李建榮，王 偉，羅定國(guó)，馬曉霞，徐美玲，滾雙寶,2，楊巧麗

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬技術(shù)工程研究中心，甘肅蘭州 730070）

0 引言

合作豬是中國(guó)高原型地方豬種藏豬的一個(gè)類群[1]，因其主產(chǎn)于甘肅省甘南藏族自治州的合作市而得名。甘南藏族自治州地處甘肅省西南部，境內(nèi)多為高山丘陵，平均海拔3000 m以上，年平均氣溫1～9℃，最高氣溫27.7℃，最低氣溫-28.5℃，植被覆蓋率達(dá)70%～80%[2]。這種自然環(huán)境條件使得合作豬形成了極強(qiáng)的適應(yīng)高原氣候環(huán)境和耐粗飼特性[3]。高海拔低壓造成的缺氧是動(dòng)物對(duì)高原環(huán)境適應(yīng)的最大阻礙。有研究表明，中國(guó)特有高原型地方豬種藏豬已經(jīng)進(jìn)化出了適應(yīng)高原缺氧環(huán)境的生理特征和在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的低氧適應(yīng)策略，如肺泡間隔較厚、肺泡隔內(nèi)毛細(xì)血管豐富、心臟較大且心肺功能相對(duì)發(fā)達(dá)和血紅蛋白含量高等[4-5]，其高海拔低氧適應(yīng)能力明顯優(yōu)于其他豬種。開(kāi)展藏豬低氧遺傳適應(yīng)性研究，對(duì)其種質(zhì)資源的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用以及防止人類低氧損傷和促進(jìn)低氧適應(yīng)的醫(yī)學(xué)措施具有重要的意義。

高原動(dòng)物低氧適應(yīng)能力很大程度上取決于機(jī)體對(duì)氧的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的特殊功能，肌紅蛋白(myoglobin,Mb)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、細(xì)胞代謝相關(guān)酶等細(xì)胞因子及蛋白的調(diào)控是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究表明，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達(dá)與藏豬的低氧適應(yīng)性有關(guān)[6-7]。這些研究對(duì)探討藏豬低氧適應(yīng)性形成的遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

血紅素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HMOX1)是血紅素分解代謝過(guò)程中的一種應(yīng)激型誘導(dǎo)酶，能夠催化血紅素分解生成游離鐵、一氧化碳和膽綠素[8]，其本身及代謝產(chǎn)物可通過(guò)血管緊張度、抗氧化損傷和弱化低氧脅迫對(duì)細(xì)胞損傷等方式參與細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過(guò)程[9-11]。目前有關(guān)HMOX1基因在動(dòng)物高海拔低氧適應(yīng)方面的研究相對(duì)較少。何建文等[12]研究發(fā)現(xiàn)，藏綿羊HMOX1基因表達(dá)及其多態(tài)性與低氧適應(yīng)性存在關(guān)聯(lián)。李艷麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)HMOX1基因可通過(guò)抗細(xì)胞凋亡在斑馬魚(yú)低氧應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HO1在牦牛肺組織代謝中發(fā)揮重要功能，其基因的分子特征具有適應(yīng)高海拔生境的潛力。在豬上，目前僅見(jiàn)王偉等[15]對(duì)合作豬HMOX1基因做了克隆和蛋白功能預(yù)測(cè)分析，但合作豬HMOX1基因功能和不同組織中的表達(dá)模式尚不清楚。

因此，本研究旨在構(gòu)建pcDNA3.1-HMOX1過(guò)表達(dá)載體，并分析HMOX1基因在合作豬不同組織中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究HMOX1基因功能和探討合作豬低氧適應(yīng)性中的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

在甘南藏族自治州合作市選取3頭12月齡，體重接近的成年合作藏豬，屠宰后迅速采集心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸和背最長(zhǎng)肌等組織樣品，液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。試驗(yàn)于2021年3—5月份在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物遺傳與營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑

TransZol Up試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、2×Taq PCR Master Mix PCR擴(kuò)增酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；pMD?19-T載體、限制性內(nèi)切酶QuickCut? Nhe I和QuickCut?Xho I、T4 DNA Ligase、DNA Marker均購(gòu)自 TaKaRa（大連）有限公司；pcDNA3.1(+)載體購(gòu)自Promega公司；熒光定量試劑盒SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit和反轉(zhuǎn)錄試劑盒Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；瓊脂粉、氨芐青霉素、X-Gal、IPTG均購(gòu)自Solarbio公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司。引物合成和測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank中豬HMOX1基因序列(NM_001004027.1)，應(yīng)用Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)HMOX1基因CDS區(qū)特異性擴(kuò)增引物，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度924 bp。引物送蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 HMOX1基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物

1.4 總RNA提取和cDNA合成

采用TransZol Up試劑盒提取合作豬各組織的總RNA。提取的總RNA濃度和純度檢測(cè)合格后，稀釋至500 ng/μL，-80℃保存。

按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，第一步去除基因組DNA，反應(yīng)體系：5×gDNA Clean Buffer 2 μL，gDNA Clean Reagent 1μL，總 RNase Free water 5 μL，各組織的RNA 2 μL，混勻后42℃反應(yīng)2 min。第二步反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：第一步反應(yīng)混合液10 μL，5×RTase Reaction Buffer Mix I 1 μL，Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL，RNase Free water補(bǔ)足至 20 μL，混勻后37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，4℃保存。

1.5 載體構(gòu)建

采用普通PCR擴(kuò)增合作豬HMOX1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列，反應(yīng)總體系20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板 2 μL，上、下游引物各 1 μL，RNase free water補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的條帶切膠后將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并連接到pMD19-T載體進(jìn)行測(cè)序，將成功連接的陽(yáng)性克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。然后用限制性內(nèi)切酶QuickCut? Nhe I和 QuickCut? Xho I對(duì) pcDNA3.1 空載體和T載體陽(yáng)性質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，將酶切回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接。將連接好的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、單克隆篩選、菌液PCR檢測(cè)、質(zhì)粒DNA提取，并對(duì)提取好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為：pcDNA3.1-HMOX1。

1.6 組織表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMOX1基因在合作豬心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸和背最長(zhǎng)肌8個(gè)組織中的mRNA表達(dá)量，引物信息見(jiàn)表2，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。應(yīng)用LightCycler480 Ⅱ System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板(100 ng/μL)2 μL，2×SYBR?Green Pro Taq HS Premix 10 μL，加水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性5 s，95℃預(yù)變性30 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織做3個(gè)樣品重復(fù)，每個(gè)樣品同批次做3個(gè)復(fù)孔，以 2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR引物信息

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究結(jié)果用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本T-test，多組比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算法。

2 結(jié)果與分析

2.1 合作豬HMOX1基因CDS區(qū)擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增方法獲得了HMOX1基因完整CDS區(qū)，如圖1所示，目的條帶清晰、單一，與預(yù)期擴(kuò)增大小924 bp相符，說(shuō)明本試驗(yàn)成功克隆出了合作豬HMOX1基因。

圖1 合作豬HMOX1基因克隆

2.2 合作豬HMOX1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建

首先將HMOX1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化，然后將產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，挑取的陽(yáng)性克隆菌落菌液PCR初步檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2A；對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，通過(guò)雙酶切和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物已連接到T載體（圖2B）。隨后，將陽(yáng)性克隆T載體質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空載體分別進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，隨后經(jīng)轉(zhuǎn)化、單克隆篩選、雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2C，酶切產(chǎn)物兩條帶分別與空載體和目的條帶大小相符，說(shuō)明本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HMOX1過(guò)表達(dá)載體。

圖2 合作豬HMOX1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建

2.3 合作豬HMOX1基因組織表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMOX1基因在合作豬心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸和背最長(zhǎng)肌8個(gè)組織中的表達(dá)水平，由圖3可見(jiàn)，HMOX1基因的表達(dá)量在合作豬脾臟組織中最高，其表達(dá)量顯著高于其它組織(P<0.05)；其次表達(dá)量從高到低依次為肝臟、肺臟、腎臟、心臟、胃和背最長(zhǎng)?。辉谑改c中的表達(dá)量最低，顯著低于其它組織(P<0.05)。

圖3 合作豬HMOX1基因組織表達(dá)分析

3 討論

3.1 合作豬HMOX1基因組織表達(dá)分析

HMOX1是一個(gè)應(yīng)激誘導(dǎo)型基因，其在機(jī)體低氧、氧化應(yīng)激等條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)調(diào)控抗氧化反應(yīng)元件的相關(guān)基因和酶的表達(dá)保護(hù)細(xì)胞損傷[16.-17]。HMOX1可通過(guò)穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α保護(hù)缺血介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[18]；此外，HMOX1也可作為Nrf2的下游氧化應(yīng)激相關(guān)基因，參與氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的保護(hù)[19]。付書(shū)林等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的仔豬血管內(nèi)皮細(xì)胞中，黃芩苷可以顯著影響HMOX1、CYP1A1和CCL5等基因的表達(dá)，從而抑制Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)等通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。這些研究說(shuō)明，HMOX1在機(jī)體抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)和低氧耐受的分子機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

諸多研究表明，HMOX1主要表達(dá)于肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等器官。本研究中HMOX1基因在合作豬不同組織中的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在脾臟中的表達(dá)量最高，其次是肝臟、肺臟和腎臟。陶文庭[21]等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)HMOX1基因在斑馬魚(yú)多個(gè)組織中均有表達(dá)，且在肝臟、脾、腎中的表達(dá)量較高，在皮膚和肌肉中表達(dá)量較低。何建文等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HMOX1基因在藏綿羊脾臟組織中的表達(dá)量最高，且其表達(dá)量與血紅蛋白含量呈正相關(guān)，其次是肝臟和腎臟組織表達(dá)量較高，而HMOX1基因表達(dá)水平最高的是在湖羊皮下肺臟和脂肪中。說(shuō)明HMOX1基因在高原動(dòng)物不同組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致，均在脾臟表達(dá)最高，與本文研究結(jié)果基本一致

HMOX1屬于一種誘導(dǎo)型反應(yīng)蛋白，生理情況下，HMOX1在脾臟以外的組織中呈低表達(dá)，在重金屬離子、過(guò)氧化氫、低氧、內(nèi)毒素、一氧化氮及其底物血紅素的誘導(dǎo)下其表達(dá)均可上調(diào)[22]。在缺氧狀態(tài)誘導(dǎo)下，HMOX1在不同種屬和不同類型組織細(xì)胞中的表達(dá)存在差異[9]。肝臟和脾臟是機(jī)體貯藏血液的器官，當(dāng)機(jī)體處于失血和缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，其將血液排送到血液循環(huán)中，以調(diào)節(jié)血容量。在大鼠和斑馬魚(yú)上也有報(bào)道，HMOX1基因在脾臟和肝臟中的表達(dá)最高[13,23]。劉燕等[24]對(duì)合作豬血液生理生化指標(biāo)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，生活在高海拔低氧環(huán)境下合作豬的紅細(xì)胞和血紅蛋白含量顯著高于低海拔地區(qū)的巴馬香豬。對(duì)高原土著動(dòng)物而言，血液中的紅細(xì)胞和血紅蛋白含量越高，攜帶運(yùn)輸氧氣的能力越強(qiáng)，有利于更好地適應(yīng)高原低氧環(huán)境。劉秀[25]等在HMOX1基因Exon3區(qū)檢測(cè)到c.3650+30C>T、c.3650+41T>C、c.3750-14 G>A 和 c.3650+30G>A 4個(gè)SNPs，該區(qū)域多態(tài)性將影響藏綿羊HGB、HCT、SO2和PCO2等血液指標(biāo)的變化，其中c.3650+30G>A位點(diǎn)有增加HGB、HCT和SO2值的趨勢(shì)，可以使藏綿羊更好的適應(yīng)低氧環(huán)境。說(shuō)明合作豬在長(zhǎng)期處于高原低氧狀態(tài)環(huán)境下，HMOX1基因通過(guò)不同方式影響脾臟、肝臟、肺臟和腎臟等組織器官，加速血紅素的代謝，提高氧氣輸送效率，使機(jī)體在低氧條件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)高原低氧環(huán)境遺傳適應(yīng)。

3.2 合作豬HMOX1基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)于基因功能的研究，通常在細(xì)胞水平進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)處理。陳敬林[22]等經(jīng)研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HMOX1重組質(zhì)粒，并在DH5α大腸桿菌中表達(dá)，從電泳及測(cè)序比對(duì)兩方面進(jìn)行驗(yàn)證，從而保證目的基因的正確性，為后續(xù)進(jìn)一步研究HMOX1的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。目前多數(shù)研究認(rèn)為，HMOX1基因在體內(nèi)是保護(hù)因子的一種，在抗炎、抗氧化應(yīng)激以及免疫調(diào)節(jié)方面起到至關(guān)重要作用。但是有關(guān)合作豬低氧脅迫下的適應(yīng)性分子機(jī)制的研究少見(jiàn)報(bào)道。王逸群[26]等成功克隆了山羊NR1D1基因的CDS區(qū)并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞后，驗(yàn)證了NR1D1在mRNA和蛋白水平的過(guò)表達(dá)?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本研究成功克隆出了合作豬HMOX1基因CDS全長(zhǎng)序列，并將其插入到pcDNA3.1(+)過(guò)表達(dá)載體，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HMOX1過(guò)表達(dá)載體，這將對(duì)進(jìn)一步在細(xì)胞水平探究HMOX1基因功能提供試驗(yàn)保證，為揭示合作豬低氧適應(yīng)中的分子作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了合作豬HMOX1基因CDS區(qū)序列，并成功構(gòu)建pcDNA3.1-HMOX1過(guò)表達(dá)載體。HMOX1基因在合作豬脾臟組織中的表達(dá)量最高，其次表達(dá)量從高到低依次為肝臟、肺臟、腎臟、心臟、胃和背最長(zhǎng)肌，在十二指腸中的表達(dá)量最低。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究HMOX1基因功能提供參考，為揭示合作豬適應(yīng)高海拔低氧環(huán)境的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。