徐子悟，惠佳如，吳細(xì)文，鄧曉磊，孟 蕾

（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

動(dòng)脈硬化性心血管疾?。ˋSCVD）是多種心臟和血管相關(guān)疾病的統(tǒng)稱，包括高血壓、血脂異常、冠心病、腦卒中等，這些疾病是全世界導(dǎo)致發(fā)病和死亡的最大原因[1]。目前認(rèn)為，血管中的活性氧（ROS）產(chǎn)生和低密度脂蛋白（LDL）的氧化是引發(fā) ASCVD的兩類首要因素[2]，而氧化應(yīng)激和炎癥是疾病早期診斷和治療的重點(diǎn)[3]。在ASCVD的臨床治療中，他汀類藥物已成為治療首選，盡管這類已獲得美國藥物監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物能降低夠患者體內(nèi)的低密度脂蛋白膽固醇含量，但他汀類藥物的治療耐藥性、不耐受以及缺乏用藥依從性等問題仍是成為臨床治療ASCVD的障礙[4]。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的臨床治療上，傳統(tǒng)的中草藥以其低毒性和良好的臨床療效，已被納入用于許多疾病的聯(lián)合治療或替代治療方案之中[5]。核桃仁作為一種“藥食同源”膳食，以其通潤(rùn)血脈、補(bǔ)氣養(yǎng)血、延緩衰老等藥理功效，自古被人們稱為“長(zhǎng)壽果”[6-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核桃仁在降血壓、抗氧化、防止血栓、減少炎癥等方面具有較好的藥效[8-11]。本文在現(xiàn)有理論基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法探討核桃仁預(yù)防ASCVD作用機(jī)制，為后續(xù)探索與開發(fā)核桃仁的藥用價(jià)值研究提供新思路。

1 方法

1.1 核桃仁相關(guān)成分與靶點(diǎn)篩選

通過 TCMSP[12]（https://tcmsp-e.com/）數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)補(bǔ)充得到核桃仁中的物質(zhì)基礎(chǔ)，并通過數(shù)據(jù)庫中的“Pubchem Cid”超鏈接跳轉(zhuǎn)至PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中，以搜集得到的各化合物2D結(jié)構(gòu)信息。在Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)導(dǎo)入核桃仁的成分2D結(jié)構(gòu)文件，轉(zhuǎn)換成為供平臺(tái)識(shí)別的化合物結(jié)構(gòu)SMILE格式，平臺(tái)中物種選擇“Homo sapiens”，以置信度（Probability）≥0.5為篩選條件，獲得核桃仁成分的作用靶點(diǎn)。最后，在Uniprot（https://www.uniprot.org）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中將所有靶點(diǎn)的蛋白名稱統(tǒng)一為基因名稱。

1.2 ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)篩選

ASCVD包括多種疾病的發(fā)生，以與ASCVD主要的相關(guān)疾病“atherosclerosis”、“myocardial ischemia”、“stenocardia”、“myocardial infarction”、“cerebral ischemia”、“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫[13]（https://www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫[14]（http://www.omim.org）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫[15]（https://www.disgenet.org/home/）中疾病的潛在靶點(diǎn)，并取交集作為ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為詳悉核桃仁成分相關(guān)靶點(diǎn)與ASCVD靶點(diǎn)間的相互聯(lián)系，繪制二者取交集的韋恩圖，并將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫（https://stringpreview.org/），以“Homo sapiens”為生物種類設(shè)定，設(shè)定“mediumt confidence”（≥0.4）為置信值，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型文件。在CytoScape 3.7.1軟件中進(jìn)一步可視化網(wǎng)絡(luò)，得到交集蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)以MCODE插件挖掘得到PPI網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系更緊密的基因互作模塊。

1.4 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn)功能與通路富集分析

基于 Metascape平臺(tái)[16]（http://metascape.org/gp/index.html）分析交集靶點(diǎn)的功能及通路富集情況。將核桃仁預(yù)防ASCVD的靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)中，設(shè)置以P<0.01，分別對(duì)其主要的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能與代謝通路進(jìn)行富集分析，并用聯(lián)川生物云平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)可視化。

1.5 核桃仁成分-靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建和分析核桃仁成分-ASCVD靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。首先根據(jù)核桃仁與ASCVD交集靶點(diǎn)，剔除與交集靶點(diǎn)無關(guān)的核桃仁成分，再將核桃仁成分與交集靶點(diǎn)中對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)依次對(duì)應(yīng)導(dǎo)入 Cytoscape軟件中得到。軟件內(nèi)置工具“NetworkAnalyzer”可用于計(jì)算節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，涵蓋連接度（Degree）、中介度（BetweennessCentrality）以及緊密度（Closeness-Centrality）等多種網(wǎng)絡(luò)分析的度量指標(biāo)，并根據(jù)化合物和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷發(fā)揮核桃仁預(yù)防ASCVD藥效的主要活性成分。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

分子對(duì)接可預(yù)測(cè)核桃仁化合物成分與靶點(diǎn)蛋白受體之間的親和力，模擬出小分子與受體的相互作用狀態(tài)。通過分子對(duì)接進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中篩選得到的主要活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白，將得到的核心靶點(diǎn)蛋白和主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。靶點(diǎn)和成分3D結(jié)構(gòu)信息分別于PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）和 PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得。在 AutoDock v1.5.6[17]中導(dǎo)入靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)經(jīng)過去水、加氫、分配電荷等處理，并定義選擇出活性成分化合物的旋轉(zhuǎn)鍵。運(yùn)用Grid模塊設(shè)置蛋白原配體為對(duì)接盒子中心，利用Autodock_vina1.1.2分子模擬軟件進(jìn)行分子對(duì)接，最終使用Pymol繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 核桃仁成分的獲取與篩選

通過以“核桃仁”關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）查詢核桃仁藥物組成，若以常使用的口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18參數(shù)篩選，所得成分僅4種，于是通過核桃仁成分分離鑒定相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]進(jìn)一步補(bǔ)充，刪除重復(fù)值，共得到核桃仁活性成分34種（表1）

表1 核桃仁活性成分信息表Table 1 Information table of active ingredients of walnut kernel

2.2 核桃仁活性成分靶點(diǎn)與ASCVD靶點(diǎn)的獲取

通過在 Pubchem數(shù)據(jù)庫依次下載獲得的 34種活性成分的化合物2D結(jié)構(gòu)文件，上傳至Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)34種活性成分的靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)后留下核桃仁活性成分靶點(diǎn)有 891個(gè)。根據(jù)靶點(diǎn)的可信度，取Probability≥0.5的161個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行下一步分析。

根據(jù)“atherosclerosis”、“myocardial ischemia”、“stenocardia”、“myocardial infarction”、“cerebral ischemia”、“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞在 Genecards數(shù)據(jù)庫搜索得到7 255個(gè)ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)得分的2倍中位數(shù)作為ASCVD潛在目標(biāo)靶點(diǎn)的篩選條件，例如在GeneCards中得到疾病靶點(diǎn)Score值最大是76.01，最小值是0.09，2倍中位數(shù)為1.34，故設(shè)定Score>1.34的共1 879個(gè)靶點(diǎn)為疾病潛在靶點(diǎn)。同時(shí)在OMIM、DisGeNET、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫中搜索補(bǔ)充，將各數(shù)據(jù)庫所得靶點(diǎn)取交集得到1 941個(gè)ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將篩選的核桃仁活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，得到核桃仁成分-ASCVD共同靶點(diǎn)94個(gè)（圖1）。

圖1 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of walnut component targets-ASCVD-related targets

在STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置最小互相作用閾值≥0.4為置信條件，并將網(wǎng)絡(luò)文件上載到Cytoscape 3.7.1軟件中進(jìn)行可視化分析（圖2A）。根據(jù)度值進(jìn)行排序，前10位蛋白基因?yàn)?AKT1、SRC、EGFR、CCND1、ESR1、MMP9、KDR、MMP2、ERBB2、PPARG（圖2B），這些靶點(diǎn)按照 Degree值排序的對(duì)應(yīng)成分分別為槲皮素、楊梅素、鞣花酸、山萘酚、咖啡酸。

圖2 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（A）及核心靶點(diǎn)蛋白（B）Fig. 2 PPI network of walnut component targets-ASCVD targets (a) and core target proteins (b)

在CytoScape3.7.1軟件中使用CytoHubba插件，在 5種算法中選出得分最高 10個(gè)基因選為PPI分析中 ASCVD的關(guān)鍵基因，其中 EGFR、SRC、CCND1、MMP9、MMP2、ESR1、KDR、AKT1、ERBB2基因在五種分析中均出現(xiàn)，說明該9個(gè)基因可能在ASCVD涉及的相關(guān)疾病發(fā)生過程中起到重要的作用（表2）。

表2 CytoHubba核心靶點(diǎn)計(jì)算排名Table 2 Computational ranking of CytoHubba core targets

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能信息可以幫助我們深入理解PPI網(wǎng)絡(luò)的生物機(jī)制，有著高度連通區(qū)域的子網(wǎng)絡(luò)更有可能在生物調(diào)節(jié)過程中起到關(guān)鍵作用。故為更精確分析核桃仁作用ASCVD相關(guān)疾病的作用機(jī)制，通過MCODE插件分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到 5個(gè)子網(wǎng)絡(luò)（圖3），其中以顯著性最強(qiáng)的MCODE 1模塊生物學(xué)過程進(jìn)行功能描述。（表3）。

圖3 核桃仁-ASCVD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Key sub-networks in the PPI network of walnut-ASCVD targets

表3 核桃仁-ASCVD靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述Table 3 Functional description of PPI network of walnut-ASCVD targets

2.4 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD靶點(diǎn)功能與通路富集分析

應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)核桃仁作用ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，并分別對(duì)排名前10的結(jié)果作圖可視化。核桃仁主要富集的與疾病相關(guān)的生物學(xué)過程包括對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）、炎癥反應(yīng)的調(diào)控（regulation of inflammatory response）、循環(huán)系統(tǒng)過程（circulatory system process）、活性氧代謝過程（response to inorganic substance）；相關(guān)靶點(diǎn)主要參與與ASCVD密切相關(guān)的蛋白激酶活性（protein kinase activity）、醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor）、激酶活性（kinase activity）等功能（圖4B）；細(xì)胞成分分析表明，基因在轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)（transferase complex，transferring phosphoruscontaining groups）、蛋白激酶復(fù)合物（protein kinase complex）等顯著富集（圖4C）。

圖4 核桃仁延緩ASCVD作用潛在靶點(diǎn)的GO富集和通路富集分析Fig. 4 GO enrichment and pathway analysis of potential targets of walnut kernel for delaying ASCVD effect

交集靶點(diǎn)富集得到參與的通路主要有 PPAR信號(hào)通路（PPAR signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中 AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetics complication）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)（Regulation of lipolysis in adipocytes）等，說明核桃仁作用 ASCVSD可能與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)相關(guān)（圖4D）。

2.5 核桃仁成分靶點(diǎn)-ASCVD 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

選擇CytoScape3.7.1構(gòu)建核桃仁成分-ASCVD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖5）。在軟件內(nèi)置的 Network Analyzer插件中展開網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)自動(dòng)分析，得到核桃仁緩解疾病核心成分與靶點(diǎn)，其中按照度值排序得到前五成分為槲皮素（quercetin）、楊梅素（myricetin）、山萘酚（kaempferol）、鞣花酸（ellagic acid）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate），其中槲皮素、楊梅素、山萘酚、鞣花酸與之前PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分一致，說明這四個(gè)成分可能為核桃仁預(yù)防ASCVD的關(guān)鍵成分。

圖5 核桃仁成分-ASCVD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 5 Walnut kernel composition-ASCVD target-pathway network diagram

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

選取“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)以及CytoHubba中獲得共同的五個(gè)靶點(diǎn)ATK1、EGFR、SRC、CCND1、ERBB2作為核桃仁預(yù)防ASCVD的潛在作用靶點(diǎn)，與核心活性成分槲皮素、楊梅素、鞣花酸、山萘酚以及蛋白配體、一線降血脂藥物辛伐他汀進(jìn)行分子對(duì)接（表4）。通常情況下，將對(duì)接所獲得的結(jié)合能評(píng)分作為評(píng)判依據(jù)，數(shù)值越小說明配體和受體結(jié)合后二者越穩(wěn)定，越可能會(huì)產(chǎn)生相互作用。接著通過Pymol軟件可視化大分子靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與核桃仁小分子化合物空間上的對(duì)接結(jié)果。對(duì)接結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)靶點(diǎn)蛋白和小分子化合物的最低結(jié)合能小于或等于–7.0，說明化合物分子與受體結(jié)合能力較高[21]，其中SRC、ERBB2與活性成分結(jié)合能的絕對(duì)值均大于其他靶點(diǎn)蛋白與活性成分和一線降血脂藥物辛伐他汀結(jié)合能的絕對(duì)值，而SRC與活性成分結(jié)合能的絕對(duì)值高于蛋白配體，表明其具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。分子對(duì)接模式（圖6）中，SRC（A）與槲皮素共形成7個(gè)氫鍵。說明活性成分與靶蛋白具有較強(qiáng)的親和力，且結(jié)合體構(gòu)象穩(wěn)定。綜合分析，說明槲皮素、楊梅素、山萘酚、鞣花酸可能是核桃仁通過作用于 AKT1、EGFR、SRC、CCND1、ERBB2等靶點(diǎn)緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等病理環(huán)節(jié)預(yù)防ASCVD的關(guān)鍵成分。

表4 核桃仁活性成分與ASCVD潛在作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 4 Molecular docking results of active ingredients of walnut kernel with potential targets of ASCVD action

圖6 分子對(duì)接模式圖Fig. 6 Molecular docking pattern diagram

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的使用，對(duì)核桃仁預(yù)防ASCVD的作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。通過篩選得到核桃仁活性成分34個(gè)，靶點(diǎn)161個(gè)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 941個(gè)，取交集后得到核桃仁作用于疾病相關(guān)的潛在靶點(diǎn)94個(gè)，體現(xiàn)了核桃仁預(yù)防ASCVD是多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同作用的結(jié)果。

3.1 核桃仁分析

核桃仁入藥有著悠久歷史，最早可追溯至唐代，在《千金食治》《食療本草》中均有記載。核桃仁是一味補(bǔ)虛補(bǔ)陽的藥食同源中藥，在《本草綱目》中以“補(bǔ)氣養(yǎng)血，潤(rùn)燥化痰，益命門，利三焦”描述核桃仁。截至目前，我國已有40余種中成藥、80余種中藥處方以及100多種國產(chǎn)保健食品將核桃仁作為原料添加使用[22]。同時(shí)越來越多的證據(jù)表明，核桃仁納入飲食策略中將有益于對(duì)人體生理的保護(hù)[23]，通過攝入核桃可提高機(jī)體的抗氧化能力、減少血脂和LDL含量、防止膽固醇在血管中堆積、降低血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)等，最終起到有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[24]。

3.2 關(guān)鍵成分分析

核桃仁成分分析通過篩選得到核桃仁的有效成分有34個(gè)，其中有3種化合物的作用靶點(diǎn)數(shù)量≥20，分別為槲皮素（51個(gè)），楊梅素（45個(gè)），山萘酚（26個(gè)），鞣花酸（23個(gè)）。這些靶點(diǎn)很有可能是核桃仁預(yù)防ASCVD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。槲皮素、楊梅素、山萘酚屬于黃酮醇類物質(zhì)，該類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、舒張血管、和調(diào)節(jié)血脂等作用。槲皮素可通過抑制機(jī)體中的氧化酶，如還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶和黃嘌呤氧化酶，從而清除活性氧（ROS）來減輕氧化應(yīng)激損傷，有效降低炎癥因子的分泌達(dá)到發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用[25]。楊梅素能發(fā)揮抗炎和抗凝的活性，可防止脂多糖誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血[26]，借助SIRT1/NF-κB通路抑制的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[27]，以及阻斷氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少炎癥[28]。山萘酚能顯著抑制各類炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（NO）、白三烯（LT）以及前列腺素 E2（PGE2）引發(fā)的心血管炎癥反應(yīng)，還能減少細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等黏性蛋白水平、減輕脂質(zhì)過氧化、預(yù)防高膽固醇引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化[29]。鞣花酸主要以鞣質(zhì)這種復(fù)雜聚合物的形式存在。鞣花酸可以通過清除自由基，間接降低血液中的血膽固醇如甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）等物質(zhì)的含量，以及顯著降低促炎細(xì)胞因子并誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減少動(dòng)脈硬化性心血管疾病的發(fā)生[30]。

3.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

通過對(duì)核桃仁成分-ASCVD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)以及CytoHubba分析，按照度值排名前10的交集靶點(diǎn)可得 AKT1、EGFR、SRC、CCND1、ERBB2五個(gè)靶點(diǎn)蛋白。Akt1是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是一種多功能激酶，處于一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的中心，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，涉及細(xì)胞生長(zhǎng)，生存和代謝的調(diào)節(jié)，在血管生成、凋亡和調(diào)節(jié)心肌肥厚等過程中發(fā)揮重要作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Akt1基因會(huì)上調(diào)促炎基因的表達(dá)，引起炎癥介質(zhì)并減少eNOS磷酸化，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡，增加了主動(dòng)脈病變擴(kuò)展并促進(jìn)了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[32]。EGFR，也稱為表皮生長(zhǎng)因子受體，在巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中有廣泛的表達(dá)。動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成中 EGFR被磷酸化和激活，抑制EGFR可防止氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子和泡沫細(xì)胞的形成。并且巨噬細(xì)胞中EGFR的激活還涉及 toll樣受體 4，與腦外性損傷以及腦缺血有關(guān)[33]。SRC是具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)，關(guān)聯(lián)胞內(nèi)和胞外重要信號(hào)的傳遞，參與控制多種生物活動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄、免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期進(jìn)程等。實(shí)驗(yàn)證明，通過Akt/mTOR信號(hào)途徑抑制Src（Tyr416）磷酸化將缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減輕肺動(dòng)脈高壓[34]。細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）在細(xì)胞周期G1期調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵性功能，CCND1的表達(dá)上調(diào)將可誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖[35]。同時(shí)，CyclinD1還可以與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，如FOXO1，從而推動(dòng)Cyclin D1的表達(dá)，提高血管平滑肌的增殖和遷移[36]。ERBB2屬于受體型酪氨酸激酶中的表皮生長(zhǎng)因子受體家族，目前已有研究證明 ERBB2水平與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[37]，并且通過抑制 ERBB2蛋白可以減少ROS的產(chǎn)生，從而改善氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞內(nèi)皮功能障礙[38]。

此外，本研究通過對(duì)核桃仁PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，得出了其中顯著性較強(qiáng)的5個(gè)模塊，其中顯著性最強(qiáng)的模塊 MCODE 1中包含 Akt1、JAK、CCND1、SRC等靶點(diǎn)基因。這顯示核桃仁預(yù)防動(dòng)脈硬化性心血管疾病有可能是經(jīng)由控制細(xì)胞周期，影響細(xì)胞生長(zhǎng)而進(jìn)行的，這與目前臨床上用于治療心血管疾病的他汀類藥物通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖產(chǎn)生藥效有相似之處[39-40]。綜上所述，核桃仁可能通過調(diào)節(jié)上述基因靶點(diǎn)的表達(dá)，緩解由其引發(fā)的細(xì)胞增殖，從而達(dá)到預(yù)防ASCVD的目的。

3.4 通路結(jié)果分析

GO富集分析顯示，核桃仁緩解ASCVD主要通過對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)控等生物過程發(fā)揮作用。KEGG通路富集結(jié)果顯示，PPAR信號(hào)通路、粘附連接、血小板活化、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)是核桃仁緩解ASCVD的主要通路。ASCVD不單純是由脂質(zhì)在血管壁浸潤(rùn)堆積導(dǎo)致，而是機(jī)體內(nèi)血脂異常與炎癥反應(yīng)相互發(fā)生惡性循環(huán)的后果[41]。長(zhǎng)期處于高血漿血脂水平的情況下，脂蛋白侵入血管壁并堆積于血管中，內(nèi)膜中LDL被氧化修飾，驅(qū)動(dòng)炎癥因子的產(chǎn)生，而免疫反應(yīng)的發(fā)展將影響體內(nèi)脂質(zhì)的合成與降解，進(jìn)一步提高血脂、加速ASCVD。已有研究結(jié)果顯示，PPAR通路與慢性炎癥、糖尿病、肥胖、高血壓和高脂血癥等情況的出現(xiàn)密切相關(guān)，并且，PPAR是參與脂質(zhì)代謝和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[42]，這正好佐證了 GO富集分析結(jié)果中對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)控等生物過程。同時(shí)，核桃仁中槲皮素能通過PPAR信號(hào)通路，促進(jìn)脂質(zhì)分解，降低細(xì)胞中甘油三酯的含量[43]。楊梅素通過靶向PPAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑有效改善了肝脂肪變性[44]。山萘酚可通過抑制Akt從而激活PPARα和PPARδ發(fā)揮減少肝甘油三酸酯的積累功能[45]。鞣花酸通過激活PPAR信號(hào)通路對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的腸道炎癥產(chǎn)生保護(hù)作用[46]。

3.5 數(shù)據(jù)庫分析

文中采用 TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取核桃仁的有效成分。此數(shù)據(jù)庫擁有豐富的種類品類（499種）和化合物成分（29 384種）[12]，是一個(gè)經(jīng)典的中藥與有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，并且在2021年數(shù)據(jù)庫迎來了更新。該數(shù)據(jù)庫特別的價(jià)值在于，為研究人員提供了一系列各類中藥中化合物成分的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)（ADME）信息。ADME以及毒性（T）是決定藥物開發(fā)成敗中的重要因素[47]，因此初期將化合物的ADME信息納入考慮范圍之內(nèi)，有助于提高中藥單體藥物的開發(fā)成功率。在疾病的靶點(diǎn)獲取方面，本文選擇GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫作為獲得 ASCVD靶點(diǎn)的來源。GeneCards數(shù)據(jù)庫整合了包括NCBI、UCSC等125個(gè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)信息，能夠獲得大量與疾病有關(guān)的靶點(diǎn)基因[13]。同時(shí)通過主要針對(duì)疾病中可遺傳性疾病基因的 OMIM 數(shù)據(jù)庫[14]和整合了與人類疾病相關(guān)基因和突變信息的DisGeNET數(shù)據(jù)庫[15]的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充，確保準(zhǔn)確獲得ASCVD相關(guān)靶點(diǎn)。靶點(diǎn)的功能以及通路分析則借助 Metascape數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)平臺(tái)綜合了 GO、KEGG、STRING、UniProt和 DrugBank等40多方權(quán)威數(shù)據(jù)庫資源，并且該數(shù)據(jù)庫每月都將數(shù)據(jù)更新，確保使用 Metascape得到的數(shù)據(jù)可靠性[16]。

綜上所述，本文系統(tǒng)地分析了核桃仁緩解ASCVD的作用機(jī)制，揭示了核桃仁緩解ASCVD潛在的活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機(jī)制。但由于數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建時(shí)間以及更新維護(hù)頻率的局限性，仍會(huì)不可避免地存在數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)不完全、獲取的作用靶標(biāo)不精確等問題，尚不能完全反映整體情況，且預(yù)測(cè)出的很多新靶點(diǎn)也待進(jìn)一步研究。因此，為進(jìn)一步探討核桃仁發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，仍需后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。