陳 凱 方成池 吳志剛 熊 凡 俞 丹 崔永德 張 琪 王寶強(qiáng) 姜傳奇 宋立榮 王洪鑄 劉煥章 陳曉飛 凌海波 蔡俊雄 李 濤 何舜平 繆 煒 熊 杰 曾宏輝

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 湖北省生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院, 武漢 430072)

人類活動(dòng)和氣候變化造成了水生態(tài)系統(tǒng)受損、水生生物多樣性衰退、物種組成改變等負(fù)面影響[1—5]。開展全面、準(zhǔn)確的水生生物多樣性調(diào)查是建立水生態(tài)評(píng)估方法并開展生物多樣性保護(hù)的基礎(chǔ)[6]。重要的水生生物包括魚類、水生植物、底棲動(dòng)物、浮游動(dòng)物和浮游植物等[7—9]。當(dāng)前, 水生生物調(diào)查主要是通過形態(tài)鑒定這一手段。然而, 這一方法存在諸多缺陷, 包括成本高、耗時(shí)、對(duì)從業(yè)人員專業(yè)水平要求高及方法難以標(biāo)準(zhǔn)化等[10]。環(huán)境DNA(eDNA)技術(shù)的產(chǎn)生則彌補(bǔ)了上述形態(tài)鑒定方法的不足, 是一種生態(tài)和生物多樣性監(jiān)測(cè)的新手段, 也是當(dāng)前的前沿?zé)狳c(diǎn)技術(shù)[6,11—15]。eDNA技術(shù)通過采集水樣, 富集并提取DNA, 進(jìn)行建庫(kù)和高通量測(cè)序, 最后通過將測(cè)序序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)獲得物種注釋信息[15]。盡管eDNA技術(shù)在過去10來(lái)年中被廣泛應(yīng)用, 但是用于物種鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)各式各樣, 并存在分類標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、分類錯(cuò)誤和覆蓋度不高等問題[16], 這些問題直接影響了應(yīng)用eDNA技術(shù)調(diào)查水生生物多樣性的準(zhǔn)確性, 從而制約了eDNA技術(shù)的推廣, 因此亟待建立準(zhǔn)確的、綜合性的水生生物eDNA數(shù)據(jù)庫(kù)。

針對(duì)eDNA參考序列數(shù)據(jù)分散和整合度差, 且缺乏我國(guó)各類水環(huán)境水生生物eDNA參考序列庫(kù)的問題, 我們通過梳理公共數(shù)據(jù)庫(kù)中eDNA數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息、Meta信息和分類信息, 同時(shí)整合自有的大量水生生物eDNA參考序列, 設(shè)計(jì)了eDNA數(shù)據(jù)的收錄標(biāo)準(zhǔn)和存儲(chǔ)格式, 矯正了部分?jǐn)?shù)據(jù)的分類錯(cuò)誤,進(jìn)而構(gòu)建了水生生物eDNA數(shù)據(jù)庫(kù)——AeDNA(http://aedna.ihb.ac.cn/)。AeDNA是中國(guó)首個(gè)綜合性的水生生物eDNA數(shù)據(jù)庫(kù), 將大大促進(jìn)eDNA技術(shù)在水生生物調(diào)查領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

數(shù)據(jù)來(lái)源包括公共數(shù)據(jù)庫(kù)和AeDNA團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)的序列。公共數(shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、BOLD(http://www.boldsystems.org/)、SILVA(https://www.arb-silva.de/)和MitoFish(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/download.html)。Ae-DNA團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)的序列主要有各團(tuán)隊(duì)自行鑒定和測(cè)序的各類水生生物條形碼序列數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理包括分類信息矯正和數(shù)據(jù)格式標(biāo)準(zhǔn)化。AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)的分類信息以NCBI taxonomy為基礎(chǔ), 并輔以人工矯正。首先通過NCBI taxid構(gòu)建NCBI全部生物類群分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù), 分類系統(tǒng)以標(biāo)準(zhǔn)的界、門、綱、目、科、屬、種共7個(gè)分類層級(jí)進(jìn)行展示, 然后將收錄序列的物種名稱與物種庫(kù)進(jìn)行匹配, 繼而得到序列的標(biāo)準(zhǔn)分類信息。最后將計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)分類信息進(jìn)行人工校正。數(shù)據(jù)格式標(biāo)準(zhǔn)化包括制定標(biāo)準(zhǔn)Meta信息收集表, Meta信息(Meta-information)是指與序列相關(guān)的基礎(chǔ)信息, 包括序列名稱、分類信息、序列類型、采樣位置(經(jīng)緯度)、樣品采集地生境、數(shù)據(jù)來(lái)源信息和描述信息。標(biāo)準(zhǔn)化格式制定后采用自行編寫的腳本進(jìn)行統(tǒng)一匯編, 并且統(tǒng)一自動(dòng)化重命名。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

本數(shù)據(jù)庫(kù)基于CentOS 8系統(tǒng), React與TypeScript用于網(wǎng)頁(yè)前端頁(yè)面展示, Django用于網(wǎng)頁(yè)后端功能模塊開發(fā), Python用于文本操作和邏輯運(yùn)行, MongoDB用于數(shù)據(jù)管理。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)和功能呈現(xiàn)

AeDNA主體結(jié)構(gòu)包括6部分: 主頁(yè)、DNA條形碼、基因組、分析平臺(tái)、數(shù)據(jù)提交和關(guān)于我們(圖1)。數(shù)據(jù)資源包括收錄的序列、分類學(xué)數(shù)據(jù)、序列相關(guān)的Meta信息及將序列構(gòu)建成用于同源分析的索引。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)包括MongoDB和BLAST database, 其中MongoDB用于網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)展現(xiàn)和Meta信息存儲(chǔ); BLAST database用于存儲(chǔ)同源分析的索引序列。分析工具包括數(shù)據(jù)展示、數(shù)據(jù)提交和分析平臺(tái)。主要功能包括搜索功能、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)功能、分析功能和數(shù)據(jù)更新功能。

圖1 AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站構(gòu)架示意圖Fig. 1 Web interface and framework of AeDNA database

搜索功能用戶可以通過分類信息在AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)搜索數(shù)據(jù), 也可以結(jié)合通過分類信息、序列名稱、樣品采集地(國(guó)家/地區(qū))和生境進(jìn)行搜索。通過搜索用戶可以獲得目標(biāo)序列及與目標(biāo)序列有關(guān)的分類學(xué)信息和Meta統(tǒng)計(jì)信息。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)功能包括序列統(tǒng)計(jì)和Meta信息統(tǒng)計(jì)。序列統(tǒng)計(jì)呈現(xiàn)了各分類階元的條形碼或基因組數(shù)量; Meta信息統(tǒng)計(jì)呈現(xiàn)了各分類階元條形碼序列類型和與其相關(guān)的樣品分布數(shù)據(jù), 如分布國(guó)家統(tǒng)計(jì), 地理坐標(biāo)呈現(xiàn)。

分析功能數(shù)據(jù)庫(kù)支持用戶提交序列并通過BLAST程序搜索目標(biāo)序列在AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列, 進(jìn)一步基于搜索到的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)。BLAST默認(rèn)程序?yàn)锽LASTN, 默認(rèn)比對(duì)序列為DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的所有類群、所有序列, 默認(rèn)比對(duì)E值為0.1。用戶可以自行選擇比對(duì)程序、比對(duì)序列類型、比對(duì)E值和其他參數(shù)。系統(tǒng)發(fā)育分析中多序列比對(duì)工具為Muscle v5, 系統(tǒng)樹算法為TreeBeST, 可視化工具為MSAView。

數(shù)據(jù)更新功能數(shù)據(jù)庫(kù)提交分為單項(xiàng)提交和批量提交兩種不同的模式(圖1)。單項(xiàng)提交允許用戶將eDNA數(shù)據(jù)逐條提交到AeDNA, 批量提交允許用戶通過填寫標(biāo)準(zhǔn)信息收集表格提交序列。提交的序列需要經(jīng)過AeDNA后臺(tái)審核, 審核通過的序列匯入AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)并反饋給用戶, 審核不通過的序列提示用戶再次按照要求提交。

2.2 數(shù)據(jù)類型

AeDNA包含水生生物DNA條形碼和基因組數(shù)據(jù), 通過整合公共數(shù)據(jù)和AeDNA構(gòu)建團(tuán)隊(duì)測(cè)定的條形碼數(shù)據(jù)構(gòu)建而成。數(shù)據(jù)庫(kù)集成了60余萬(wàn)條序列, 其中數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)了6萬(wàn)余條, 以我國(guó)各類水體水生生物條形碼數(shù)據(jù)為特色。數(shù)據(jù)庫(kù)涉及的生物類型包括2萬(wàn)余種魚類、1萬(wàn)余種水生植物、1萬(wàn)余種底棲動(dòng)物、1萬(wàn)余種浮游動(dòng)物和1萬(wàn)余種浮游植物(圖2)。

圖2 AeDNA數(shù)據(jù)總覽Fig. 2 Landscape of the data of AeDNA

DNA條形碼DNA條形碼是物種特有、能穩(wěn)定遺傳、可以作為身份標(biāo)簽的一段DNA序列。每個(gè)物種具有多種條形碼序列, 本數(shù)據(jù)庫(kù)收錄多個(gè)物種多種條形碼序列, 包括18S、ITS、COI、12S、rbcL等38種條形碼數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)由AeDNA團(tuán)隊(duì)通過檢索公用數(shù)據(jù)庫(kù)、單一物種條形碼測(cè)序、eDNA多物種批量測(cè)序和挖掘基因組獲得的條形碼序列組成。DNA條形碼數(shù)據(jù)將為水生生物鑒定、多樣性調(diào)查、保護(hù)種/入侵種監(jiān)測(cè)及研究提供參考。

數(shù)據(jù)庫(kù)包含23418種魚類、11750種水生植物、8817種底棲動(dòng)物、10320種浮游動(dòng)物和8953種浮游植物(圖3A)?？傆?jì)592758條DNA條形碼序列,其中魚類376201條、水生植物103227條、底棲動(dòng)物11214條、浮游動(dòng)物67689條、浮游植物34427條(圖3B)。不同生物類群收錄的條形碼序列有較大差異, 其中魚類以線粒體基因?yàn)橹? 例如COI、12S等, 還有少量核糖體基因序列和基因組上其他基因序列(圖3C); 水生植物包含葉綠體和ITS序列(核糖體基因); (圖3D); 浮游動(dòng)物包含以COI為代表的線粒體序列和以18S為代表的核糖體序列(圖3E);除藍(lán)藻以外的浮游植物則包含rbcL為代表的葉綠體序列、COI為代表的線粒體序列和18S為代表的核糖體序列(圖3F)。我們發(fā)現(xiàn)高等動(dòng)植物DNA條形碼多采用進(jìn)化速率更快的線粒體基因、葉綠體基因和ITS序列, 而浮游動(dòng)植物除了上述基因外, 還采用更為保守的18S序列(真核藻類)或者16S序列(藍(lán)藻), 這與已有研究結(jié)果一致[17—19]。另外, 最新的研究表明以線粒體12S序列作為魚類鑒定的參考條形碼序列相較于COI等條形碼序列能鑒定更多的物種, 鑒定的結(jié)果更準(zhǔn)確[19]。本數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的12S序列5000余條, 后期還將持續(xù)進(jìn)行增量更新。

圖3 DNA條形碼數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Fig. 3 Statistics of DNA barcodesA. 數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄DNA條形碼的物種數(shù)量統(tǒng)計(jì); B. DNA條形碼數(shù)量統(tǒng)計(jì); C—F. 不同水生生物類群DNA條形碼類型統(tǒng)計(jì)[C、D、E、F和G分別代表魚類、水生植物、底棲動(dòng)物、浮游動(dòng)物和真核浮游植物(僅含真核藻類)]A. The number of species with DNA barcode in the database; B. Statistics of the number of DNA barcodes; C—F. Statistics of the types of DNA barcodes [C, D, E and F represent the DNA barcodes of the fish, plant, Zoobenthos, zooplankton and phytoplankton (only eukaryotic Algae, respectively)]

AeDNA構(gòu)建團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)了該數(shù)據(jù)庫(kù)中的6萬(wàn)余條DNA條形碼序列, 其中魚類序列5.7萬(wàn)余條, 水生植物序列500余條, 底棲動(dòng)物200余條, 浮游動(dòng)物和浮游植物序列1200余條; AeDNA團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)的條形碼數(shù)據(jù)具有完備的Meta信息, 除了條形碼類型信息外還包括樣品采集地點(diǎn)、生境類型、圖片、視頻等。從序列所在生境的分布圖可以看出這些序列主要來(lái)源于我國(guó)各類水體中水生生物, 具有鮮明的特色。樣品采集地除中國(guó)臺(tái)灣外的其他所有省份均有覆蓋(圖4), 以長(zhǎng)江流域和青藏高原為特色。內(nèi)蒙古自治區(qū)、中國(guó)臺(tái)灣和新疆維吾爾自治區(qū)等沒有分布或分布較少, 未來(lái)需要加大采樣力度, 使之覆蓋更廣、更全。

圖4 AeDNA團(tuán)隊(duì)貢獻(xiàn)的DNA條形碼序列地域分布圖Fig. 4 The distribution of DNA barcode sequences contributed by AeDNA team根據(jù)中華人民共和國(guó)自然資源部監(jiān)管的標(biāo)準(zhǔn)地圖編輯[審圖號(hào)為GS (2016) 1569]Edited based on a standard map supervised by the Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China [No. GS (2016) 1569]

基因組條形碼如上文所述, 每個(gè)物種具有多種條形碼序列, 不同類型的條形碼序列長(zhǎng)度不同,序列保守性不同, 鑒定精度和解析度不一致, 因此,研究人員針對(duì)各類群物種鑒定所用的條形碼不一致。例如, 過去COI序列是魚類鑒定的金標(biāo)準(zhǔn), 最近發(fā)現(xiàn)12S序列比COI鑒定精度高[19]; 用于大部分真核藻類鑒定的條形碼是18S、ITS、28S、tufA和rbcL等, 但甲藻和異鞭藻用COI, 輪藻則采用與很多高等植物類似的atpA/B、psbA/B等[18]; 藍(lán)藻(原核浮游植物)通常采用16S、ITS、rbcL和rpoC1等。原生動(dòng)物的鑒定通常用18S和COI[17]。因此, 采用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

基因組是指某一特定物種細(xì)胞內(nèi)的一整套遺傳物質(zhì), 是一個(gè)物種所有DNA序列信息的集合。基因組某種意義上說是一種 “超級(jí)條形碼”, 其鑒定精度和解析度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單獨(dú)使用某一個(gè)標(biāo)記基因。當(dāng)前, 大量細(xì)胞器基因組和物種基因組的產(chǎn)生,使得基因組的數(shù)目到達(dá)了一定的量級(jí), 因此, 利用基因組進(jìn)行物種鑒定也變?yōu)榭尚小?/p>

本數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組數(shù)據(jù)包含線粒體基因組、葉綠體基因組以及由“萬(wàn)種魚基因組計(jì)劃”[20]和“萬(wàn)種原生生物基因組計(jì)劃”[21]產(chǎn)出的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫(kù)共搜集了5872條細(xì)胞器基因組序列, 其中線粒體基因組共3377條, 魚類3118條, 水生植物18條, 浮游動(dòng)物49條, 浮游植物192條; 葉綠體基因組共2495條, 水生植物1568條, 浮游植物927條(圖5)。后期數(shù)據(jù)庫(kù)將大力整合基因組數(shù)據(jù), 尤其是旗艦物種和入侵物種基因組數(shù)據(jù), 同時(shí)結(jié)合基因組測(cè)序和通過大規(guī)模水環(huán)境樣品采集、測(cè)序, 從宏基因組數(shù)據(jù)挖掘環(huán)境基因組來(lái)補(bǔ)充未測(cè)定基因組的空白。此外, AeDNA進(jìn)一步將開發(fā)基于基因組水平進(jìn)行物種鑒定和生物多樣性研究的新方法、新標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)Fig. 5 Statistics of genomes in AeDNA database

3 展望

AeDNA為水生生物調(diào)查提供參考序列數(shù)據(jù)庫(kù),整合了現(xiàn)有DNA條形碼和基因組數(shù)據(jù), 將促進(jìn)eDNA技術(shù)在水生生物調(diào)查中的應(yīng)用。當(dāng)前, 數(shù)據(jù)庫(kù)為第一版, 未來(lái)將進(jìn)行持續(xù)的數(shù)據(jù)更新, 同時(shí)整合更多分析功能, 包括: (1)數(shù)據(jù)庫(kù)將新增兩棲動(dòng)物、藍(lán)藻等類群水生生物eDNA數(shù)據(jù), 將繼續(xù)收集、匯編國(guó)內(nèi)同行測(cè)定的水生生物條形碼數(shù)據(jù)和通過大規(guī)模采集樣品、測(cè)序來(lái)完善中國(guó)境內(nèi)條形碼數(shù)據(jù)庫(kù), 構(gòu)建更具綜合性的水生生物eDNA數(shù)據(jù)庫(kù)。樣品來(lái)源將涉及中國(guó)大部分水域, 將實(shí)現(xiàn)對(duì)國(guó)內(nèi)水生生物eDNA數(shù)據(jù)的全覆蓋。數(shù)據(jù)庫(kù)將收集水生生物圖片、視頻信息, 將展現(xiàn)序列、分類信息、影像和Meta信息等數(shù)據(jù)。(2)除了實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)增量更新的同時(shí), 本數(shù)據(jù)庫(kù)將著力于eDNA數(shù)據(jù)質(zhì)量的提升。包括: 基于NCBI分類學(xué)體系的分類系統(tǒng)矯正; 基于聚類分析去除冗余序列和錯(cuò)誤序列; 基于HMM模型對(duì)序列進(jìn)行修剪等。(3)數(shù)據(jù)庫(kù)已建設(shè)有序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能, 后續(xù)將新增: 多樣性分析功能, 如α和β多樣性等; 入侵種和保護(hù)種監(jiān)測(cè)功能; 各類水生態(tài)指標(biāo)分析功能和基于eDNA的水生生物評(píng)價(jià)功能。(4)數(shù)據(jù)庫(kù)將建立用戶管理系統(tǒng), 即用戶可以在AeDNA數(shù)據(jù)庫(kù)創(chuàng)建賬號(hào), 實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)人數(shù)據(jù)和分析任務(wù)的長(zhǎng)期管理。總體來(lái)說,AeDNA將由專業(yè)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行長(zhǎng)期維護(hù), 持續(xù)迭代, 旨在實(shí)現(xiàn)水生生物的調(diào)查、監(jiān)測(cè)、追溯和預(yù)警的綜合能力。

致謝:

AeDNA網(wǎng)站首頁(yè)視頻由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所熊雄博士和王浩驊提供素材并進(jìn)行剪輯。網(wǎng)頁(yè)中各類水生生物照片由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所谷思雨、繆榮麗、魏朝軍、王府臣、高欣欣、潘婷婷、王慧君、邴厚驊和王紅霞提供。中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所陳佳在網(wǎng)站網(wǎng)絡(luò)安全管理和維護(hù)方面提供了幫助。網(wǎng)站構(gòu)建得到了中國(guó)科學(xué)院超級(jí)計(jì)算環(huán)境武漢分中心的支持。