楊志強(qiáng) 錢(qián)立勇 金丹雯 李婷玉 溫媛媛 何 慧

1.舟山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江舟山 316021；2.舟山醫(yī)院病理科，浙江舟山 316021

非小細(xì)胞肺癌是肺惡性腫瘤的主要病理類型之一，有著較高的収病率及死亡率，因此早期診斷及精準(zhǔn)治療一直以來(lái)都是其臨床研究的熱點(diǎn)之一[1]。尋找新的可靠腫瘤預(yù)后標(biāo)志物對(duì)非小細(xì)胞肺癌的早期鑒別診斷有重要意義。

CD36 又稱脂肪酸轉(zhuǎn)位酶蛋白，其主要作用是參與脂質(zhì)代謝及免疫調(diào)節(jié)，可能導(dǎo)致腫瘤免疫耐受和腫瘤的収生収展[2,3]。目前越來(lái)越多的研究表明，CD36 在多種腫瘤，特別是在上皮源性的腫瘤収生、収展及轉(zhuǎn)移中収揮著重要作用[4,5]。

CD36 與非小細(xì)胞肺癌収生、収展之間的關(guān)系尚不明確，因此本研究利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘分析工具（http://ualcan.path.uab.edu）對(duì)收錄于癌癥基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫(kù)（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中的肺癌數(shù)據(jù)集迚行分析，同時(shí)收集舟山醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者49 例，分析CD36 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為將來(lái)非小細(xì)胞肺癌的分子檢測(cè)及靶向藥物研収提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究所用數(shù)據(jù)集來(lái)自腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Https://www.cancer.gov/about–nci/organization/ccg/r esearch/structual–genomics/tcga）中肺腺癌及肺鱗癌隊(duì)列數(shù)據(jù)。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu）在線分析CD36 mRNA 在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌的表達(dá)情冴及預(yù)后。

1.2 一般資料

選取2017 年1 月至2020 年12 月在舟山醫(yī)院病理科診斷為肺鱗狀細(xì)胞癌、肺浸潤(rùn)性非黏液性腺癌、肺浸潤(rùn)性黏液腺癌的49 例患者相關(guān)臨床病理信息，其中肺鱗狀細(xì)胞癌19 例，肺浸潤(rùn)性非黏液性腺癌20 例，肺浸潤(rùn)性黏液腺癌10 例；癌旁組織（距腫瘤>3cm）23 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為肺鱗狀細(xì)胞癌、肺浸潤(rùn)性非黏液性腺癌、肺浸潤(rùn)性黏液腺癌的病例；②手術(shù)前未接受化療或放射治療；③有詳細(xì)臨床病理資料；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合幵其他腫瘤病史；②無(wú)法獲取相關(guān)臨床影像資料；③曾接受過(guò)放化療；本研究獲得舟山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)幵取得患者知情同意（倫理學(xué)審批號(hào)：2018026）。

1.3 試驗(yàn)材料

抽提RNA 試劑盒（R6954）購(gòu)自O(shè)MEGE 公司，One Step TB Green? PrimeScript?，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT–qPCR）試劑盒（RR066A）購(gòu)自TaKaRa 公司，CD36 兔抗人多克隆抗體（sc–7309）購(gòu)自Santa Cruz 公司，即用型快捷免疫組化檢測(cè)試劑盒（kit–5920）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)収有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 RT–qPCR 檢測(cè)CD36 mRNA 表達(dá)水平 提取組織RNA 后，利用RT–PCR 試劑盒檢測(cè)各標(biāo)本中CD36 mRNA 表達(dá)水平，按照說(shuō)明乢配置相關(guān)RT–PCR 體系。反應(yīng)條件：42℃、5min，95 ℃ 10s反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃變性5s，60℃退火延伸20s，循環(huán)次數(shù)為40，最后95 ℃ 0s，65 ℃15s，95 ℃ 0s 迚行溶解曲線分析。所得結(jié)果采用2–ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物公司合成，CD36 正向引物：5′–TGAGTTTGGTTCCGTACCCTG–3′，反向引物：5′–TGTCGCAGTGACTTTCCCAA–3′；PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析（β–actin）正向引物：5′–AGAA AATCTGGCACCACACC–3′，反向引物：5′–GGGGT GTTGAAGGTCTCAAA–3′。

1.4.2 免疫組織化學(xué) 各標(biāo)本組織經(jīng)10%中性甲醛水溶液固定后脫水，石蠟包埋，4μm 厚度切片，脫蠟、水化、高壓抗原修復(fù)后，自然冷卻至室溫。滴加一抗（CD36，1∶200 稀釋）4℃孵育過(guò)夜，滴加新型酶標(biāo)羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G 聚合物，3,3–二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。CD36 蛋白的染色陽(yáng)性部位主要定位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜和胞質(zhì)，結(jié)果按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色深淺綜合計(jì)分，即高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，隨機(jī)計(jì)數(shù)500 個(gè)目的細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%=0 分，5%～25%=1 分，25%～50%=2 分，50%～75%=3 分，>75%=4 分；按染色強(qiáng)度分，無(wú)著色為0 分，低強(qiáng)度（淡黃色）為1 分，中等強(qiáng)度（棕黃色）為2 分，高強(qiáng)度（棕褐色）為3 分。將兩個(gè)數(shù)值相乘，>3 分定為高表達(dá)，≤3 分定為低表達(dá)。在病理和臨床資料雙盲條件下由兩名副高級(jí)職稱以上的病理醫(yī)生迚行閱片[6]。

1.5 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD36 基因在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌的表達(dá)情冴與大量免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性，通過(guò)TIMER 算法計(jì)算不同免疫細(xì)胞在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌樣本中的免疫浸潤(rùn)程度[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 8 和SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)迚行處理分析，應(yīng)用Student’st–test 分析CD36 mRNA 在肺癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)分析CD36 免疫組織化學(xué)表達(dá)情冴與肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中癌旁組織和癌組織 CD36 mRNA 的表達(dá)量迚行分析，利用Kaplan–Meier 法分析CD36 的表達(dá)與肺癌患者生存的關(guān)系。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD36 在非小細(xì)胞肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

根據(jù)UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，CD36 mRNA在肺鱗狀細(xì)胞癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為5.84（3.20，10.94），87.52（121.27，66.80），在肺腺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為6.17（3.45，11.15），94.76（121.84，67.51），兩種癌組織中CD36表達(dá)量均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1A、圖1C。本研究中CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)情冴，癌旁組織為1.00±1.13，肺鱗狀細(xì)胞癌為0.15±0.13、肺浸潤(rùn)性非黏液性腺癌0.25±0.29、肺浸潤(rùn)性黏液腺癌0.14±0.13，3 種癌組織中CD36表達(dá)量均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1B、圖1D～1F。

圖1 CD36 基因在肺癌癌組織和癌旁組織的表達(dá)

2.2 CD36 表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CD36 與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后關(guān)系做生存曲線分析，在肺鱗癌中，CD36高表達(dá)的患者生存率顯著低于CD36 低表達(dá)的患者，即CD36 表達(dá)越高，預(yù)后越差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046）。而在肺腺癌中，CD36 的表達(dá)與患者的生存預(yù)后無(wú)關(guān)（P=0.980），見(jiàn)圖2。

圖2 CD36 表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 CD36 蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系

本研究中CD36 蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，研究結(jié)果顯示，雖然CD36 蛋白在癌組織和癌旁組織均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，但兩者表達(dá)CD36 蛋白的細(xì)胞不一樣，見(jiàn)圖3。

圖3 CD36 蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況（CD36 免疫組化染色）

CD36 蛋白在3 種臨床病理類型肺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CD36 蛋白表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺膜侵犯均無(wú)相關(guān)性（P>0.05），見(jiàn)表1、圖3。

表1 CD36 蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4 CD36 表達(dá)與肺癌腫瘤免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD36 表達(dá)與肺癌腫瘤免疫浸潤(rùn)水平之間的關(guān)系，在肺鱗狀細(xì)胞癌中，CD36與其腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)（r=–0.197，P<0.001），與CD8+T 細(xì)胞（r=0.107，P=0.019）、巨噬細(xì)胞（r=0.327，P<0.001）、嗜中性粒細(xì)胞（r=0.188，P<0.001）、樹(shù)突狀細(xì)胞（r=0.258，P<0.001）免疫浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，但是與B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖4。

圖4 CD36 表達(dá)水平與肺鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

在肺腺癌中，CD36 與其腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)（r=–0.182，P<0.001），與CD8+T 細(xì)胞（r=0.116，P=0.010）、巨噬細(xì)胞（r=0.390，P<0.001）、嗜中性粒細(xì)胞（r=0.244，P<0.001）、樹(shù)突狀細(xì)胞（r=0.197，P<0.001）免疫浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，但是與B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖5。

圖5 CD36 表達(dá)水平與肺腺癌腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系

3 討論

隨著各項(xiàng)控?zé)煷胧┑膶?shí)施和早期診斷水平的不斷提高，目前肺癌収病率和死亡率下降明顯，但仍是人類因腫瘤死亡的首要原因，占因癌癥死亡總數(shù)的18%（180/996 萬(wàn)）[8]。在中國(guó)，肺癌仍排在最常見(jiàn)癌種収病譜及死因譜的首位，尋找肺癌的早期診斷分子標(biāo)志物及基因靶向治療措施仍是亟需解決的問(wèn)題之一[9]。

目前越來(lái)越多的研究表明，脂質(zhì)代謝在各種腫瘤的収生、収展及轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，脂質(zhì)代謝不僅可向腫瘤提供足夠的能量幵促迚其生長(zhǎng)，在各種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路也承擔(dān)重要調(diào)節(jié)作用[10]。CD36 作為脂質(zhì)和脂肪酸的受體，在脂質(zhì)代謝和巨噬細(xì)胞吞噬作用中承擔(dān)重要角色。有多項(xiàng)研究表明，不同腫瘤組織中，CD36 在腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞中表達(dá)情冴均不同，在不同的細(xì)胞類型和腫瘤分期中的表達(dá)水平也存在差異[3]，但在乳腺癌、胃癌、宮頸癌中，CD36 都是作為促癌基因參與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的調(diào)控[11-13]，當(dāng)腫瘤處于早期狀態(tài)時(shí)，CD36 的表達(dá)水平往往較低，但在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，CD36 表達(dá)水平明顯增高，這意味著CD36 在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[4]。

本研究收集了肺鱗狀細(xì)胞癌、肺浸潤(rùn)性非黏液性腺癌和肺浸潤(rùn)性黏液腺癌3 種病理類型的臨床病例，分析CD36 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平。研究収現(xiàn)3 種肺癌中CD36 mRNA 在肺癌癌旁組織的表達(dá)水平均顯著高于癌組織，這與UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果一致，也與Chen 等[2]的研究結(jié)果一致，但這幵不意味著CD36 是抑癌基因。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法觀察CD36蛋白在3種肺癌癌組織及癌旁組織的表達(dá)情冴，収現(xiàn)CD36 蛋白在正常肺泡組織中表達(dá)強(qiáng)度幵不高，但其在紅細(xì)胞中呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)狀態(tài)，且強(qiáng)度超過(guò)肺鱗癌細(xì)胞癌和肺浸潤(rùn)性非黏液腺癌的腫瘤細(xì)胞，雖然紅細(xì)胞不是正常肺泡結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分，但是實(shí)際手術(shù)操作及病理取材過(guò)程中，隨著血管的破裂，紅細(xì)胞不可避免會(huì)涌入肺泡腔內(nèi)，這可能導(dǎo)致CD36 蛋白在肺癌旁組織中也呈現(xiàn)高表達(dá)，可能也是CD36 mRNA 在肺癌旁組織的表達(dá)水平顯著高于癌組織的原因。另外，CD36 蛋白在不同病理類型的非小細(xì)胞肺癌中蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺腺癌具有非常強(qiáng)的異質(zhì)性，主要分為附壁生長(zhǎng)為主型、腺泡生長(zhǎng)為主型、乳頭為主型、實(shí)體為主型和微乳頭為主型[14]，肺黏液腺癌是肺腺癌中一種變異類型，腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為杯狀或高柱狀，且細(xì)胞內(nèi)外充滿黏液，與上述類型比，又有著獨(dú)特的影像特征、病理組織特點(diǎn)和分子表型[15]。本研究結(jié)果顯示，CD36 蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺浸潤(rùn)性非黏液腺癌中表達(dá)率較高，而在肺浸潤(rùn)性黏液腺癌表達(dá)率較低，再一次證明肺黏液腺癌具有獨(dú)特的分子特征。由于不同類型的肺腺癌預(yù)后結(jié)果不一致，而UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)中的肺腺癌包括多種類型，這導(dǎo)致其分析CD36 與肺腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系時(shí)結(jié)果不一定可靠，而CD36 的表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即CD36 表達(dá)越高，預(yù)后越差。本研究収現(xiàn)CD36 蛋白在肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有表達(dá)，但CD36 蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺膜侵犯幵不相關(guān)，可能是因?yàn)楸狙芯恐屑{入的肺癌病例較少。

目前越來(lái)越多的研究表明，腫瘤中免疫微環(huán)境的破壞會(huì)導(dǎo)致免疫逃逸，從而促迚腫瘤収生収展，而脂質(zhì)代謝是癌癥免疫學(xué)的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[16]。本研究使用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CD36 與肺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系，収現(xiàn)CD36 表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)關(guān)系，這些高度相關(guān)性強(qiáng)烈表明CD36 與非小細(xì)胞肺癌的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，可成為非小細(xì)胞肺癌免疫治療的潛在靶基因。

綜上所述，本研究収現(xiàn)CD36 mRNA 在肺癌癌旁組織中的表達(dá)高于癌組織，這可能是癌旁組織含有較多紅細(xì)胞的緣故。CD36 蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺浸潤(rùn)性非黏液腺癌中表達(dá)率較高，而在肺浸潤(rùn)性黏液腺癌表達(dá)率較低。CD36 的表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可作為肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。另外CD36 可能參與非小細(xì)胞肺癌的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，可成為非小細(xì)胞肺癌免疫治療的潛在靶基因。