楊 敏，孟凡穎，孫 輝，楊柏榮，劉夢醒，陳 潔，范 奧，劉 媛?

（1. 昆明市第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部，云南 昆明 650041；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；3. 昆明市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650500）

據(jù)《2020世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告》中顯示，心血管疾病仍是導(dǎo)致死亡的主要病因，自 2000年以來，全球心血管疾病死亡人數(shù)增加了四分之一，2019年達(dá)到1 790萬人[1]。冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，我國 CHD死亡率逐年上升，其中2018年CHD在我國的死亡率高達(dá) 114（1/10萬）[2-3]。中醫(yī)歷代文獻(xiàn)中并無“冠心病”病名，但有類似該病的癥候記載，如《備急千金要方》中就寫道“論曰：寒氣卒客于五臟六腑，則發(fā)卒心痛胸痹”?！督饏T要略》中也提到“夫脈當(dāng)取太過不及，陽微陰弦即胸痹而痛，所以然者，責(zé)其極虛也。今陽虛知在上焦，所以胸痹心痛者，以其陰弦故也”。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在心血管疾病干預(yù)中具有內(nèi)在優(yōu)勢。山楂是傳統(tǒng)的藥食兩用藥材，其功效健運(yùn)脾胃，消積導(dǎo)滯，在CHD的治療中有廣泛的臨床應(yīng)用[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂可顯著降低 CHD患者血漿中同型半胱氨酸（被認(rèn)為是CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素）及血脂含量[5]。同時山楂還能降低超敏C反應(yīng)蛋白（頸動脈斑塊形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素）及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平，穩(wěn)定冠狀動脈粥樣硬化斑塊，提高患者存活率[6-7]。臨床研究表明山楂能改善 CHD患者的血脂及心絞痛發(fā)作癥狀，減少非急性期CHD痰瘀癥患者急性心血管事件的發(fā)生[8-9]。

然而山楂治療 CHD的作用機(jī)制研究滯后于其臨床應(yīng)用，缺乏對山楂多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療 CHD的整體認(rèn)識。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度來認(rèn)識藥物與機(jī)體之間相互作用，有助于挖掘中藥多成分作用的靶點(diǎn)及功能通路的整體情況。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其活性成分作用靶點(diǎn)，構(gòu)建其作用網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合分子對接技術(shù)，系統(tǒng)闡明山楂治療CHD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 山楂的活性化合物及靶點(diǎn)預(yù)測

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和相關(guān)文獻(xiàn)收集化學(xué)成分，以“山楂”為關(guān)鍵詞檢索其化學(xué)成分。根據(jù)口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18的 2個 ADME屬性值作為活性成分篩選條件，并獲得活性成分的作用靶點(diǎn)。運(yùn)用 Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）校正靶點(diǎn)蛋白名稱為規(guī)范的基因名稱。

1.2 CHD相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測

以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞，分別檢索 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（http://omim.org/），獲取CHD的潛在靶點(diǎn)。并通過 VENNY2.1軟件構(gòu)建韋恩圖，得到山楂治療CHD的靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將山楂-CHD共同靶點(diǎn)傳至 STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，選擇“multiple proteins”，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”進(jìn)行檢索，設(shè)置為評分≥0.9，以提高生物信息的可信度，通過以上信息的處理導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。下載tsv文件，保留節(jié)點(diǎn)（node1，node2）和結(jié)合率評分（combine score）信息，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點(diǎn)相關(guān)的拓?fù)鋮?shù)，并基于degree值進(jìn)行排序。

1.4 靶點(diǎn)GO及KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html）對山楂治療CHD的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，選擇各過程富集排名前10位的分析結(jié)果（P<0.01）。進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）路富集分析，根據(jù)P值篩選顯著性高的通路，設(shè)置P<0.05，選取最顯著的10個通路。

1.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路構(gòu)建

基于藥物-成分-靶點(diǎn)-信號通路，運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)KEGG通路富集分析的結(jié)果所選取的主要信號通路，同時與參與相關(guān)通路的靶點(diǎn)建立聯(lián)系，并與“成分-靶點(diǎn)”間相互作用關(guān)系整合并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接驗(yàn)證

①受體蛋白準(zhǔn)備：從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫中獲取核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件。蛋白導(dǎo)入Schr?dinger 2018軟件，在 Protein Preparation模塊下進(jìn)行蛋白加氫、補(bǔ)全缺失殘基和 loops區(qū)、刪除水分子等處理；②化合物處理準(zhǔn)備：從PubChem數(shù)據(jù)庫下載化合物3D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件，將化合物導(dǎo)入Schr?dinger 2018軟件，在LigPrep模塊下進(jìn)行處理優(yōu)化；③蛋白活性口袋準(zhǔn)備：查找文獻(xiàn)找到靶點(diǎn)活性口袋或者用軟件進(jìn)行預(yù)測，Binding Site Detection模塊下可發(fā)現(xiàn)、觀察、評估蛋白結(jié)合位點(diǎn)；④定義活性口袋和產(chǎn)生格點(diǎn)文件：在Receptor Grid Generation模塊下進(jìn)行處理，生成活性口袋格點(diǎn)文件；⑤分子對接：選中化合物和上一步產(chǎn)生的格點(diǎn)文件，在 Lignd Docking模塊下進(jìn)行分子對接。親和能越低，表明活性成分與靶蛋白的結(jié)合力越強(qiáng)，一般認(rèn)為親和能≤–7.0 kJ/mol的藥物分子與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂的活性化合物及靶點(diǎn)篩選

根據(jù) ADME條件篩選得到 6個主要活性成分，見表1。通過UniProt數(shù)據(jù)庫中找出化學(xué)成分對應(yīng)的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，去除重復(fù)的基因，獲得166個靶點(diǎn)。

表1 山楂活性成分信息特征表Table 1 Crataegi Fructus active ingredient information characteristic table

2.2 CHD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

檢索 GeneCards和 OMIM 數(shù)據(jù)庫，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置Score值≥3.91。兩個數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果刪除重復(fù)基因后得到 CHD靶點(diǎn)3 850個。并通過 VENNY2.1軟件取共同靶點(diǎn)繪制韋恩圖，得到山楂治療CHD相關(guān)靶點(diǎn)140個，如圖1。

圖1 山楂-冠心病共同基因靶點(diǎn)數(shù)Fig.1 The number of common gene targets of Crataegi Fructus-coronary heart disease

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將140個共同靶點(diǎn)上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，構(gòu)建山楂與 CHD的靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生蛋白相互作用的靶點(diǎn)有127個（其中13個靶點(diǎn)未發(fā)生蛋白相互作用，故剔除），包括192個節(jié)點(diǎn)，767條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為7.99，見圖2。運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件對127個靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，其中degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大，表示山楂通過此靶點(diǎn)治療 CHD的可能性越大。根據(jù)分析結(jié)果取degree值排名前10的靶點(diǎn)，依次為 JUN、AKT1、TNF、MAPK1、TP53、RELA、IL6、MAPK8、MAPK14、EGFR，推測這些靶點(diǎn)可能是治療冠心病的核心靶點(diǎn)，見圖3。

圖2 山楂與冠心病交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of the intersection target between Crataegi Fructus and coronary heart disease

圖3 山楂治療冠心病的核心靶點(diǎn)Fig.3 The core target of Crataegi Fructus in the treatment of coronary heart disease

2.4 GO和KEGG通路富集結(jié)果與分析

GO富集分析結(jié)果顯示，山楂治療CHD參與的生物過程（biological process，BP）包括：對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對無機(jī)物的反應(yīng)（response to inorganic substance）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、對受傷的反應(yīng)（response to wounding）、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)（cellular response to organic cyclic compound）、血管發(fā)育（blood vessel development）等；參與的細(xì)胞組成（cellular component，CC）主要包括：膜筏（membrane raft）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體（transcription regulator complex）、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物（plasma membrane protein complex）、細(xì)胞器外膜（organelle outer membrane）等；分子功能（molecular function，MF）主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）等。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，山楂治療 CHD的靶點(diǎn)主要集中在癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的 AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（Hepatitis B）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、NF-κB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）等，詳見圖5。

圖4 山楂治療冠心病靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis results of Crataegi Fructus targets for the treatment of coronary heart disease

圖5 山楂治療冠心病靶點(diǎn)KEGG富集分析結(jié)果Fig.5 KEGG enrichment analysis results of Crataegi Fructus targets for the treatment of coronary heart disease

2.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路構(gòu)建

運(yùn)用 Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建山楂活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)。圖中包括山楂活性成分6個；山楂與 CHD共同靶點(diǎn) 127個；信號通路10條。篩選出的山楂活性成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮治療CHD的作用，詳見圖6。

圖6 山楂治療冠心病的成分-靶點(diǎn)-信號通路Fig.6 Crataegi Fructus in the treatment of coronary heart disease components-target-signal pathway

2.6 分子對接驗(yàn)證

選取degree值前10位的核心靶點(diǎn)與有這10個靶點(diǎn)的活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。篩選得到異鼠李素（isorhamnetin）、山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）3個活性成分有對應(yīng)核心靶點(diǎn)，推測這3個活性成分可能為山楂治療CHD的關(guān)鍵藥效成分。在分子對接中，親和能能值越低表示化合物與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合更好，本研究篩選親和能≤–7的成分與靶點(diǎn)作為研究對象，由表2可知，異鼠李素、山萘酚和槲皮素均能與 MAPK8靶點(diǎn)結(jié)合，且親和能最低，表明MAPK8靶點(diǎn)可能為其關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖7。其中槲皮素與MAPK8靶點(diǎn)結(jié)合的親和能為–7.98，小于異鼠李素和山萘酚，槲皮素與MAPK1亦能較好的結(jié)合，表明槲皮素更易與靶點(diǎn)MAPK8、MAPK1靶點(diǎn)結(jié)合。此外異鼠李素與RELA靶點(diǎn)結(jié)合的親和能為–7.19，也具有較好的結(jié)合活性。

表2 山楂關(guān)鍵成分與對應(yīng)核心靶點(diǎn)作用情況Table 2 The interaction of key components of Crataegi Fructus with corresponding core targets

圖7 核心化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of core compounds and key target molecules

3 討論

心血管疾病已成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率居世界首位。CHD是最常見的心血管疾病，面對如此嚴(yán)峻的形勢，開發(fā)治療CHD的藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。CHD在中醫(yī)中多記載為“胸痹”范疇，與痰濁痹阻，氣滯血瘀等相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為高脂血癥、高血壓、糖尿病等是其常見病因，可見糖脂代謝與 CHD密切相關(guān)[10]。中藥山楂既擅長治油膩食積，又擅長活性散瘀，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山楂具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的功效。因此，本文在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，針對傳統(tǒng)的藥食同源中藥山楂展開研究，為山楂治療CHD的作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

通過 TCMSP篩選出山楂活性成分為：谷甾醇（sitosterol）、山萘酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、槲皮素（quercetin）、表兒茶素（ent-Epicatechin）、異鼠李素（isorhamnetin）。將山楂活性成分靶點(diǎn)與 CHD靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到140個共同靶點(diǎn)，提示了山楂治療CHD的潛在作用。對共同靶點(diǎn)進(jìn)一步拓?fù)浞治?，取degree值前10的靶點(diǎn)為JUN、AKT1、TNF、MAPK1、TP53、RELA、IL6、MAPK8、MAPK14、EGFR，推測這些靶點(diǎn)可能是治療 CHD的核心靶點(diǎn)。同時KEGG富集分析結(jié)果表明，癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙肝（Hepatitis B）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）等可能是山楂治療CHD的關(guān)鍵通路。

為驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性，選取主要活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，其結(jié)果表明異鼠李素（isorhamnetin）、山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）3個活性化合物與核心靶點(diǎn)MAPK8、MAPK1、RELA均表現(xiàn)出良好的親和作用，體現(xiàn)了中藥多成分多靶點(diǎn)的特性。MAPKs家族是調(diào)控炎癥基因表達(dá)的一類重要蛋白，MAPK8（mitogen-activated protein kinase 8）又被稱為c-Jun氨基末端激酶1（cJun N-terminal kinase 1，JNK1），可通過級聯(lián)反應(yīng)將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞及核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)[11]。研究表明通過抑制p38 MAPK軸可降低CHD中內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，進(jìn)而治療 CHD[12]。MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1）基因，也被稱為ERK2基因，其參與增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞進(jìn)程，MAPK1基因遺傳多態(tài)性可能影響 CHD的血脂代謝和凝血功能，參與 CHD的炎性反應(yīng)[13]。RELA又名p65，是NF-κB信號通路的重要成員[14]。在大鼠模型中 ac-p65和 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白水平的降低，可緩解其CHD癥狀[15]。

槲皮素在體外具有全身和冠狀動脈血管舒張作用，并在多個高血壓模型大鼠中降低血壓，研究表明槲皮素的攝入與較低的 CHD死亡率有關(guān)。槲皮素能抑制MAPK通路上JNK、p38的磷酸化，在急性冠脈綜合征模型大鼠中，過表達(dá)miR-330通過WNT信號通路靶向MAPK8，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，同時促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]。槲皮素可通過調(diào)控p38 MAPK/NF-κB信號通路，減輕炎癥，保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟，緩解糖尿病[17]。這些研究支持了本文的結(jié)論。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明槲皮素還可通過阻斷HUVECs中NF-κB和AP-1信號通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，通過產(chǎn)生H2O2激活冠狀動脈中的BKCa電流促進(jìn)冠脈的舒張[18-19]。本研究中未見這些通路上的靶點(diǎn)，也是我們后期需要繼續(xù)探究的方向。

槲皮素可以經(jīng)甲基化生成異鼠李素[20]。異鼠李素通過阻斷HUVECs中NF-κB和AP-1信號通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，這可能是其治療 CHD的潛在機(jī)制之一[21]。異鼠李素通過調(diào)控 H9c2心肌細(xì)胞自噬及凋亡通路蛋白表達(dá)減輕心肌損傷，通過調(diào)節(jié)AKT-FOXO1信號通路有效改善胰島素抵抗Hepg2細(xì)胞[22-23]。但文獻(xiàn)報(bào)道中未見異鼠李素與MAPK8靶點(diǎn)的直接研究結(jié)果，筆者推測異鼠李素在MAPK通路上，更多的是作為槲皮素的代謝產(chǎn)物，參與CHD的治療。

山萘酚具抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，其攝入與較低的心血管風(fēng)險(xiǎn)呈線性相關(guān)[24]。山萘酚通過抑制ASK1/MAPK信號通路和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，減輕主動脈條帶化引起的心肌肥厚，心肌功能改善[25]，還可降低 AGE-RAGE/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥，減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[26]。此外，研究表明其可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抗氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌細(xì)胞，其作用機(jī)制與下調(diào) Nox4、p67phox、p47phox的表達(dá)水平相關(guān)[27]。

綜上所述，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段探究了山楂治療 CHD的核心活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過分子對接技術(shù)驗(yàn)證了其可靠性；初步揭示了山楂主要通過異鼠李素、山萘酚、槲皮素，影響MAPK8、MAPK1、RELA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié) MAPK信號通路從而治療預(yù)防CHD。本研究結(jié)果為山楂治療CHD的臨床應(yīng)用提供了理論支持，為CHD治療機(jī)制研究提供了方向。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。