彭星星，高海軍，尹成華，劉 瑩，戴冠蘋，趙勝男，曹晶晶

（河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450004）

多環(huán)芳烴（PAHs）具有較高的毒理特性，能產(chǎn)生致畸性和致突變性，且能夠?qū)е氯梭w多器官產(chǎn)生腫瘤及癌變，嚴(yán)重威脅到人類的健康[1-4]。多環(huán)芳烴極易溶于脂類物質(zhì)，性狀穩(wěn)定、不易分解，這種特性使得植物油等樣品更容易被其附著污染，植物油作為千家萬戶的烹飪用油，其重要性毋庸置疑，因此，有效的監(jiān)控植物油中多環(huán)芳烴的含量對保障人體健康具有重要意義。

目前國內(nèi)外有多種方法可以對多環(huán)芳烴的含量進行測定：如高效液相色譜法[5-7]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]等。Ballesteros等[18]對橄欖油原油和精煉橄欖油用乙腈-正己烷混合溶液提取，以二氯甲烷為流動相進行GPC凈化后用GC-MS/MS分析測定；胡國紳[19]比較了QuEChERS和凝膠滲透色譜2種前處理技術(shù)對食用植物油中16種多環(huán)芳烴殘留量的測定。這些文獻均使用有機試劑作為提取劑對樣品中多環(huán)芳烴進行提取，然后采用 GPC凈化后上機測定，前處理過程較為繁瑣，且會造成目標(biāo)物的損失，因此亟需一種簡單、快速、方便的方法對植物油中多環(huán)芳烴進行測定。

本實驗在GB/T 23213—2008《植物油中多環(huán)芳烴的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[20]的方法基礎(chǔ)上，通過減少樣品稱樣量后選擇凝膠滲透色譜直接進行凈化的方法，除去了繁瑣的提取過程，節(jié)省了前處理的時間，節(jié)約了提取試劑，同時能夠防止目標(biāo)物在提取過程中產(chǎn)生的含量損失，并利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的選擇離子監(jiān)測模式（SIM）進行測定，采用添加同位素到樣品中作為分析質(zhì)量控制和定量測定的手段，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗方法中的植物油，包括花生油、大豆油、菜籽油，密封冷藏待測：鄭州市大潤發(fā)超市（隴海路店）。

1.2 儀器與試劑

SCION TQ/456GC型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：德國布魯克公司；GVS/U082812型全自動凝膠凈化系統(tǒng)：北京萊伯泰科儀器有限公司；BS2000S型，感量為0.01 g，百分之一電子分析天平、Quintix224-1CN型，感量為0.000 1 g，萬分之一電子分析天平：賽多利斯儀器（北京）有限公司；MTN-2800型水浴氮吹儀：上海旌派儀器有限公司。

萘（純度99.4%）：北京曼哈格生物科技有限公司；苊烯（純度 99.2%）、芴（純度 99.2%）、菲（純度 99.6%）、熒蒽（純度 99.2%）、屈（純度99.9%）、苯并（b）熒蒽（純度99.9%）：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；苊（純度99.8%）、蒽（純度99.4%）、芘（純度97.5%）、苯并（a）蒽（純度99.1%）、苯并（k）熒蒽（純度99.2%）、苯并（a）芘（純度 99.9%）、二苯并（a,h）蒽（純度99.3%）、苯并（g,h,i）苝（純度 98.9%）、氘代-菲-D10（純度98.5%）：廣州佳途科技股份有限公司；茚并（1,2,3-cd）芘（純度99.4%）、氘代-蒽-D10（純度98.9%）：DR.Ehrenstorfer公司；氘代-苯并（a）芘-D12（純度 99.4%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

環(huán)己烷、乙酸乙酯：色譜純，北京邁瑞達科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

16種PAHs混標(biāo)的配制方法：用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取適量的 16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別置于100 mL容量瓶中，然后加入體積比為1∶1的乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶液，將其定容至刻度線，放置于–20 ℃冰箱中儲存，具體濃度值如表2所示。

3種PAHs內(nèi)標(biāo)的配制方法：用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取適量 3種多環(huán)芳烴內(nèi)標(biāo)物質(zhì)分別置于100 mL容量瓶中，然后加入體積比為1∶1的乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶液，將其定容至刻度線，放置于–20 ℃冰箱中儲存，具體濃度值如表1所示。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用移液槍分別移取不同體積的16種多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均加入40 μL內(nèi)標(biāo)溶液，然后用乙酸乙酯環(huán)己烷（1+1）混合溶液進行逐級稀釋制得200 μL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻，待測。

1.3.2 樣品前處理方法

稱取植物油樣品1.00 g，將其放置于10 mL比色管中，加入多環(huán)芳烴內(nèi)標(biāo)混合溶液 80 μL，然后加入體積比為 1∶1的乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶液，將其定容至刻度線，使用渦旋振蕩器對其進行渦旋后溶解，將渦旋混勻后的樣品混合溶液過0.45 μm有機相濾膜轉(zhuǎn)入GPC進樣管中待上機凈化。

凝膠滲透凈化系統(tǒng)選擇乙酸乙酯環(huán)己烷（1+1）混合溶液作為流動相，將儀器流動相的流速參數(shù)設(shè)置為4.0 mL/min，將紫外檢測波長參數(shù)設(shè)置為254 nm，進樣量設(shè)置為5 mL，在凈化過程中收集19～36 min流出液，將收集的流出液放置于 40 ℃水浴氮吹儀中吹至近干，然后用0.2 mL體積比為 1∶1的乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶液渦旋溶解殘留物，并轉(zhuǎn)移至加入200 uL內(nèi)插管的進樣瓶中，待上機測定。

1.3.3 色譜儀條件

進樣口溫度設(shè)為 300 ℃；色譜柱選擇 DB-5 MS毛細管型（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序如下所示：

1.3.4 質(zhì)譜儀條件

質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置Table 1 The parameter settings of mass spectrometer

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 WPS office（11.1.010463）軟件對實驗中數(shù)據(jù)進行公式擬合和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜參數(shù)采取正離子模式，對16種多環(huán)芳烴目標(biāo)物和3種內(nèi)標(biāo)物在m/z 50～500的范圍內(nèi)采用Scan（全掃描模式）進樣，得到TIC圖，再使用質(zhì)譜軟件中Library Search Spectrum A對化合物進行檢索定性，得到每種化合物的保留時間，采用選擇離子監(jiān)測（select ion monitor, SIM）模式進樣。16種多環(huán)芳烴及3種同位素內(nèi)標(biāo)的特征離子與保留時間如表2所示，16種目標(biāo)物和3種內(nèi)標(biāo)物的SIM色譜圖如圖1所示。

表2 16種多環(huán)芳烴及3種同位素內(nèi)標(biāo)的特征離子與保留時間Table 2 Retention times, target ions and CAS for 16 kinds of PAHs and 3 kinds of isotopic internal standard

圖1 16種多環(huán)芳烴及3種同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of 16 kinds of PAHs and 3 kinds of isotopic internal standard

從圖1可以看出，在優(yōu)化后的儀器條件下，16種多環(huán)芳烴及3種同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液峰型較好，各化合物均完全分離。實驗選擇氣相質(zhì)譜儀的SIM模式進行測定，可以滿足樣品中多環(huán)芳烴的測定要求。

2.2 凝膠滲透色譜條件的優(yōu)化

凝膠滲透色譜法（GPC）又叫做排阻色譜法，可以用來去除植物油油脂等大分子雜質(zhì)，從而分離出目標(biāo)化合物。其分離原理是當(dāng)不同分子量的多種分子同時進入色譜柱后，大分子量的分子不會進入多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，僅通過顆粒間隙，因此會率先從色譜柱中流出；分子量小的分子會通過顆粒內(nèi)部，因此會較晚流出色譜柱。本研究中對凝膠滲透色譜法的優(yōu)化，首要考慮因素為能夠有效地將目標(biāo)化合物與雜質(zhì)分離，其次是能夠得到盡可能好的回收率，最終達到滿足分析的要求。本實驗以大豆油為例對多環(huán)芳烴凝膠滲透色譜條件進行優(yōu)化，空白大豆油及添加多環(huán)芳烴目標(biāo)物的大豆油 GPC凈化淋洗曲線如圖2和圖3所示。

圖2 空白大豆油GPC凈化淋洗曲線Fig.2 GPC chromatograms of soybean oil

圖3 添加多環(huán)芳烴目標(biāo)物的大豆油GPC凈化淋洗曲線Fig.3 GPC chromatograms of vegetable oil with PAHs compounds

由圖2和圖3比較可知0～19 min的流出液為油脂類雜質(zhì)，收集19～36 min的流出液進行氮吹濃縮后上機測定，結(jié)果表明該時間段流出液即為16種多環(huán)芳烴目標(biāo)物和3種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，由此可見油脂類物質(zhì)基體和被測物PAHs能夠很好地分離，且收集19～36 min的流出液可以保證多環(huán)芳烴能夠達到較好的回收率。

觀察圖3中19～36 min GPC凈化淋洗曲線可知，多環(huán)芳烴目標(biāo)組分出峰時間可分為兩段，因此可先設(shè)置分段收集，分別收集19～28 min的流出液和28～36 min的流出液進行氮吹濃縮后上機測定，結(jié)果表明19～28 min的流出液為前十種多環(huán)芳烴，28～36 min的流出液為后六種多環(huán)芳烴，前十種多環(huán)芳烴分子量范圍是 128～228，后六種多環(huán)芳烴分子量范圍是252～276，這說明分子量較大的后六種多環(huán)芳烴出峰時間晚于分子量較小的前十種多環(huán)芳烴，這可能是由于后六種多環(huán)芳烴的空間結(jié)構(gòu)小于前十種多環(huán)芳烴的緣故，因此后六種多環(huán)芳烴較晚流出。該結(jié)論表明凝膠滲透色譜并不是嚴(yán)格按照分子量大先出峰分子量小后出峰的順序，在分離多種化合物時應(yīng)該采用分段收集分段測定的方法才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

16種多環(huán)芳烴混標(biāo)用環(huán)己烷乙酸乙酯（1+1）溶液配制成 10～200 ng/mL的梯度標(biāo)液上機進行測定。測定結(jié)果采用內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，其中萘、苊烯、苊、芴、菲以D10-菲為內(nèi)標(biāo)進行計算，蒽、熒蒽、芘、苯并（a）蒽、屈以 D10-蒽為內(nèi)標(biāo)進行計算，苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（a）芘、茚并（1,2,3-cd）芘、二苯并（a,h）蒽、苯并（g,h,i）苝以D12-苯并（a）芘為內(nèi)標(biāo)進行計算，以各多環(huán)芳烴化合物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比（X）為橫坐標(biāo)，化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，使用質(zhì)譜軟件形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各多環(huán)芳烴的回歸方程。參照朱?；ǖ萚21]的方法，取 16種多環(huán)芳烴 80 μL加標(biāo)水平的樣品進行分析，測定信噪比，分別以每種多環(huán)芳烴 3倍、10倍信噪比（S/N）計算檢出限和定量限，結(jié)果見表3。由表3可知，16種多環(huán)芳烴的回歸曲線方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.990，檢出限在0.02～ 0.50 μg/kg范圍內(nèi)，定量限在0.08～1.67 μg/kg范圍內(nèi)。

表3 16種多環(huán)芳烴的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Calibration curve, R2, limits of detection, limits of quantitation, recoveries and relative standard deviations of 16 kinds of PAHs

2.4 重復(fù)性和準(zhǔn)確性

取同樣空白的大豆油樣品1.00 g，16種多環(huán)芳烴標(biāo)液添加水平分別為20 μL、40 μL和80 μL下做加標(biāo)實驗，平行進樣6次，利用6次平行數(shù)據(jù)對平均回收率和RSD進行計算。如表2所示，在添加水平為20 μL時，16種多環(huán)芳烴計算所得的平均回收率在 85.30%～103.86%范圍內(nèi)，RSD為0.69%～2.93%；添加水平為40 μL時，16種多環(huán)芳烴計算所得的平均回收率在 91.08%～106.71%范圍內(nèi)，RSD為 0.64%～2.74%；添加水平為80 μL時，16種多環(huán)芳烴計算所得的平均回收率在88.01%～105.87%范圍內(nèi)，RSD為0.75%～2.81%。由此可見本實驗方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性能夠滿足實驗中16種多環(huán)芳烴的分析測試要求。

2.5 實際樣品分析

分別采用國標(biāo)方法 GB/T 23213—2008和本實驗方法對購買的植物油樣品包括花生油、大豆油、菜籽油進行測定，測定結(jié)果如表4所示。

表4 用國標(biāo)方法和本方法測得花生油、大豆油及菜籽油中16種多環(huán)芳烴含量對比Table 4 Comparison of 16 PAHs in peanut oil, soybean oil and rapeseed oil measured by national standard method and this method μg/kg

由表4中結(jié)果可知，這兩種不同前處理方法測定的16種多環(huán)芳烴結(jié)果較為接近，但使用本實驗方法簡化了提取過程，節(jié)約了提取試劑，因此本方法更為簡單、快速。

3 結(jié)論

本實驗建立了GPC結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法定量檢測植物油中16種多環(huán)芳烴的方法。樣品以流速4.0 mL/min 乙酸乙酯環(huán)己烷混合溶液（1+1）作為流動相上 GPC進行凈化，分段收集上GC-MS/MS測定后發(fā)現(xiàn)前十種小分子量多環(huán)芳烴先出峰，后六種大分子量多環(huán)芳烴后出峰，本實驗結(jié)果與張茜[22]等研究中多環(huán)芳烴 GPC出峰順序相吻合。該結(jié)論表明凝膠滲透色譜并不是嚴(yán)格按照分子量大先出峰分子量小后出峰的順序，在分離多種化合物時應(yīng)該采用分段收集分段測定的方法才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，與 GB/T 23213—2008中前處理方法相比，本方法通過將樣品稱樣量從4 g減少到1 g，采用環(huán)己烷乙酸乙酯（1+1）溶解后直接用GPC凈化的方法，除去了繁瑣的提取過程，節(jié)省了前處理的時間，節(jié)約了提取試劑，同時能夠防止目標(biāo)物在提取過程中產(chǎn)生的含量損失，采用添加同位素到樣品中作為分析質(zhì)量控制和定量測定的手段，結(jié)果表明植物油中16種多環(huán)芳烴在GC-MS/MS上色譜峰響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度（10～200 ng/mL）之間線性關(guān)系良好，16種多環(huán)芳烴的相關(guān)系數(shù)均超過了 0.99，回收率高，重復(fù)性好。該方法適合批量前處理，準(zhǔn)確度、重復(fù)性和靈敏度均可以滿足植物油中 16種多環(huán)芳烴測定的技術(shù)要求。