯片分析和qPCR 技術(shù)比較口腔扁平苔蘚患者和健康對照組唾液外泌體的miRNA 表達譜，發(fā)現(xiàn)口腔扁平苔蘚患者唾液外泌體中miR?4484 的含量顯著上調(diào)，可作為口腔扁平苔蘚潛在的生物標志物［9］。Zhou 等［28］發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNA ADAMTS9?AS2 可通過抑制AKT 信號通路抑制口腔黏膜下纖維化的進展，且相較于口腔黏膜下纖維化及正常黏膜組織，其在OSCC 組織中表達下調(diào)，可作為診斷OSCC 的潛在生物標志物。此外，唾液外泌體還與干燥綜合征密切相關(guān)，但其機制仍需進一步探索［10］。

3 唾液外泌體與其它疾病

3.1 遠處部位腫瘤

唾液外泌體不僅同口腔疾病密切相關(guān)，還同遠處部位的腫瘤有關(guān)。如胰腺癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等遠處腫瘤發(fā)生后，可從患者唾液內(nèi)檢測出特異性的生物標志物。Lau 等［11］通過設(shè)計小鼠胰腺癌模型，發(fā)現(xiàn)了腫瘤外泌體與特異性唾液外泌體的聯(lián)系：腫瘤外泌體可通過血液循環(huán)到達唾液腺從而誘導(dǎo)具有特異性生物標志物的唾液外泌體的合成，且抑制遠端腫瘤部位外泌體的產(chǎn)生后可減少唾液特異性生物標志物的生成。Sun 等［12］比較了肺癌患者和健康受試者唾液外泌體的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)癌癥患者和健康受試者之間存在近40%的差異，且肺癌患者特有的唾液外泌體蛋白質(zhì)中約30%與腫瘤的轉(zhuǎn)移、增殖密切相關(guān)。Machida等［29］通過比較胰膽系統(tǒng)腫瘤患者和健康對照組唾液外泌體中miRNA 表達水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者唾液外泌體中的miR?1246 和miR?4644 含量明顯增高，可作為胰膽系統(tǒng)腫瘤的生物標志物以早期檢測腫瘤的發(fā)生。

3.2 系統(tǒng)性疾病

除遠處部位的腫瘤性疾病外，唾液外泌體還與多種系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。如帕金森患者的唾液外泌體的數(shù)量及其內(nèi)的磷酸化α?突觸核蛋白、磷酸化α?突觸核蛋白/總α?突觸核蛋白比例較正常人明顯升高，可作為帕金森病的生物標志物［13］。Cressatti 等［30］首次發(fā)現(xiàn)人體唾液來源的胞外囊泡中含有血紅素氧合酶?1 ，具有作為多種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的生物標志物的潛力。近年來有學(xué)者通過使用液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀，比較炎癥性腸病患者和健康對照組唾液外泌體的蛋白構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)蛋白酶體亞基α7（proteasome subunit alpha type 7，PSMA7）蛋白在炎癥性腸病患者與健康對照組之間存在明顯差異，可作為炎癥性腸病的生物標志物［14］。

唾液外泌體除與口腔及系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)可作為檢測疾病的生物標志物外，還因其具有生物相容性好、脂質(zhì)雙分子層膜避免內(nèi)容物降解、易通過血腦屏障等各種生物屏障等的優(yōu)點，具有作為藥物載體的治療應(yīng)用前景［31］。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了唾液外泌體新的治療應(yīng)用方向：可用于治療糖尿病患者的口干癥和唾液腺功能障礙，及作為先天性免疫防御物質(zhì)防止部分病毒的感染等［32?33］。雖然唾液外泌體具有良好的治療前景，但目前相關(guān)文獻報道較少，仍需進一步研究。

4 總結(jié)與展望

唾液外泌體不僅是疾病診斷和預(yù)后生物標志物的來源，而且是一種創(chuàng)新的治療策略。然而，在臨床應(yīng)用之前必須解決許多挑戰(zhàn)，研究高效精確的外泌體分離和鑒定方法對提高外泌體的數(shù)量、質(zhì)量和下游分析是必要的。目前唾液外泌體常用的提取方法有兩種，分別為金標準的超速離心法及ExoQuick?TCTM（EQ）試劑盒提取法［34］。相較其它方法，超速離心法可獲得體積較為均一的囊泡，且雜質(zhì)最少［34?35］。而EQ 試劑盒則可從小體積的唾液中獲得外泌體。但目前常用的外泌體提取方法不能將其同病毒有效的分離，可能導(dǎo)致對結(jié)論的影響。因此研究如何提取高純度及有生物學(xué)活性的外泌體將有助于推動外泌體領(lǐng)域的發(fā)展。此外，唾液外泌體功能、潛在機制的不斷研究將加深對唾液外泌體與口腔疾病、遠處部位腫瘤及系統(tǒng)性疾病之間作用的理解，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和方法。

【Author contributions】Sun Y wrote the article. Peng X，Cheng L reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.