劉力波，李志敏，周銀星，田志鵬

(河北常山生化藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050800)

肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，作為抗凝劑和抗血栓藥物廣泛應(yīng)用于臨床[1]。肝素可以從牛、豬、羊的腸黏膜和牛肺中提取[2]。目前，國(guó)際主流市場(chǎng)均使用豬肝素藥品，少數(shù)國(guó)家批準(zhǔn)了牛、羊肝素的使用。牛肝素曾是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局最先批準(zhǔn)上市的肝素藥品，但由于瘋牛病的出現(xiàn)，牛肝素退出主流市場(chǎng)[3]。近年來(lái)，瘋牛病已被有效控制，隨著全球?qū)Ω嗡匦枨蟮牟粩嘣鲩L(zhǎng)及穆斯林國(guó)家對(duì)牛肝素的強(qiáng)烈需求，牛肝素重返市場(chǎng)的呼聲不斷。

相較于豬肝素，牛肝素存在一定劣勢(shì)，如效價(jià)不到豬肝素的75%[2]，顏色更深。由于物質(zhì)的顏色主要是物質(zhì)對(duì)光選擇性吸收的結(jié)果[4]，肝素的顏色主要與肝素本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)和殘留的有色雜質(zhì)相關(guān)。另外，在放置過(guò)程中，肝素的顏色逐漸加深，這是由于，肝素中的氨基化合物和羰基化合物經(jīng)縮合、聚合發(fā)生美拉德反應(yīng)生成類黑精等褐色物質(zhì)[5]。因此，選擇合適的脫色工藝提升牛肝素產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要。鑒于此，作者將牛源粗品肝素經(jīng)脫蛋白處理后，分別采用雙氧水工藝、過(guò)氧乙酸工藝、高錳酸鉀工藝等3種氧化工藝精制牛肝素，探討不同氧化工藝對(duì)牛肝素脫色效果和結(jié)構(gòu)的影響，以期篩選出最佳的牛肝素脫色工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

牛源粗品肝素，Kin Master公司；綿羊血漿，東營(yíng)博豐生物科技有限公司。

肝素酶，北京艾德豪克國(guó)際技術(shù)有限公司；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品，歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM)和美國(guó)藥典(USP)；氘代水、氘代甲醇，Cambridge Isotope Laboratories，Inc.；雙氧水、高錳酸鉀、過(guò)氧乙酸、高氯酸鈉、氯化鈣、醋酸鈣、醋酸銨、氯化鈉、磷酸、磷酸鉀、氫氧化鈉、硼氫化鈉、鹽酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

JJ6000型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；AR2140型電子分析天平，美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；S10-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；HH-WO型智能數(shù)顯多功能油水浴鍋，鞏義予華儀器有限公司；FE28型pH計(jì)，METTLER TOLEDO；DZF-6210型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OS20-S型數(shù)顯頂置式電子攪拌器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；AVANCE Ⅲ HD 500MHz型核磁共振波譜儀，德國(guó)布魯克；UV-8000型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；E2695型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特斯；U3000型高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛。

1.2 脫蛋白處理

取適量牛源粗品肝素，按固液比1∶10(g∶mL，下同)加水溶解，加入溶液體積1%的氯化鈣，攪拌2 h，升溫至90 ℃保持30 min后，降至室溫；將溶液用陰離子樹脂進(jìn)行吸附，2%氯化鈉溶液洗滌，15%氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，用1 BV(1倍體積)乙醇醇沉，沉淀烘干，即得牛源脫蛋白肝素。

1.3 脫色處理

1.3.1 雙氧水工藝

取適量牛源脫蛋白肝素，按固液比1∶10加水溶解，加入3%的30%雙氧水溶液，調(diào)節(jié)pH值至9～10，反應(yīng)3 h，過(guò)濾；濾液中加入5%氯化鈉溶液，用3 BV乙醇醇沉，沉淀烘干，即得牛肝素精品。

1.3.2 過(guò)氧乙酸工藝

取適量牛源脫蛋白肝素，按固液比1∶10加水溶解，加入6%的15%過(guò)氧乙酸溶液，反應(yīng)3 h，過(guò)濾；后續(xù)操作同1.3.1。

1.3.3 高錳酸鉀工藝

取適量牛源脫蛋白肝素，按固液比1∶10加水溶解，調(diào)節(jié)pH值至9～10，升溫至80 ℃，加入溶液體積0.9%的高錳酸鉀，反應(yīng)3 h；冷卻至室溫，過(guò)濾；后續(xù)操作同1.3.1。

1.4 分析方法

1.4.1 脫色率的測(cè)定

將牛肝素精品的水溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在400 nm處有一個(gè)吸收峰，因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為400 nm。通過(guò)測(cè)定樣品脫色前后在400 nm處吸光度評(píng)價(jià)脫色效果，按式(1)計(jì)算脫色率：

(1)

1.4.2 效價(jià)及回收率的測(cè)定

采用羊血漿法測(cè)定效價(jià)及回收率。精密稱量供試品(m)0.1 g，置于100 mL容量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液溶解，定容即為供試溶液。吸取一定量的供試溶液置于25 mL容量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，使溶液濃度約為8 IU·mL-1。用進(jìn)樣器分別吸取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試稀釋液，取液量每支試管遞增10 μL，各5支試管，分別加入1.0 mL綿羊血漿、0.8 mL 0.25%氯化鈣溶液，蓋上玻璃塞，搖勻，于(37±1) ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，記錄開始保溫、中間保溫和結(jié)束保溫時(shí)的溫度，觀察各試管中血漿的凝結(jié)程度。根據(jù)凝固點(diǎn)按式(2)計(jì)算效價(jià)，按式(3)計(jì)算回收率。

(2)

(3)

1.4.3 雙糖的測(cè)定

取肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分別加入pH值7.0的磷酸鉀緩沖溶液，制成0.4 U·mL-1的肝素酶溶液；按體積比1∶1∶1混合，得到混合肝素酶溶液。取超純水20 μL，加入pH值7.0的醋酸鈣溶液70 μL和混合肝素酶溶液100 μL，混勻，于25 ℃下放置48 h以上，作為空白溶液。

取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試溶液適量，加入水，分別制成20 mg·mL-1的溶液；分別取20 μL上述溶液，加入pH 值7.0的醋酸鈣溶液70 μL和混合肝素酶溶液100 μL，混勻，于25 ℃下放置48 h以上，即得酶解后溶液。

取空白溶液、酶解后溶液各10 μL，采用SAX-HPLC法測(cè)定雙糖含量，以標(biāo)準(zhǔn)肝素雙糖確定峰位置。

1.4.413CNMR分析

稱取樣品0.20 g，加入0.2 mL氘代水和0.8 mL水，再加入0.05 mL氘代甲醇，混勻，放入直徑為5 mm的核磁管中。設(shè)定核磁共振波譜儀工作頻率為125 MHz、采集時(shí)間為0.55 s、溫度為40 ℃，采集13CNMR圖譜，采集結(jié)束進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氧化工藝的脫色效果

雙氧水工藝、過(guò)氧乙酸工藝、高錳酸鉀工藝的脫色率分別為92.0%、96.0%、95.9%，回收率分別為96.0%、91.3%、95.3%。

雙氧水的脫色原理是雙氧水在受熱或光照條件下快速分解，產(chǎn)生初生態(tài)氧[O]而破壞有色物質(zhì)[6]；雙氧水的氧化性較過(guò)氧乙酸、高錳酸鉀的弱，脫色率最低，對(duì)肝素結(jié)構(gòu)的破壞性也小，故回收率最高。過(guò)氧乙酸的脫色原理和雙氧水類似，但反應(yīng)更為劇烈，過(guò)氧乙酸分解可以釋放出[O]或過(guò)羥基自由基，可有效破壞發(fā)色基團(tuán)，從而破壞有色物質(zhì)，因此，過(guò)氧乙酸工藝的脫色率較高；但由于其對(duì)肝素結(jié)構(gòu)的破壞作用也強(qiáng)于另外兩種氧化劑，導(dǎo)致回收率最低。高錳酸鉀也是一種強(qiáng)氧化劑，通過(guò)氧化還原反應(yīng)，Mn(Ⅶ)可將發(fā)色基團(tuán)氧化，起到脫色作用；高錳酸鉀工藝的脫色率和回收率均高于95.0%，對(duì)牛肝素的脫色效果最好。

2.2 不同氧化工藝對(duì)牛肝素結(jié)構(gòu)的影響(表1)

由表1可知，經(jīng)雙氧水氧化后，牛肝素的雙糖分布與氧化前基本一致，說(shuō)明雙氧水對(duì)牛肝素結(jié)構(gòu)的影響較?。唤?jīng)過(guò)氧乙酸氧化后，ΔGlyser含量顯著降低，ΔGlyser ox1含量明顯升高，其它結(jié)構(gòu)雙糖含量與氧化前差異不大；經(jīng)高錳酸鉀氧化后，ΔGlyser含量顯著降低，ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2含量均有一定提高，ΔⅣSgal和ΔⅡSgal含量也有略微提高。這是由于，ΔGlyser存在于幾乎所有肝素粗品中的-GlcA β1-3 Gal β1-3 Gal β1-4 Xyl β1-0-Ser序列[7]，用于表征牛肝素連接域的絲氨酸，絲氨酸會(huì)誘發(fā)美拉德反應(yīng)，影響牛肝素的穩(wěn)定性，導(dǎo)致牛肝素顏色變深；ΔGlyser經(jīng)過(guò)氧乙酸氧化后形成ΔGlyser ox1結(jié)構(gòu)，經(jīng)高錳酸鉀氧化后形成ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2兩種結(jié)構(gòu)。ΔⅣSgal和ΔⅡSgal結(jié)構(gòu)源于-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-在堿性條件下2-O-脫硫[8]，高錳酸鉀反應(yīng)時(shí)的高溫加速了該反應(yīng)，導(dǎo)致ΔⅣSgal和ΔⅡSgal含量略微提高。

表1 不同氧化工藝精制的牛肝素的雙糖分布Tab.1 Disaccharide distribution of bovine heparin refined by different oxidation processes

ΔGlyser、ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2的結(jié)構(gòu)式見圖1。絲氨酸在13CNMR圖譜的δ57.4處(圖2)。

圖1 ΔGlyser、ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of ΔGlyser,ΔGlyser ox1,and ΔGlyser ox2

圖2 不同氧化工藝精制的牛肝素的13CNMR圖譜Fig.2 13CNMR spectra of bovine heparin refined by different oxidation processes

ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2兩種氧化結(jié)構(gòu)不會(huì)誘發(fā)美拉德反應(yīng)，可維持牛肝素的穩(wěn)定，延緩顏色變深。為了驗(yàn)證該觀點(diǎn)，將3種氧化工藝精制的牛肝素制成注射液，在(25±2) ℃、75%±5%濕度條件下進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)，記錄400 nm處吸光度(A400)的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 牛肝素注射液的顏色隨放置時(shí)間的變化Fig.3 Color change of bovine heparin injection with storage time

由圖3可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，3種牛肝素注射液的顏色均逐漸變深，但是雙氧水工藝精制的牛肝素注射液的顏色變深速度明顯快于其它兩種氧化工藝，過(guò)氧乙酸工藝精制的牛肝素注射液的顏色變深速度略快于高錳酸鉀工藝。說(shuō)明，將牛肝素的ΔGlyser結(jié)構(gòu)氧化為ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2結(jié)構(gòu)，可以延緩牛肝素顏色變深。

3 結(jié)論

將牛源粗品肝素經(jīng)脫蛋白處理后，分別采用雙氧水工藝、過(guò)氧乙酸工藝、高錳酸鉀工藝等3種氧化工藝精制牛肝素，研究了不同氧化工藝對(duì)牛肝素脫色效果和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，雙氧水工藝、過(guò)氧乙酸工藝、高錳酸鉀工藝的脫色率分別為92.0%、96.0%、95.9%，回收率分別為96.0%、91.3%、95.3%；經(jīng)雙氧水氧化后，牛肝素的雙糖結(jié)構(gòu)變化不大；經(jīng)過(guò)氧乙酸氧化后，ΔGlyser被氧化為ΔGlyser ox1；經(jīng)高錳酸鉀氧化后，ΔGlyser被氧化為ΔGlyser ox1和ΔGlyser ox2；將精制的牛肝素制成注射液后，雙氧水工藝牛肝素注射液的顏色變深速度最快，其次依次為過(guò)氧乙酸工藝、高錳酸鉀工藝。綜合評(píng)價(jià)，高錳酸鉀工藝為牛肝素的最佳脫色工藝。