范凱琪，孔令翯，鄧文慧，蓋恒軍，肖 盟

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

煤熱解過(guò)程中產(chǎn)生的大量有機(jī)污染物，如酚類(lèi)化合物、雜環(huán)類(lèi)化合物和多環(huán)芳烴等，具有較高的生物毒性，使得煤氣化廢水的可生化性較差，生化處理難度大[1]。因此，在進(jìn)行生化處理前，先對(duì)煤氣化廢水進(jìn)行“酚氨回收”等預(yù)處理工藝以去除大部分有機(jī)污染物，但生化系統(tǒng)仍存在運(yùn)行不穩(wěn)定的現(xiàn)象。酚類(lèi)化合物是生化進(jìn)水中的主要污染物及關(guān)鍵致毒物質(zhì)，包括苯酚、甲酚、乙基苯酚及萘酚等。其中萘酚在煤氣化廢水中廣泛存在，在自然界中可被微生物降解為1,2-二羥基萘、龍膽酸等小分子化合物。生物毒性分析表明，萘酚的半數(shù)有效濃度(EC50)值為2.59 mg·L-1，而苯酚的EC50值為359.97 mg·L-1[2]。因此，雖然萘酚在煤氣化廢水中含量相對(duì)較低，但其仍具有較高的生物毒性。

在廢水處理過(guò)程中，微生物菌群能夠根據(jù)進(jìn)水中污染物的不同發(fā)生相應(yīng)的變化，以維持穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)及性能。Yang等[3]研究了吲哚對(duì)含酚模擬廢水微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)苯酚可作為代謝基質(zhì)促進(jìn)吲哚的降解，其中Thermomonas、Pseudomonas、Comamonas、Dyella在苯酚和吲哚的代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Huang等[4]研究了焦化廢水中微生物與污染物的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Enterobacter、Pseudomonas和Sedimentibacter與苯酚的降解有關(guān)，而Pseudomonas、Sedimentibacter、Comamonas、Dysgonomonas則與萘酚的降解呈正相關(guān)性。目前，關(guān)于萘酚對(duì)煤氣化廢水微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，作者采用高通量測(cè)序技術(shù)研究萘酚對(duì)煤氣化廢水污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，并探討功能微生物的相對(duì)豐度變化及相關(guān)性，以進(jìn)一步闡釋煤氣化廢水中微生物對(duì)萘酚的響應(yīng)機(jī)制，為煤氣化廢水中萘酚的生物降解提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

污泥，取自?xún)?nèi)蒙古某煤化工企業(yè)污水生化處理厭氧段。

萘酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、苯酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉、NaCl，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5B-3F型COD測(cè)定儀，北京連華永興科技發(fā)展有限公司；島津2014C型氣相色譜儀，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；HZQ-C型空氣浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM，g·L-1)：K2HPO41.0，KH2PO41.0，CaCl20.01，NaNO30.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，MgSO40.5，NH4Cl 1.0；pH值7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

苯酚-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：配制一定濃度的苯酚儲(chǔ)備液，取適量加入到250 mL錐形瓶中，加入適量無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，使苯酚終濃度為250 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 污泥馴化

將苯酚-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入到500 mL螺口瓶中，污泥接種量MLSS為3 500 mg·L-1，總反應(yīng)體積為400 mL，用橡膠塞封口并通入適量空氣，置于35 ℃恒溫振蕩器中，對(duì)污泥進(jìn)行馴化，溶解氧(DO)在0.1～0.5 mg·L-1之間，水力停留時(shí)間為48 h。運(yùn)行30 d后，將適量萘酚加入進(jìn)水中，使其濃度控制在3 mg·L-1，作為萘酚組(簡(jiǎn)稱(chēng)N)；并以不添加萘酚作為對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)C)。每隔48 h參照HJ 828-2017《水質(zhì) 化學(xué)需氧量的測(cè)定 重鉻酸鹽法》測(cè)定進(jìn)、出水COD，并計(jì)算COD去除率。用乙酸乙酯萃取出水中的污染物，采用氣相色譜法測(cè)定出水中苯酚和萘酚的殘留量。

氣相色譜條件：以N2為載氣，檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣器溫度270 ℃；初始柱溫100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至230 ℃，終溫230 ℃保持1.5 min[5]。

1.4 菌群DNA的提取及測(cè)序

出水水質(zhì)運(yùn)行穩(wěn)定后，取適量污泥，用DNA提取試劑盒提取污泥總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用NanoDrop 2000檢測(cè)DNA的含量和純度。采用16S rDNA 通用引物擴(kuò)增細(xì)菌DNA的V3-V4區(qū)，正向引物341F為 5′-CCTACACGACGCTCTTCCG-ATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向引物805R為5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-ATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′[6]。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳回收、定量分析后，采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，每組樣品做4個(gè)平行，結(jié)果取平均值。測(cè)序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.5 高通量測(cè)序及分析

采用華大基因擴(kuò)增子分析平臺(tái)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。測(cè)序所得原始序列經(jīng)拼接和質(zhì)控后，對(duì)所得操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，OTU)進(jìn)行聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析，采用Wilcoxon Rank-Sum Test進(jìn)行alpha多樣性分析，使用QIIME軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)。在門(mén)、屬等水平繪制物種相對(duì)豐度柱狀圖，屬水平中物種相對(duì)豐度<0.5%和沒(méi)有注釋到的物種均合并為Others；在門(mén)水平進(jìn)行物種差異性分析，使用FDR(false discovery rate)評(píng)估差異的顯著性。選取相對(duì)豐度前10的物種進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。使用R(V3.4.1)和Cytoscape繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 萘酚對(duì)出水水質(zhì)的影響

進(jìn)、出水COD及COD去除率如圖1所示。

圖1 進(jìn)、出水COD(a)及COD去除率(b)Fig.1 COD of influent and effluent(a) and COD removal rate(b)

由圖1可知，對(duì)照組進(jìn)水COD約520 mg·L-1，出水COD約30 mg·L-1，COD去除率在90%以上，表明微生物對(duì)苯酚的降解效果較好。萘酚組進(jìn)水COD約560 mg·L-1，在初始運(yùn)行階段，出水COD平均值約75 mg·L-1，但隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，運(yùn)行30 d后出水COD維持在50 mg·L-1左右，COD去除率達(dá)90%左右。出水中未檢出苯酚和萘酚，表明經(jīng)生化處理后，苯酚和萘酚降解較為徹底。

2.2 萘酚對(duì)菌群多樣性的影響

菌群的alpha多樣性如圖2所示。

圖2 alpha多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis

由圖2可知，對(duì)照組和萘酚組的Chao1指數(shù)沒(méi)有顯著性差異(圖2a)，表明兩組菌群豐度較為接近。萘酚組的Shannon指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P=0.0287<0.05)(圖2b)，表明加入萘酚后菌群多樣性下降。PCoA分析(圖3)顯示，萘酚能夠顯著影響菌群的物種分布(PERMANOVA，P<0.05)。

圖3 主坐標(biāo)分析Fig.3 PCoA analysis

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

門(mén)水平物種的相對(duì)豐度如圖4所示。

圖4 門(mén)水平物種相對(duì)豐度柱狀圖Fig.4 Relative abundance histogram of major microbial species at phylum level

由圖4可知，對(duì)照組中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為48.0%和19.4%，其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、Ignavibacteria和鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)，相對(duì)豐度分別為5.1%、4.7%和4.2%。萘酚組中，Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Alphaproteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為31.3%、22.9%和20.1%，其次為Sphingobacteriia、Ignavibacteria和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)，相對(duì)豐度分別為5.0%、4.5%和3.1%。加入萘酚后，Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria仍是優(yōu)勢(shì)菌群，Betaproteobacteria的相對(duì)豐度降低了16.7%；Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度均顯著高于對(duì)照組，表明萘酚對(duì)Betaproteobacteria有一定的抑制作用，但對(duì)Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia和Deltaproteobacteria無(wú)抑制作用。

2.4 關(guān)鍵物種差異分析

屬水平物種的相對(duì)豐度如圖5所示。

圖5 屬水平物種相對(duì)豐度柱狀圖Fig.5 Relative abundance histogram of major microbial species at genus level

由圖5可知，對(duì)照組中，Thermomonas的相對(duì)豐度最高(11.3%)，其次為Alicycliphilus、Ignavibacterium、Zoogloea、Caldilinea和Georgfuchsia，相對(duì)豐度分別為6.7%、4.6%、2.7%、2.6%和2.1%，其中相對(duì)豐度<0.5%的物種約占總菌群的62.6%。萘酚組中，Azospirillum的相對(duì)豐度最高(17.7%)，其次為T(mén)hermomonas(12.4%)，此外，Alicycliphilus(7.4%)、Ignavibacterium(4.3%)、Georgfuchsia(2.4%)、Caldilinea(2.1%)的相對(duì)豐度也較高。

選取相對(duì)豐度前10的物種作為關(guān)鍵物種進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 關(guān)鍵物種相對(duì)豐度差異柱狀圖Fig.6 Relative abundance difference histogram of key species

由圖6可知，萘酚組中，Thermomonas、Alicycliphilus的相對(duì)豐度略有升高，但并不顯著(P>0.05)，表明這兩類(lèi)微生物受萘酚的影響較小。對(duì)照組和萘酚組中，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相對(duì)豐度均較高。其中，Thermomonas是一類(lèi)具有反硝化性能的芳香族化合物降解菌[3]；Alicycliphilus是一類(lèi)能夠利用氧、硝酸鹽、氯酸鹽作為最終電子受體，在好氧和缺氧條件下降解外源污染物的細(xì)菌，所涉及的外源污染物包括苯、甲苯、萘、蒽等單環(huán)和多環(huán)芳烴類(lèi)化合物及含氮雜環(huán)類(lèi)化合物[7]；Ignavibacterium是一類(lèi)異養(yǎng)發(fā)酵細(xì)菌，能夠在厭氧條件下降解酚類(lèi)化合物[8]；Caldilinea屬綠彎菌門(mén)，在厭氧消化系統(tǒng)中通常占有較高豐度，是一類(lèi)互養(yǎng)型細(xì)菌，對(duì)甲烷的產(chǎn)生具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用[9]。這4類(lèi)微生物在菌群結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度較穩(wěn)定，表明其能夠適應(yīng)不同酚類(lèi)污染物且能夠耐受萘酚的毒性，是降解苯酚和萘酚的主要物種。與對(duì)照組比較，萘酚組中Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明這3類(lèi)微生物具有降解萘酚的性能或與其它物種協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)萘酚的降解。其中，Azospirillum對(duì)酚類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的降解性能[10]，多見(jiàn)于根際微生物中，對(duì)苯甲酸鹽類(lèi)殺蟲(chóng)劑具有較高的耐受性[11]；Georgfuchsia屬β-變形菌綱，是一類(lèi)在嚴(yán)格厭氧條件下利用硝酸鹽、Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)作為電子受體降解單環(huán)芳烴的反硝化細(xì)菌[12]；Flavihumibacter在多環(huán)芳烴降解菌群的富集過(guò)程中常具有較高豐度[13-14]。與對(duì)照組比較，萘酚組中Zoogloea、Thauera和Parvibaculum的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，表明在萘酚作用下，其生長(zhǎng)代謝活性受到抑制。

物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)可以直觀展示物種間的相關(guān)性。其中，Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分別與Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相關(guān)性，表明這些微生物之間存在協(xié)同關(guān)系。Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae和Gemmatimonasaurantiaca均具有降解芳烴類(lèi)化合物的性能，萘酚經(jīng)降解后開(kāi)環(huán)可生成小分子化合物，這些小分子化合物可通過(guò)Ignavibacteriumalbum和Caldilineatarbellica的進(jìn)一步降解實(shí)現(xiàn)萘酚的去除。由此可見(jiàn)，加入萘酚后，部分降解多環(huán)芳烴及酚類(lèi)化合物的功能微生物的相對(duì)豐度升高，在菌群協(xié)同作用下可實(shí)現(xiàn)萘酚的有效去除。

圖7 關(guān)鍵物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation network diagram of key species

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了萘酚對(duì)煤氣化廢水污泥中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討了功能微生物的相對(duì)豐度變化及相關(guān)性。結(jié)果表明，加入萘酚后，出水COD升高，運(yùn)行30 d后，出水COD可穩(wěn)定在50 mg·L-1左右；菌群的多樣性降低，且菌群的物種分布顯著改變，其中Betaproteobacteria的相對(duì)豐度降低，Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria的相對(duì)豐度有所升高。關(guān)鍵物種差異性分析表明，加入萘酚后，Thermomonas、Alicycliphilus、Ignavibacterium和Caldilinea的相對(duì)豐度沒(méi)有顯著變化，但Azospirillum、Georgfuchsia、Flavihumibacter等具有酚類(lèi)、多環(huán)芳烴降解性能的微生物的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，且Thermomonashaemolytica、Flavihumibactersolisilvae、Gemmatimonasaurantiaca分別與Ignavibacteriumalbum、Caldilineatarbellica呈正相關(guān)性，推斷通過(guò)這些功能微生物的協(xié)同作用可降低出水COD，實(shí)現(xiàn)萘酚的有效去除。