張阿鑫 陳 康 王偉峰 劉 紅,2 王煥嶺,2

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070;2. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗教學中心, 武漢 430070)

Fox(Forkhead box)蛋白家族是最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 其成員包含一個進化上高度保守的約100多個氨基酸組成的DNA結(jié)合結(jié)構域, 被稱為叉頭結(jié)構域(Forkhead domain, FH)[1,2]。迄今為止, 從原核生物到真核生物中均發(fā)現(xiàn)Fox成員的存在, 并將其分為19個亞類(A到S)[1]。其中FoxO是一個非常重要的亞家族, 在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)4個FoxO同源基因, FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6[3,6,7], 而在一些硬骨魚類中有7個成員, FoxO1a、FoxO1b、FoxO3a、FoxO3b、FoxO4、FoxO6a和FoxO6b[8],這些成員間具有較高的同源性。

FoxO的活性受磷酸化、乙?；头核鼗鹊恼{(diào)控, 而由于其具有高度保守的蘇氨酸和絲氨酸殘基的磷酸化位點, 因此磷酸化是FoxO的主要修飾方式[3,4]。FoxO的功能發(fā)揮主要受兩種進化保守的信號通路調(diào)控: 其一是經(jīng)典的胰島素信號通路, 即生長因子存在的情況下通過磷脂酰肌醇三激酶(Phosphatidylin-ositol-3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(Protein kinase B, PKB, 也叫AKT)調(diào)控; 其二是Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路, 在氧化應激時通過該通路起作用[5]。FoxO作為轉(zhuǎn)錄激活因子, 往往通過調(diào)控下游靶基因來發(fā)揮生物學功能, 在DNA損傷修復、氧化應激、細胞凋亡和自噬、細胞增殖與分化及細胞代謝等方面都發(fā)揮重要作用[3]。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)又名武昌魚, 為草食性淡水魚類, 常見于長江中游地區(qū)。自20世紀60年代以來, 團頭魴已被公認為中國淡水魚混養(yǎng)體系中主要的品種和最受歡迎的養(yǎng)殖品種之一[9—11], 并成為我國最重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一[12,13]。然而, 隨著養(yǎng)殖密度的增加, 水體富營養(yǎng)化進程的加重, 水生生態(tài)系統(tǒng)的氧氣需求量急劇增加[14]。另外, 全球氣候變暖的趨勢日漸嚴重也增加了魚類對氧氣的需求[15], 進而導致水體溶解氧的減少[16]。尤其是在淡水環(huán)境中, 每天水體的含氧量處于波動的狀態(tài)中[17], 因此低氧正成為水生生物生存壓迫下的普遍問題[18,19]。為了進一步了解魚類的低氧應激機制, 我們前期對團頭魴低氧脅迫后的生理生化、免疫應答和氧化應激及基因表達等的變化進行了研究[11,20—22], 同時, 也發(fā)現(xiàn)低氧會引起團頭魴foxO信號通路顯著富集[11]。然而,foxO是否參與團頭魴低氧應激, 其在不同組織和不同發(fā)育時期的分布等信息都是不清晰的。因此, 本研究基于組學及PCR鑒定了團頭魴foxO基因, 并對其時空分布及在低氧脅迫下的表達變化進行了分析。這些結(jié)果為進一步了解魚類foxO基因在低氧應答中的作用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 低氧處理實驗及樣品采集

本研究所用團頭魴來自湖北省百容水產(chǎn)良種有限公司, 將幼魚[體重(50±5) g]和成魚運回實驗室后在暫養(yǎng)池中正常飼喂, 2周后用于正式實驗。通過向水體中充入氮氣的方法對團頭魴幼魚進行低氧處理, 用保鮮薄膜封閉水槽上方, 使用便攜式溶解氧測定儀(JPB-607A)測定溶氧, 急性低氧(DO:1.0 mg/L, T: 25℃)處理0.5h后, 取肝臟、脾臟、肌肉、腦、心臟、鰓、腸、腎臟和血液9個組織, 每組3個重復, 每個重復3尾, 置于加有1 mL TRIzol的離心管中, –80℃保存, 用于總RNA的提取。以常氧[DO: (5.5±1.0) mg/L]作為對照。

用于時空表達分析的樣品取自常氧條件下團頭魴成魚(n=3)的肝臟、腦、腸、鰓、心、肌肉、血液、脾臟和腎臟9個組織, 以及不同發(fā)育時期的胚胎和仔稚魚, 取樣后立即放入液氮中速凍, –80℃保存, 用于總RNA的提取。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

利用TRIzol試劑提取團頭魴不同組織或不同發(fā)育時期胚胎的總RNA, 具體按照說明書進行。然后將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 具體為: 1 μg總RNA、5 μL oligo(dT)引物, 加RNase-free水至總體積15 μL, 在70℃孵化5min, 冰上放置2min。然后向混合物中加入1 μL RNA抑制劑、5 μL M-MLV緩沖液(5×)、2 μL dNTPs(10 mmol/L)、1 μL MMLV酶和1 μL RNase-free水, 42℃孵育60min。

1.3 基因的擴增

利用團頭魴基因組[25]和本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構建本地Blast數(shù)據(jù)庫, 用斑馬魚的foxO家族基因進行Blastn(E值設定為1×10–5)比對, 從而獲得團頭魴7個foxO基因的cDNA序列。以獲得的cDNA為模板設計引物通過PCR擴增驗證其ORF序列的準確性(引物序列見表 1)。引物的合成和測序由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成。

表1 實驗所需引物Tab. 1 Primers used in the experiment

1.4 序列分析

將cDNA序列與基因組序列進行比對, 并按GT-AG法則確定外顯子和內(nèi)含子的位置, 構建基因結(jié)構圖; 通過NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)預測開放閱讀框(Open reading frame, ORF)及相應的氨基酸序列; 使用ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)在線工具計算蛋白質(zhì)的等電點(pI)和相對分子質(zhì)量(Mw)等參數(shù); 利用DNAMAN(https://www.lynnon.com/)分析氨基酸序列的同源性; SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測FoxO蛋白的結(jié)構域;用MAGE 6.0軟件使用最大似然法構建FoxO蛋白的系統(tǒng)進化樹, 并對其進行1000次bootstrap檢驗。

1.5 熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qPCR)分析團頭魴foxO基因的表達(引物序列見表 1), 根據(jù)參考文獻[22—24]選擇ACTB為內(nèi)參基因。qPCR總反應體系為20 μL, 包含7.4 μL的超純水, 上、下游引物各0.8 μL, 1 μL cDNA模板, 10 μL SYBR Green mix reagent。采用三步法進行qPCR,具體如下: 預變性95℃ 5min, 接著40個循環(huán)包括95℃變性15s, 60℃退火30s及72℃延伸30s, 每個樣品3次重復。用2–??Ct方法計算目的基因相對于內(nèi)參基因ACTB的表達量。

1.6 載體構建

從團頭魴基因組中下載foxO1b基因的啟動子序列, 使用軟件Primer Premier 5設計引物(引物序列見表 1), 并以團頭魴肌肉組織的DNA為模板進行PCR擴增, 然后將獲得的序列經(jīng)雙酶切后定向連接到pGL3-basic載體中, 構建pGL3-foxO1b啟動子載體。同時為了驗證Hif-1α對foxO1b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控, 我們將團頭魴hif-1α基因的cDNA序列與pCMV-myc載體連接, 以構建hif-1α的過表達載體。

1.7 啟動子活性分析

Hela細胞生長于DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液, 置于37℃, 5% CO2培養(yǎng)箱中。將Hela細胞接種于24孔板, LipofectaminTM2000 轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pCMV-myc-Hif-1α或pCMV-myc, 熒光素酶報告基因載體pGL3-foxo1b或pGL3-basic, 內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK, 轉(zhuǎn)染24h后,根據(jù)Dual-LuciferaseCReporterAssay System說明書測定雙熒光素酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(mean±SD)來表示, 兩組數(shù)據(jù)分析使用獨立樣本t檢驗, 多組數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA), 兩兩比較采用Duncan檢驗, 以P=0.05作為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 團頭魴foxO家族的序列特征

基因的序列分析基于組學測序及PCR驗證, 獲得團頭魴foxO1a、foxO1b、foxO3a、foxO3b、foxO4、foxO6a和foxO6b基因序列(GenBank登錄號:MW752194-MW752200), 其編碼序列在1803—2157 bp, 編碼的氨基酸在600—718, 等電點(pI)和相對分子質(zhì)量分別為4.82—6.86和65.38—78.14 kD(表2)?？截悢?shù)分析發(fā)現(xiàn)團頭魴和斑馬魚(Danio rerio)基因組中,foxO1、foxO3和foxO6均有2個拷貝, 而在人類(Homo sapiens)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、雞(Gallus gallus)和蜥蜴(Anolis carolinensis)中每個基因都只有1個拷貝(表3)。

表2 團頭魴foxO家族基因的序列特征Tab. 2 Sequence characteristics of foxO genes in M. amblycephala

表3 脊椎動物中foxO基因拷貝數(shù)的比較Tab. 3 Comparison of copy numbers of foxO genes among selected vertebrate species

氨基酸序列的同源性比較及系統(tǒng)進化分析將團頭魴7個FoxO氨基酸序列與其他幾種脊椎動物的同源蛋白序列比對, 結(jié)果顯示, 團頭魴7個FoxO氨基酸序列與斑馬魚的同源性最高, 相似性在77.98%—92.51%?；谧畲笏迫环嫿ú煌锓N的FoxO氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹, 結(jié)果顯示各物種FoxO蛋白可以分為兩大分支, 即FoxO1和FoxO4為一大分支, FoxO3和FoxO6為另一大分支。另外,不同物種間每個FoxO成員各自聚成一支, 且團頭魴每個FoxO都與斑馬魚同源關系最近(圖1)。

圖1 FoxO家族基因的系統(tǒng)進化分析Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of FoxO genes帶三角形的為團頭魴FoxO蛋白, 每個蛋白后面附上GenBank序列號, 節(jié)點上的數(shù)值表示bootstrapThe FoxO genes of M. amblycephala were shown in black triangles. Each gene is followed by the GenBank number, the value on the nodes represent the bootstrap

2.2 團頭魴foxO基因的表達分析

foxO基因在不同組織中的表達為了探究foxO基因在團頭魴成魚各組織中的表達情況, 本研究利用qPCR檢測了foxO基因在肝、腦、腸、鰓、心、脾、腎、肌肉和血液9個組織中的表達變化(圖2), 團頭魴7個foxO基因在所檢測的9個組織中均有表達, 但在不同組織中的表達差異明顯, 其中,foxO4在血液中表達量最高,foxO6a在肝臟中表達量最高, 而foxO6b在腦組織中表達量最高。

圖2 團頭魴foxO在不同組織中的表達Fig. 2 Expression patterns of foxO genes in different tissues of M. amblycephala肝臟(L); 大腦(Br); 腸(I); 鰓(G); 心(H); 肌肉(M); 血液(Bl); 脾臟(S); 腎臟(K); 下同Liver (L); Brain (Br); Intestine (I); Gill (G); Heart (H); Muscle (M); Blood (Bl); Spleen (S); Kidney (K). The same applies below

foxO基因在不同發(fā)育時期中的表達如圖 3所示,foxO1a和foxO1b的表達模式類似, 即在早期發(fā)育過程中(48.4hpf除外)基因的表達呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 直到94.4hpf(體節(jié)生成期)達到最大, 隨后表達量降低, 并在10 dpf(受精后天數(shù), Days post-fertilization)升高。另外, 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)foxO4、foxO6a和foxO6b的表達模式也比較類似, 即在72.2hpf(眼色素沉淀晚期)、94.4hpf和10dpf表達量較高, 在其他時期的表達量都較低。foxO3a除在94.4hpf存在較高表達外, 在其他大部分時期的表達量都很低。foxO3b在發(fā)育早期的表達量逐漸升高, 直到15.4hpf(體節(jié)出現(xiàn)期)出現(xiàn)第一個峰值, 隨后逐漸下降, 但在72.2hpf表達量達到最高, 而后又呈逐漸降低的趨勢。整體來看,foxO基因在團頭魴早期發(fā)育過程中雖然呈現(xiàn)不同的表達模式, 但也存在一個共同的特點, 即這幾個基因在72.2hpf、94.4hpf和10dpf都有相對較高的表達量。

圖3 團頭魴foxO在不同發(fā)育時期的表達Fig. 3 Expression patterns of foxO genes at different developmental stages of M. amblycephala

低氧對foxO基因表達的影響為了進一步分析低氧對團頭魴7個foxO基因表達的影響, 本研究利用qPCR檢測了低氧處理后foxO在不同組織中的表達變化(圖4)。結(jié)果顯示低氧處理后, 7個foxO基因在各組織中的表達變化不同, 其中在肌肉、腸、鰓、腦及肝臟中呈顯著上調(diào)的趨勢, 尤其是在肌肉組織中, 而在腎臟、心臟及血液中呈顯著下降的趨勢。

圖4 低氧處理后團頭魴foxO基因在不同組織的表達變化Fig. 4 The relative expression of foxO genes in different tissues of M. amblycephala after hypoxia treatment“*”表示P<0.05, “**”表示P<0.01“*” represents P<0.05, “**” represents P<0.01

foxO基因的轉(zhuǎn)錄受Hif-1α調(diào)控為了進一步探究團頭魴7個foxO基因在低氧應激中的調(diào)控機制, 本研究在基于JASPAR2022網(wǎng)站對foxO基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子進行了分析, 發(fā)現(xiàn)7個foxO基因啟動子區(qū)域均含有多個Hif-1α結(jié)合位點(圖5A)。利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測了foxo1b啟動子活性。結(jié)果表明, Hif-1α過表達后, pGL3-foxo1b的熒光素活性顯著上調(diào), 說明Hif-1α可能通過與foxO1b基因啟動子結(jié)合影響其轉(zhuǎn)錄, 即foxO1b基因受到Hif-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖5B)。

圖5 foxO基因的轉(zhuǎn)錄受Hif-1α調(diào)控Fig. 5 The foxO gene transcription is regulated by Hif-1αA. foxO基因啟動子中Hif-1α結(jié)合位點; Hif-1α結(jié)合位點是ACGTG和GCGTG; B. Hif-1α過表達對foxO1b轉(zhuǎn)錄活性的影響; pCMVmyc作為對照A. Hif-1α binding sites of foxO gene promoters. Hif-1α binding sites are ACGTG and GCGTG; B. Effect of Hif-1α overexpression on foxO1b transcript activity. pCMV-myc is used as the control

3 討論

3.1 團頭魴foxO基因家族的序列分析

本研究基于團頭魴組學分析及PCR擴增共鑒定出7個foxO基因, 包括2個foxO1(foxO1a和foxO1b)、2個foxO3(foxO3a和foxO3b)、2個foxO6(foxO6a和foxO6b)及foxO4, 這與斑馬魚foxO鑒定的結(jié)果一致[26—29]。拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn), 在團頭魴和斑馬魚的基因組中,foxO1、foxO3和foxO6都存在兩個拷貝, 而在人類、牛、小鼠、雞和蜥蜴基因組中都只有一個拷貝, 這可能是由于硬骨魚類在進化過程中經(jīng)歷了一次特有的基因組加倍, 導致一個基因在魚類中可能存在多個同源基因[30—32]。SMART蛋白結(jié)構域分析顯示, 團頭魴7個FoxO蛋白都具有保守的Forkhead(FH)、FOXO_KIX_bdg和FOXO-TAD結(jié)構域,這是FoxO蛋白家族特有的結(jié)構域[27]。系統(tǒng)進化分析顯示FoxO家族的成員幾乎都被劃分為4個不同的進化分支, 其中團頭魴FoxO家族蛋白成員與魚類的同源基因進化關系最為緊密, 與其他哺乳動物和兩棲動物則相距較遠, 這符合傳統(tǒng)意義上的進化關系。

3.2 團頭魴foxO基因的時空表達分析

為了分析foxO在團頭魴不同組織及胚胎發(fā)育過程中的表達變化, 本研究通過qPCR檢測了團頭魴foxO家族基因的時空表達, 結(jié)果顯示foxO1a/foxO1b在團頭魴各個組織中均有表達。而草魚foxO1a/foxO1b在各組織中也均有表達, 但在心臟中的表達量最低[33], 與本研究結(jié)果存在一定差異, 這可能是由于物種或個體大小等的差異所導致的。研究表明FoxO1敲除的小鼠會由于胚胎血管生成障礙死于胚胎早期[34]。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)在36和48hpf時,foxO1a/1b在斑馬魚心臟中都持續(xù)表達[35]。團頭魴foxO1a/1b在成魚心臟和血液中的高表達, 在胚胎不同發(fā)育過程中呈現(xiàn)逐漸上升的表達趨勢, 說明團頭魴foxO1a/1b可能與心血管的形成有關。團頭魴foxO3a/foxO3b在每個組織都能被檢測到, 這與該基因在斑馬魚不同組織中的表達譜相似[36]。在胚胎發(fā)育過程中團頭魴foxO3a/foxO3b的表達主要集中在眼色素沉淀晚期(72.2hpf)和體節(jié)生成期(94.4hpf)?；赗T-PCR發(fā)現(xiàn)斑馬魚foxO3a在8hpf后表達量持續(xù)偏低, 而foxO3b在14hpf后表達量持續(xù)增加, 并其都參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及分化[34—36]。而foxO3a/3b在團頭魴和斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達趨勢不同, 其功能也尚不確定。團頭魴foxO6a主要表達在肝臟中,foxO6b主要在腦組織中表達, 而哺乳動物的FoxO6只在大腦和肝臟中表達[39], 說明魚類foxO6與哺乳動物相比出現(xiàn)了功能分化。另外我們也發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中, 團頭魴foxO6a和foxO6b基因在眼色素沉淀前的表達水平都比較低,而斑馬魚整胚原位雜交結(jié)果顯示,foxO6a和foxO6b基因在1hpf時均未表達, 但在5hpf均能檢測到表達,并逐漸增加, 在24—72hpf達最高[37], 說明團頭魴foxO6a和foxO6b基因在胚胎發(fā)育期間的功能和斑馬魚的類似, 并可能存在協(xié)同作用。

3.3 低氧對團頭魴 foxO基因家族表達的影響

研究發(fā)現(xiàn)低氧脅迫后果蠅FoxO轉(zhuǎn)錄活性被迅速誘導, 并且在低氧條件下foxO突變體的糖代謝紊亂, 個體存活率降低[40]。另外研究也證實低氧處理后FOXO3a作為HIF-1的下游靶點被激活[39]。斑馬魚中foxO3b的缺失, 可導致低氧耐受能力降低[41]。這些研究表明foxO可能參與低氧調(diào)控。為了研究低氧對魚類foxO表達的影響, 本研究通過qPCR分析了低氧處理后團頭魴不同組織中foxO的表達變化, 結(jié)果顯示7個foxO基因在許多組織尤其是肌肉中的表達量都顯著上調(diào)。基于啟動子分析顯示團頭魴這7個foxO基因啟動子序列中都存在Hif-1α的結(jié)合位點, 并且通過雙熒光素酶實驗顯示Hif-1α對foxO1b有調(diào)控作用, 推測foxO基因可通過Hif-1α介導的途徑參與魚類低氧調(diào)控。另有研究表明低氧脅迫會造成團頭魴和鰱的心肌細胞凋亡, 從而導致魚體心臟損傷甚至死亡[42,43]。Sirtl可能通過抑制Foxo1 mRNA表達, 延遲心肌細胞的細胞周期, 減少細胞凋亡[44]。而黃顙魚在低氧脅迫中會造成氧化應激損傷, 代謝模式由有氧呼吸至無氧呼吸轉(zhuǎn)變[45]。外源性胰島素能激活 AKT-FoxO1 磷酸化、上調(diào)FoxO1蛋白和轉(zhuǎn)錄水平, 進而提高糖酵解和降低糖異生水平來維持大口黑鱸的糖代謝穩(wěn)態(tài)[46]。而FoxO的低表達可促使細胞發(fā)揮抗氧化應激和保護的作用[47—50]。本研究發(fā)現(xiàn)foxO基因在心臟和血液中主要呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢, 推測其基因表達減少可能有助于減少細胞凋亡, 調(diào)節(jié)糖代謝, 增加了機體的抗氧化能力和心臟的供應能力。

本研究共鑒定出團頭魴7個foxO基因, 包括2個foxO1、2個foxO3、1個foxO4和2個foxO6, 并顯示了特異的時空表達模式。另外本研究也發(fā)現(xiàn)低氧引起團頭魴foxO基因在大部分組織中的上調(diào)表達,受Hif-1α調(diào)控, 說明foxO家族可能通過Hif-1α介導的途徑參與魚類低氧應激, 這為進一步研究魚類低氧的調(diào)控機制研究奠定一定的理論基礎。